ガレクチン-3 - ビーズ上のU1 snRNP複合体によるスプライシング活性の相補

本報告は、ガレクチン-3 U1 snRNP複合体がpre mRNA基質に結合し、機能的な複合体を形成し、スプライシング反応の生成物につながるという文書化の実験的証拠を提供するものである。このプロトコールは、抗gal3抗体と共有結合したビーズ上に免疫選択されたガレクチン-3 U1 snRNPを利用してスプライシング反応を開始し、スプライシング反応を完了まで進行させることができます。プロトコールの重要なステップは、ガレクチン-3 U1 snRNP複合体を含むビーズをペレット化した後、液体を慎重に除去し、スプライシング反応を開始するためにすぐに使用することです。

核抽出物からU1 snRNPを枯渇させるには、200マイクロリットルの核抽出物と100マイクロリットルの抗U1ビーズをインキュベートします。混合物に5マイクロリットルのRNAを加え、マイクロチューブを摂氏4度で1時間回転させます。遠心分離により混合物をペレット化し、ハミルトンシリンジを使用して未結合材料を回収します。

U1 枯渇核抽出物の全量と、元の非枯渇核抽出物の別の 50 マイクロリットルアリコートをマイクロダイアライザーの別々のコンパートメントで透析し、摂氏 4 度で 60% バッファー D に対して 75 分間攪拌します。分子量が8Kカットオフされた透析メンブレンを使用してください。透析直後は、製剤を20マイクロリットルのアリコートに分け、ドライアイスエタノール浴でスナップ冷凍し、マイナス80°Cで保存します。

使用直前に、0.5ミリリットルのTXウォッシュバッファーで抗gal3ビーズを2回洗浄します。洗浄ごとに、洗浄バッファーと遠心分離機を追加します。最初にマイクロピペットで上清を取り除き、次にハミルトンシリンジで上清を取り除き、ビーズから液体を取り出します。

核抽出物を12%から32%のグリセロール勾配で分画します。10S領域に近いグリセロールグラジエントフラクション3、4、および5を組み合わせて混合します。組み合わせた勾配画分3〜5の2つの150マイクロリットルアリコートを準備し、それらを50マイクロリットルの抗gal3ビーズに入れます。

並行して、それぞれ150マイクロリットルのフラクション1を含む2つのサンプルを準備し、それらを50マイクロリットルの抗gal3ビーズに入れます。コントロールとして、150マイクロリットルの60%バッファーDを50マイクロリットルの抗gal3ビーズに入れます。チューブを軽くたたいて軽く混ぜてから、摂氏4度で頭から尾まで1時間

穏やかな遠心分離でサンプルをペレット化します。マイクロピペットで上清の大部分を取り除きます。ハミルトンシリンジを使用して、針先をビーズの底に慎重に挿入することにより、上清を取り除きます。.

ビーズはスプライシング反応にすぐに使用してください。テキスト原稿に記載されているようにスプライシング反応を組み立て、ビーズサンプルの1セットに加えます。U1-枯渇核抽出物を含まない総容量24マイクロリットルの同一のスプライシング反応のセットを組み立て、それを他のビーズセットに加えます。

総容量12マイクロリットルのビーズがない場合に実施する制御スプライシング反応を準備します。この制御反応には、核抽出物、60%バッファーD、および放射性スプライシング基質が含まれています。チューブを軽くたたいて軽く混ぜ、摂氏30度で頭から尾まで90分間回転させた後、穏やかに遠心分離して混合物をペレット

ビーズを含むチューブに24マイクロリットルの2X SDSサンプルバッファーを、核抽出物を含むがビーズを含まないコントロールチューブに12マイクロリットルの2X SDSサンプルバッファーを追加して、反応を停止し、ビーズからタンパク質を溶出させます。各チューブを渦巻きにします。チューブを摂氏100度で7分間加熱します。

チューブをGの1, 000倍で、スイングバケットローターで室温で10〜15秒間遠心分離します。上清を新しいマイクロチューブに移します。1ミリリットルあたり20ミリグラムのプロテイナーゼKを添加して、タンパク質を消化し、可溶化します。

チューブを摂氏37度で40分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを静かに遠心分離します。ビーズのとらえどころを39.5マイクロリットルTEと10マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムで希釈します。

核抽出物コントロールを63.5マイクロリットルTEと10マイクロリットルの酢酸ナトリウムで希釈します。.テキスト原稿に記載されているようにRNAを抽出して解析します。抗gal3によって免疫沈降したグリセロール勾配の10S領域からU1 snRNPおよびgal3 U1 snRNP複合体を枯渇させた核抽出物をスプライシング反応で混合した。

この反応混合物には、U1 snRNAと、U1特異的タンパク質U1-70Kが含まれていました。予想通り、反gal3はgal3を沈殿させた。U1 snRNA、U1-70Kタンパク質、およびgal3は、免疫制御前の沈殿物には見られませんでした。

ポジティブコントロールとして実施した非枯渇核抽出物と比較して、U1 snRNPが枯渇した核抽出物はスプライシング活性を示さなかった。U1枯渇核抽出物中のスプライシング活性は、ビーズ結合gal3 U1 snRNP複合体によって再構成できる可能性がある。スプライシング反応のライゲーションされたエクソンと切除されたイントロンラリアットの両方の生成物、および中間体で発見されました。

フラクション3から5の成分は、U1が枯渇した核抽出物へのスプライシングを回復する上で重要でした。これらの画分をバッファーのみで置換すると、スプライシング活性は観察されず、抗gal3ビーズはU1が枯渇した核抽出物中のスプライシング活性の回復に関与していないことを示しています。より説得力があるのは、免疫沈降手順でフラクション3から5をフラクション1に置き換え、次にU1枯渇核抽出物に添加した場合、スプライシング反応の中間体または生成物は見つかりませんでした。このプロトコールを試みる場合、1人が免疫沈降を完了し、もう1人ができるだけ遅延せずにスプライシング反応を準備する必要があります。

U1枯渇核抽出物にスプライシング活性を回復させるガレクチン-3 U1 SNRPのポリペプチド組成のプロテオミクス解析は、非常に興味深いものです。