Name: ガレクチン-3 - ビーズ上のU1 snRNP複合体によるスプライシング活性の相補 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学ぶガレクチン-3とU1 snRNP複合体によるスプライシング活性の再構成法。ビーズ上の免疫選択を用いて、U1枯渇核抽出物のスプライシング活性を回復させる実験手順を解説。

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この研究は、国立科学財団グラントMCB-0092919とミシガン州立大学の壁内研究助成金09-CDFP-2001(RJPへ)、国立衛生研究所GM-38740とミシガンAgBioResearchプロジェクトMICL02455(JLWへ)によって支援されています。
スプライシングアッセイに使用されるMINXプレmRNA基質は、スーザン・ベルゲット博士(米国テキサス州ヒューストンのベイラー医科大学)からの親切な贈り物でした。

<ol><li>Hoskins, A. A., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spliceosome%3A+a+flexible%2C+reversible+macromolecular+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine.</a> Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).</li>
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<li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+incorporation+of+galectin-3+into+the+spliceosome+through+its+association+with+U1+snRNP%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP.</a> Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).</li>
<li>Fritsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+interacts+with+components+of+the+nuclear+ribonucleoprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex.</a> BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).</li>
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<li>Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+post-splicing+lariat-intron+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes.</a> Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).</li>
<li>Malca, H., Shomron, N., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+U1+snRNP+base+pairs+with+the+5%27+splice+site+within+a+penta-snRNP+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex.</a> Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).</li>
<li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+10S+galectin-3+-+snRNP+complex+assembles+into+active+spliceosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes.</a> Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).</li>
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<li>Jurica, M. S., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+splicing+complexes+to+study+structure+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Capturing splicing complexes to study structure and mechanism.</a> Methods. 28, 336-345 (2002).</li>
<li>Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+role+of+galectins+in+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).</li>
<li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).</li>
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<li>Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+electrophoretic+isolation+of+splicing+complexes+containing+U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).</li>
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<li>Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+nuclear+localization+study+of+galectin-1+with+other+splicing+components%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components.</a> Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).</li>
<li>Michaud, S., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ATP-independent+complex+commits+pre-mRNA+to+the+mammalian+spliceosome+assembly+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway.</a> Genes & Development. 5, 2534-2546 (1991).</li>
<li>Chiu, Y. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cwc25+is+a+novel+splicing+factor+required+after+Prp2+and+Yju2+to+facilitate+the+first+catalytic+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).</li>
<li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+Brownian+ratcheting+leads+to+pre-mRNA+remodeling+and+capture+prior+to+first-step+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).</li>
<li>Gray, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+effects+on+splicing+of+two+monoclonal+antibodies+directed+against+the+amino-terminal+domain+of+galectin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このレポートは、抗Gal3コーティングビーズに閉じ込められたGal3 - U1 snRNP複合体がmRNA前の基質に結合し、この三級複合体がU1 snRNP枯渇NEにスプライシング活性を回復させることができることを文書化する実験的詳細を提供します。.初期の免疫蛍光および細胞下分画研究は、Gal3とスプライシング機構の構成要素との関連の最初のヒントを提供した:スナンプとセリンとアルギニンのSmコアポリペプチドと核斑点における共局在化 hnRNPおよびsnRNP24の密度(1.3-1.35 g/mL)のspicing因子24,25およびセシウムの沈下の家族.その後の枯渇再構成実験は、Gal3(およびガレクチンファミリーの別のメンバー、ガレクチン-1(Gal1))が必要であったが、冗長な、無細胞スプライシングアッセイの要因7,8...

