DetectSyn:シナプス密度の変化を検出するための迅速で偏りのない蛍光法
2022年7月22日
DetectSynは、治療または疾患状態にわたる相対シナプス(シナプス前およびシナプス後関与)数の変化を測定する、偏りのない迅速な蛍光アッセイです。この技術は、培養ニューロンおよび固定組織の両方において使用することができる近接ライゲーション技術を利用する。
DetectSynは、近接ライゲーションアッセイ技術を利用して、シナプスの変化を迅速に特定します。また、結果を分析するためのプロトコルも提供しています。DetectSynの主な利点は、分析可能な組織の広い領域で結果が得られる速さです。
まず、細胞を乱すことなく、プラスチック製のパスツールピペットでブロッキング溶液を慎重に取り除きます。それからパラフィルムで大きなプラスチック製のペトリ皿を並べる。そして鉗子を使って、カバースリップをパラフィルムに慎重に移します。
60マイクロリットルの一次抗体溶液をカバースリップの上部に加え、抗体溶液がカバースリップの側面にこぼれないようにします。湿度を確保し、インキュベーション中にサンプルが乾燥するのを防ぐために、超純水を小さなペトリ皿に加え、カバースリップの周りに皿を慎重に置きます。次いで、より大きなシャーレを覆い、培養細胞を室温で1時間インキュベートする。
一次抗体とのインキュベーション後、鉗子を使用してカバースリップからペーパータオルに一次抗体溶液を慎重にタップオフし、カバースリップを500マイクロリットルのPBSで満たされた元の24ウェルプレートに移します。次いで、サンプルをPBSで3回、それぞれ10分間、オービタルシェーカー上で穏やかな攪拌で洗浄する。最後の洗浄後、カバースリップを大きなペトリ皿に戻し、カバースリップの上部に40マイクロリットルの二次抗体溶液を加えます。
ペトリ皿を覆い、サンプルを摂氏37度で1時間インキュベートする。ライゲーションの場合、リガーゼをコールドブロック上に保持しながら、ライゲーションストックを使用してリガーゼ1〜40を希釈し、直ちに40マイクロリットルのリガーゼミックスをカバースリップに加える。ペトリ皿を覆い、サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートする。
増幅のために、増幅ストックを使用してコールドブロック上でポリメラーゼ1280を希釈する。次いで、40マイクロリットルの増幅ミックスをカバースリップに加え、サンプルを摂氏37度で100分間インキュベートする。次に、マウントのために、3マイクロリットルのマウントメディアをスライド上に落とします。
カバースリップから余分な洗浄バッファーをタップオフし、細胞が取り付け媒体に下を向いた状態でカバースリップを置きます。カバースリップを所定の位置に保持するために、少量の透明なマニキュアで側面をシールします。スライスした組織を取り付けるには、組織スライスを用意したスライドに慎重に移し、平らに置きます。
次いで、5〜10マイクロリットルのマウント培地を組織スライス上に滴下する。前述のように、ガラスカバースリップをティッシュスライスの上に置き、カバースリップを透明なマニキュアで密封します。共焦点顕微鏡によるデジタルイメージングでは、各蛍光チャンネルのゲイン、オフセット、レーザーパワーを調整して、バックグラウンドノイズを低減し、蛍光シグナルを強化します。
蛍光シグナルが過飽和になっていないことを確認します。培養ニューロンについては、[ND取得]タブで、[ファイルに保存]をクリックします。次に、[参照] で、画像を保存するファイルを選択し、ファイル名を入力します。
次に、[Z] タブで、[範囲で定義される対称モード] オプションを選択します。フォーカスを最適なマップ 2 平面に設定し、[相対] ボタンをクリックして、このフォーカル プレーンを Z スタックの中央として設定します。次に、範囲を1マイクロメートルステップで5マイクロメートルに設定し、Z移動中にアクティブなシャッターを閉じるをチェックします。
「波長」タブで、「オプティカル構成」で以前に構成した集録設定でオプティカルボタンの名前を選択し、「今すぐ実行」をクリックします。スライスされた組織の場合、取得メニューから「大きな画像をスキャン」を選択し、キャプチャパネルの下で、以前に構成した集録設定の光学ボタンを選択します。また、このパネルで正しい目的を選択します。
次に、エリアパネルとアイピースの下で、矢印キーを使用して、関心領域またはROIの境界を設定します。次に、[大きな画像をファイルに保存]をクリックし、画像の保存パスファイル名を作成します。最後に、セットアップパネルで、マルチチャンネルキャプチャがチェックされていることを確認します。
次に、オプティカルコンフィギュレーションで以前に設定した集録設定でオプティカルボタンの名前を選択します。ImageJ で、画像メニューに移動し、[調整]、[しきい値] の順にクリックして、しきい値オプションを開きます。画像の背景が暗い場合は、[暗い背景]オプションを選択します。