ほとんどの真核メッセンジャーRNA(mRNA)の生産は、プレmRNAスプライシング1と呼ばれる核プロセスにおけるイントロンの除去およびエキソンの結紮を伴う。RNA-タンパク質複合体(RRP)の2つのクラスは、プロミセソーム複合体を介して成熟mRNAにメッセンジャー前RNAの処理を指示します。1つのクラス、新生プレメッセンジャーRnPsは、異種核RNPタンパク質および他のRNA結合タンパク質の結合によって共同転写されて形成され、SRファミリーの一部のメンバーを含む、hnRNP complexes2を生じる。第2級はウラシルが豊富な小型核RnPs(U1、U2、U4、U5、およびU6 snRNAを有するU snRNPs)がU特異的およびコアタンパク質3,4に関連している。U snRNPsは、イントロンが切除され、エキソンが合わせて成熟したmRNPs5を生成するように、動的改造経路でメッセンジャー前のRnPsの特定の領域と秩序ある方法で相互作用する。これらの処理イベントには、多くの追加核タンパク質が関与する6。
ガレクチン-1(Gal1)およびガレクチン-3(Gal3)は、枯渇再構成研究で示されるように、スプライシング経路に必要な因子である2つのタンパク質である7,8。有能な核抽出物(NE)のスプライシングから両方のガレクチンを除去することは、初期の段階でスプライセソームアセンブリとスプライシング活性を廃止する。このような二重に枯渇したNEにガレクチンを加えて、両方の活動を復元します。Gal1およびGal3は、前mRNAの特異的免疫沈降法、中間体のスプライシング、およびGal1またはGal39のいずれかに対する抗血清による成熟mRNAによって証明される活性スプライセソームの成分である。重要なことに、Gal3は、抗Gal3抗sera10によるsnRNPsの沈殿によって示されるように、NEの外側のスプライシング経路に粒子を含む内因性U snRNAと関連する。最後に、HeLa細胞におけるGal3のサイレンシングは、多数の遺伝子11のスプライシングパターンを変化させる。
NEでは、プレフォームスプライセソソーム12を分解するためにインキュベートされ、snRNPは7Sから60S以上のグリセロール勾配で堆積する複数の複合体に見られる。グリセロール勾配分画は、スプライセソーム複合体および成分の分離のための一般的な技術であるが(例えば、参照13,14,15参照)、我々は抗体免疫沈降を用いて特定の画分を特徴付け、この方法を拡張した。10SのsnRNP沈積物は、Gal3と一緒にU1 snRNAのみを含む。10S分の免疫沈降は、Gal3またはU1 snRNPに特異的な抗セラを有するU1およびGal3の両方が、一部のU1 snRNPモノ粒子がGal310に結合していることを示す共沈殿する。U1 snRNPは、スプライセソームアセンブリ1,5においてmRNP前に結合する最初の複合体であるため、このステップは、Gal3がスプライシング経路に入り込む可能性のある部位を表す。これに基づき、ビーズを含む抗Gal3に結合した10S Gal3-U1 snRNPモノ粒子がU1 snRNP枯渇NEにスプライシング活性を回復し、Gal3がスプライオソーム経路16に採用される1つのメカニズムとしてこの複合体を確立することを示した。これは、スプライシング反応の特定の段階でスプライセソームを分離し、関連する因子17,18をカタログ化する試みとは対照的です。このような研究では、ある時点で特定の因子の存在が確認されるが、それらがロードされたメカニズムは確認されない。
我々は、NEの調製、スプライシング基質、スプライシング反応混合物の組立、およびプレmRNAスプライシング19におけるガレクチンの役割の文書における製品の分析について詳細に説明した。我々は、核抽出物の分画を用いて、Gal3-U1 snRNP複合体で濃縮された分画を得るための実験手順と、U1枯渇核抽出物中のスプライシング活性を再構成するための後者複合体の免疫選択について説明する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61990/61990fig01.jpg"> 図1:ビーズ上のGal3-U1 snRNP複合体によるU1 snRNPの枯渇した核抽出物におけるスプライシング活性の相補を示す模式図 (A)NEインバッファーC(NE(C)))は、プロテインA-セファローズビーズと共有結合したタンパク質A-セファローズビーズ(α1ビーズ)と結合した。非バインドの分数は U1 snRNP (U1ΔNE) の枯渇です。(B) NEインバッファーD(NE(D))は、超遠心化により12%~32%のグリセロール勾配に分画される。10S領域(画3〜5)に対応する画分は、抗Gal3抗体(αGal3ビーズ)と共有結合してビーズと組み合わされて混合される。ビーズに結合した材料には、Gal3-U1 snRNP モノ粒子が含まれています。(C)Part(B)のGal3-U1 snRNP複合体を、32P標識MINXプレmRNA基質を用いたスプライシングアッセイで第1部(A)からU1ΔNEと混合し、スプライシング反応の中間体および生成物をゲル電気泳動とオートラジオグラフィーで分析する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61990/61990fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>抗 U1 snRNP</td><td>結合部位</td><td>Hu ENA-RNP #33471</td><td>U1 snRNP ボトルトップ真空フィルターに特異的なヒト自己免疫血清</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>Corning 431153 (0.22 &mu;m;PES 150 ml)</td><td>トリス遠心分離機を含むろ過溶液</td></tr><tr><td></td><td>International Equipment Company</td><td>IEC Model PR-6</td><td>for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation</td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>159220-5G</td> 水<td>の処理用</td></tr><tr><td>ジメチルピメリミデート (DMP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80490-5G</td><td>セファロースビーズ</td></tr><tr><td>電気泳動細胞</td>への抗体架橋用 <td>BioRad Laboratories, Inc</td><td>Mini-Protean II</td><td>タンパク質のSDS-PAGE分離用</td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411000-100ml</td><td>架橋反応後のブロッキング用</td></tr><tr><td>ゲル電気泳動システム</td><td>Hoefer, Inc</td><td>HSI SE 500 Series</td><td>snRNAsをゲル電気泳動</td></tr><tr><td>ゲルスラブで分離するため乾燥機</td><td>BioRad</td><td>Model 224</td><td>乾燥用 オートラジオグラフィー用ゲルスラブ</td></tr><tr><td>Hybond ECL membrane</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN3032D (0.2 &mu;m;30 cm x 3 m)</td><td>膜</td></tr><tr><td>マイクロダイアライザー(12 x 100 &mu;l サンプル容量)</td>核抽出物のバッファーを交換するための<td>Pierce</td><td>Microdialyzer System 100</td><td>&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロダイアライザーメンブレン(8Kカットオフ)</td><td>核抽出物のバッファーを交換するための</td><td>Pierce</td><td>66310</td>&nbsp;</tr><tr><td>スパ</td><td>ルタン</td>ストアスパ<td>ルタンストアスパルタンインスタント無脂肪粉乳</td><td></td></tr><tr><td>プロテインAセファロースCL-4B</td><td>ミリポアシグマ</td><td>GE 17-0780-01</td>ビーズ<td>へのカップリング抗体</td></tr>プロ<tr><td>ピナーゼK</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P2308-5mg</td>ス<td>プライシング反応を停止してRNAを分離するためのRNAを分離</td></tr>するための<tr><td>RNasin</td><td>プロメガ</td><td>N2111</td>リ<td>ボヌクレアーゼ活性</td></tr><tr><td>を阻害するためのロッカー/ローテーター</td><td>Lab Industries, Inc&nbsp;</td>カップリング<td>反応および免疫沈降におけるタンパク質溶液の混合用</td><td>Labquake Shaker 400-110</td></tr><tr><td>Safety-Solve</td><td>Research Products International Corp.</td><td>No. 111177</td><td>スプライシング基板の放射能測定用シンチレーションカウントカクテル</td></tr> シン<tr><td>チレーションカウンター</td><td>Beckman Instruments</td><td>LS6000SC</td><td>放射能測定用シンチレーションカウンター&nbsp;</td></tr><tr><td>エタノール沈殿RNAペレット乾燥用</td><td>速度真空濃縮器</td><td>Savant</td><td>SVC 100H</td></tr><tr><td>Transphor電気泳動ユニット</td><td>Hoefer, Inc</td><td>Hoefer TEシリーズ</td><td>SDS-PAGEからブロッティングメンブレンへのタンパク質転写用</td>トランスファー</tr></tbody></table>