次に、以前に決定した最適化されたしきい値設定ごとにしきい値の上限と下限を調整し、[適用]をクリックします。培養細胞の場合、MAP2チャネルとフリーハンドROIツールを使用して、樹状突起およびソーマを含む各ニューロンのROIを描画します。スライスされた組織の場合、関心領域をカプセル化するスライス画像内にフリーハンドROIを描画する。
次に、[分析]メニューを開き、[測定]をクリックしてROIの領域を取得します。各ROI内のプンタの数を検出するには、粒子分析などの自動検出ツールを使用します。[解析]メニューから[解析されたパーティクル]を選択し、穿刺サイズの直径を定義します。
次に、[表示]ドロップダウンメニューから[オーバーレイマスク]オプションを選択し、[結果の表示]オプションをオンにして[OK]をクリックします。プンタの数を個々のROIの面積で割るには、結果ポップアップから各画像の結果をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。取得したファイルを特定し、データを取得してサンプリングし、ROI の領域をプンタの数で割ります。
最後に、結果を対照サンプルに正規化するために、対照試料の結果を平均化し、得られたすべての試料の結果を対照の平均で除算する。GABABアゴニストであるバクロフェンは、迅速な抗うつ薬Ro-256981のインビトロ有効性に必要である。シナプス形成の増加は、白色プンタの増加によって実証される。
バクロフェンがなければ、シナプス形成の増加は見られない。インビボでは、迅速な抗うつ薬の腹腔内注射は、生理食塩水対照と比較してシナプス形成の増加をもたらす。テクニカルコントロール画像にはいくつかのプンタが表示されますが、他のパネルの大きなプンタと比較して、白い仕様で示されているサイズとは通常同じではありません。
さらに、これらのプンタは、ソーマ内に現れるいくつかのプンタによって実証されたのと同じ場所にはない。DetectSynは、疾患状態または薬物治療によるシナプスの変化を同定することができる。この方法は、シナプスの発達または分解に影響を与える障害を研究する研究のあらゆる分野に洞察を提供するのに役立ちます。
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概要
DetectSynは、さまざまな処理や疾患状態でシナプス結合の変化を測定するために設計された迅速な蛍光アッセイです。近接ライゲーション法を利用しており、培養ニューロンと固定組織の両方に適用可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 蛍光アッセイ
背景
- DetectSynは近接結紮アッセイ技術を利用しています。
- この手法により、シナプス変化を迅速に特定することが可能です。
- 組織の広範な領域に適用できます。
- 結果解析のためのプロトコルが提供されています。
研究の目的
- さまざまな条件下でのシナプス数の変化を測定する。
- シナプス結合の状態を、迅速かつ客観的に評価する手法を提供する。
- シナプス生物学および関連疾患の研究を促進する。
使用した手法
- 近接結紮アッセイ（Proximity ligation assay）技術。
- 蛍光イメージング技術。
- 培養ニューロンおよび固定組織への応用。
- 結果解析のためのプロトコル。
主な結果
- DetectSynは迅速な結果を提供します。
- 広範囲の組織領域を効果的に解析することが可能です。
- シナプス結合の変化を定量化できます。
- 得られた結果から、治療効果や疾患の状態を判断できます。
結論
- DetectSynは、神経科学研究において価値のあるツールです。
- これにより、シナプス変化への理解が深まります。
- 本手法の速度と効率性は、大きな利点となります。
よくある質問
産業上の重要性
DetectSynは、広範囲な組織におけるシナプス密度の変化を迅速かつ不偏に定量化することを可能にし、神経科学における創薬の重大なボトルネックを解消します。この機能は、特にシナプスの完全性が重要なバイオマーカーとなるうつ病や神経変性疾患のプログラムにおいて、中枢神経系（CNS）治療薬のターゲット検証およびメカニズム的なリスク低減を支援します。本手法のアクセシビリティとスケーラビリティにより、in vitroモデルから前臨床組織解析へのトランスレーショナルな連続性が向上します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： シナプス形成または消失の直接的な指標として、前シナプスおよび後シナプス蛋白質の近接性を定量化することにより、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値： 疾患状態または薬剤活性によって誘発されるシナプス変化を不偏に検出することで、機能的なターゲットバリデーションを提供する。
- 予測的価値： 回路レベルの機能的結果と相関するシナプス密度の定量的かつ代表的なデータを生成し、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備： 培養ニューロンおよび固定組織におけるシナプス密度のベースライン指標を確立することで、ダウンストリームスクリーニングに適した検証済み生物学的システムを準備します。