ガレクチン-3 - ビーズ上のu1 snrnp複合体によるスプライシング活性の相補

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

従来の枯渇再構成実験は、ガレクチン-3が核抽出物に必要なスプライシング因子であることを示している。この論文では、ガレクチン-3をスプライシング経路に組み込むメカニズムについて説明する。12%~32%のグリセロール勾配に対するHeLa細胞核抽出物の沈積は、ガレクチン-3およびU1 snRNPを含む内因性〜10S粒子に富んだ分画を生み出す。我々は、スプライシング活性の伴う損失を伴うU1 snRNPの核抽出物を枯渇させるプロトコルを記述する。U1枯渇した抽出物におけるスプライシング活性は、アガロースビーズに閉じ込められたガレクチン-3-U1 snRNP粒子と抗ガレクチン-3抗体と共価的に結合することによって再構成することができる。結果は、ガレクチン-3- U1 snRNP - mRNA前三元複合体がスプライシング反応の中間体および産物につながる機能的E複合体であり、ガレクチン-3がU1 snRNPとの関連を通じてスプライシング経路に入ることを示している。特定のスプライシング因子の枯渇した抽出物におけるスプライシング活性を再構成するためにビーズ上で親和性または免疫選択された複合体を使用するスキームは、一般的に他のシステムに適用され得る。

U1 snRNP(2.2.6からU1ΔNE)とGal3-U1 snRNP複合体を欠乏させた、抗Gal3(ステップ3.2.7)によりグリセロール勾配免疫沈降した10S領域から、スプライシング反応で混合した。この反応混合物には、U1 snRNA(図2A、レーン3)、ならびにU1特異的タンパク質、U1-70K(図2B、レーン3)が含まれていた。予想通り、抗Gal3はGal3を沈殿させた(図2B、レーン3)。これらの成分(U1 snRNA、U1-70Kタンパク質、およびGal3)は、予免疫(PI)対照沈殿には見つからなかった(図2A、図2B、レーン2)。正の対照として行われた非枯渇NE(図2C、レーン1)と比較して、U1ΔNE...

この記事では、(a)核抽出物からのU1 snRNPの枯渇に関する実験的手順について説明し、それに伴うスプライシング活性の喪失について説明します。(b)ガレクチン-3-U1 snRNP粒子に結合したU1枯渇エキスにおけるスプライシング活性の再構成を抗ガレクチン-3抗体と共有結合した。

ガレクチン-3 - ビーズ上のU1 snRNP複合体によるスプライシング活性の相補

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

本報告は、ガレクチン-3 U1 snRNP複合体がpre mRNA基質に結合し、機能的な複合体を形成し、スプライシング反応の生成物につながるという文書化の実験的証拠を提供するものである。このプロトコールは、抗gal3抗体と共有結合したビーズ上に免疫選択されたガレクチン-3 U1 snRNPを利用してスプライシング反応を開始し、スプライシング反応を完了まで進行させることができます。プロトコールの重要なステップは、ガレクチン-3 U1 snRNP複合体を含むビーズをペレット化した後、液体を慎重に除去し、スプライシング反応を開始するためにすぐに使用することです。核抽出物からU1 snRNPを枯渇させるには、200マイクロリットルの核抽出物と100マイクロリットルの抗U1ビーズをインキュベートします。混合物に5マイクロリットルのRNAを加え、マイクロチューブを摂氏4度で1時間回転させます。遠心分離により混合物をペレット化し、ハミルトンシリンジを使用して未結合材料を回収します。U1 枯渇核抽出物の全量と、元の非枯渇核抽出物の別の 50 マイクロリットルアリコートをマイクロダイアライザーの別々のコンパートメントで透析し、摂氏 4 度で 60% バッファー D に対して 75 分間攪拌します。分子量が8Kカットオフされた透析メンブレンを使用してください。透析直後は、製剤を20マイクロリットルのアリコートに分け、ドライアイスエタノール浴でスナップ冷凍し、マイナス80°Cで保存します。使用直前に、0.5ミリリットルのTXウォッシュバッファーで抗gal3ビーズを2回洗浄します。洗浄ごとに、洗浄バッファーと遠心分離機を追加します。最初にマイクロピペットで上清を取り除き、次にハミルトンシリンジで上清を取り除き、ビーズから液体を取り出します。核抽出物を12%から32%のグリセロール勾配で分画します。10S領域に近いグリセロールグラジエントフラクション3、4、および5を組み合わせて混合します。組み合わせた勾配画分3〜5の2つの150マイクロリットルアリコートを準備し、それらを50マイクロリットルの抗gal3ビーズに入れます。並行して、それぞれ150マイクロリットルのフラクション1を含む2つのサンプルを準備し、それらを50マイクロリットルの抗gal3ビーズに入れます。コントロールとして、150マイクロリットルの60%バッファーDを50マイクロリットルの抗gal3ビーズに入れます。チューブを軽くたたいて軽く混ぜてから、摂氏4度で頭から尾まで1時間回転させます。穏やかな遠心分離でサンプルをペレット化します。マイクロピペットで上清の大部分を取り除きます。ハミルトンシリンジを使用して、針先をビーズの底に慎重に挿入することにより、上清を取り除きます。.ビーズはスプライシング反応にすぐに使用してください。テキスト原稿に記載されているようにスプライシング反応を組み立て、ビーズサンプルの1セットに加えます。U1-枯渇核抽出物を含まない総容量24マイクロリットルの同一のスプライシング反応のセットを組み立て、それを他のビーズセットに加えます。総容量12マイクロリットルのビーズがない場合に実施する制御スプライシング反応を準備します。この制御反応には、核抽出物、60%バッファーD、および放射性スプライシング基質が含まれています。チューブを軽くたたいて軽く混ぜ、摂氏30度で頭から尾まで90分間回転させた後、穏やかに遠心分離して混合物をペレット化します。ビーズを含むチューブに24マイクロリットルの2X SDSサンプルバッファーを、核抽出物を含むがビーズを含まないコントロールチューブに12マイクロリットルの2X SDSサンプルバッファーを追加して、反応を停止し、ビーズからタンパク質を溶出させます。各チューブを渦巻きにします。チューブを摂氏100度で7分間加熱します。チューブをGの1, 000倍で、スイングバケットローターで室温で10〜15秒間遠心分離します。上清を新しいマイクロチューブに移します。1ミリリットルあたり20ミリグラムのプロテイナーゼKを添加して、タンパク質を消化し、可溶化します。チューブを摂氏37度で40分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを静かに遠心分離します。ビーズのとらえどころを39.5マイクロリットルTEと10マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムで希釈します。核抽出物コントロールを63.5マイクロリットルTEと10マイクロリットルの酢酸ナトリウムで希釈します。.テキスト原稿に記載されているようにRNAを抽出して解析します。抗gal3によって免疫沈降したグリセロール勾配の10S領域からU1 snRNPおよびgal3 U1 snRNP複合体を枯渇させた核抽出物をスプライシング反応で混合した。この反応混合物には、U1 snRNAと、U1特異的タンパク質U1-70Kが含まれていました。予想通り、反gal3はgal3を沈殿させた。U1 snRNA、U1-70Kタンパク質、およびgal3は、免疫制御前の沈殿物には見られませんでした。ポジティブコントロールとして実施した非枯渇核抽出物と比較して、U1 snRNPが枯渇した核抽出物はスプライシング活性を示さなかった。U1枯渇核抽出物中のスプライシング活性は、ビーズ結合gal3 U1 snRNP複合体によって再構成できる可能性がある。スプライシング反応のライゲーションされたエクソンと切除されたイントロンラリアットの両方の生成物、および中間体で発見されました。フラクション3から5の成分は、U1が枯渇した核抽出物へのスプライシングを回復する上で重要でした。これらの画分をバッファーのみで置換すると、スプライシング活性は観察されず、抗gal3ビーズはU1が枯渇した核抽出物中のスプライシング活性の回復に関与していないことを示しています。より説得力があるのは、免疫沈降手順でフラクション3から5をフラクション1に置き換え、次にU1枯渇核抽出物に添加した場合、スプライシング反応の中間体または生成物は見つかりませんでした。このプロトコールを試みる場合、1人が免疫沈降を完了し、もう1人ができるだけ遅延せずにスプライシング反応を準備する必要があります。U1枯渇核抽出物にスプライシング活性を回復させるガレクチン-3 U1 SNRPのポリペプチド組成のプロテオミクス解析は、非常に興味深いものです。

complementation-splicing-activity-galectin-3-u1-snrnp-complex-on

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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学ぶガレクチン-3とU1 snRNP複合体によるスプライシング活性の再構成法。ビーズ上の免疫選択を用いて、U1枯渇核抽出物のスプライシング活性を回復させる実験手順を解説。

ガレクチン-3 - ビーズ上のU1 snRNP複合体によるスプライシング活性の相補

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