- 再現性： しきい値ベースの粒子解析により、単位面積あたりの標準化された定量的なパンクタ数を算出でき、実験間での信頼性の高い化合物評価が可能になります。
- 拡張性： 広範な組織領域の高コンテンツ解析を容易にし、少数のサンプル数に基づく電子顕微鏡的手法と比較して、統計的検出力を高め、サンプリングバイアスを低減します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患との関連性： シナプス喪失が特徴である大うつ病性障害およびアルツハイマー病のモデルにおけるシナプス病理と一致します。
- トランスレーショナルな連続性： in vitroでの知見をex vivo組織解析へと繋げ、一貫したシナプス密度読み取り値を通じて、リスク調整後の推進決定を支援します。
- メカニズムによるリスク低減： 観察された表現型効果が、実際のシナプス再構築によるものか、あるいは間接的なニューロン変化によるものかを明確にし、ターゲットへの信頼性を向上させます。
パイプラインおよびワークフローの統合
DetectSynは、初期のターゲット検証からリード化合物の同定、そして前臨床での有効性試験に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、そこではシナプス密度が神経回路の完全性を示すメカニズムバイオマーカーとして機能します。
- 探索生物学：標的への結合の機能的な読み出しとして、シナプス形成または消失を直接測定することで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：マルチウェル形式におけるシナプス密度の測定を標準化する、定量的で偏りのないパンクタ検出により、アッセイの準備を可能にします。
- アナリティクス：コントロールに対する正規化されたシナプス密度値（puncta/area）を算出することで、異なる条件下での治療効果を評価するための比較可能な指標を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：培養ニューロンのデータを固定組織切片に結びつけ、前臨床検証段階を通じてシナプス測定の連続性を維持します。
- エンタープライズでの再利用：神経科学プロジェクト全体で再利用可能なプラットフォーム機能として動作し、冗長なメソッド開発を削減し、研究間のデータ比較を可能にします。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 化合物や疾患モデルのシナプスへの影響に関するメカニズム的な曖昧さを低減することで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させます。
- 運用の価値： ほとんどの研究室で導入可能な、プロトコル化されたイメージング、閾値設定、および粒子解析ステップを通じて、標準化と再現性を高めます。
- 戦略的価値： 中枢神経系（CNS）プログラムにおける後期の投資リスクを軽減する、早期の生物学的に関連のあるシナプスデータを提供することで、Go/No-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 大うつ病（MDD）、アルツハイマー病、およびその他の神経精神疾患に関連し、トランスレーショナルに検証されたバイオマーカーであるシナプス密度の変化に基づいた、リスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 免疫蛍光染色、近接結紮アッセイ（PLA）の取り扱い、および蛍光顕微鏡の最適化に関する専門知識が必要です。
- 共焦点イメージングシステムへのアクセスと、閾値ベースの点状構造（puncta）検出のためのImageJなどの画像解析ツールが必要です。
- 再現性のある結果を得るためには、ユーザー間および施設間で抗体ペア、インキュベーション条件、およびROI（関心領域）の定義を標準化する必要があります。
- 異なるモデルシステム（例：一次ニューロン、iPSC由来ニューロン、組織切片）に適応させるには、抗原へのアクセス性とS/N比の検証が必要です。
- 実用上の制限として、特定のシナプス前・後タンパク質の標的に依存することや、点状構造のサイズおよび局在制御に関する出典資料にあるように、密なニューロピルにおける立体障害の可能性が挙げられます。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Primary Antibody Incubation
1:29
Sample Washes, Secondary Antibody Incubation, Ligation, Amplification, and Mounting
3:49
Digital Imaging with a Confocal Microscope
5:49
Image Analysis
7:41
Results: Increased Synapse Formation by Rapid Antidepressants in the Presence of GABAB Agonists
8:42
Conclusion
