Name: DetectSyn:シナプス密度の変化を検出するための迅速で偏りのない蛍光法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぼう、近接結合アッセイ技術を用いたシナプス密度変化の迅速かつ偏りのない蛍光検出法。培養ニューロンや固定組織の広範囲な領域を効率的に解析し、神経科学および細胞生物学研究におけるシナプス動態の理解を支援します。

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この研究は、米国国立衛生研究所 NINDS R01 NS105005 (KRG) および NS105005-03S1 (KRG)、国防総省 USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG)、NIAAA R01AA016852、NIAAA T32AA007565 (CFH)、および FRAXA Research (CFH) および Alzheimer's Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG) からの助成金によって支援されました。

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著者らは利益相反を報告していない。

DetectSynは、近接ライゲーションアッセイを使用して互いに40nm以内のタンパク質を検出する迅速なアッセイであり、シナプス形成の検出を可能にする。この技術は、シナプス形成の代理測定としてのみ役立つ現在の蛍光アッセイを改善する。DetectSynは、互いの40nm以内、すなわちシナプス間隙内に局在するシナプスタンパク質の定量可能な変化を検出する。さらに、DetectSynは、シナプスを測定するように設計され、古典的にゴールドスタンダード技術として指定されている電子顕微鏡やアレイ断層撮影などの技術よりも費用対効果が高く、所要時間もかかりません。 
DetectSynは高度にカスタマイズ可能な技術です。任意のシナプス対は、タンパク質対が互いに40nm以内に存在する限り、特定のタイプのシナプスの形成を同定するために使用することができる。このエキサイティングな技術には多くの用途がありますが、最適なブロッキングおよび一次インキュベーション条件を含む抗体を検証し、免疫蛍光などの他の方法を使用してその結果をサポートし続ける必要があります。抗体結合の競合を減らすためにDetectSynを利用し...

シナプスは、ニューロン間のコミュニケーションの基本単位である1。同じ領域内のニューロン間の多くのシナプスは、行動を媒介する回路を生じる2。シナプスは、神経伝達物質または神経ペプチドを放出する1つのニューロンからのシナプス前末端からなり、別のニューロンのシナプス後受容体に情報を中継する。シナプス前部シグナルの総和は、シナプス後ニューロンが活動電位を発火させ、メッセージを他のニューロンに伝播するかどうかを決定する。
シナプス病理学、シナプスの分解は、アルツハイマー病および大うつ病性障害のような神経体積の減少によって特徴付けられる疾患および障害において生じ、もはや最適に実行しない回路をもたらす3,4,5。シナプス密度の回復は、これらの障害に対する潜在的な治療法の有効性の根底にある可能性が高い。例えば、シナプスの増加が急速な抗うつ薬の行動効果の根底にあることが最近実証されました6。可能なシナプス病理学的治療を迅速にスクリーニングするために、研究者はシナプス数の変化を迅速に特定する技術を必要とする。
現在の方法論は、時間と費用がかかるか(電子顕微鏡、アレイ断層撮影)、またはシナプス前部の関与(脊椎分析、免疫蛍光/共局在化)を組み込まずにシナプス後の変化のみを調べる。DiIのような色素やGFPのような蛍光タンパク質は、ニューロンを視覚化し、シナプス後棘を特徴付けるのに役立ちます。しかし、脊椎解析では、研究者が定義した比率を使用して形態を決定し、再現性を低下させる可能性があります7。さらに、異なる脊椎クラスが機能的シナプスとどのように関連しているかは、まだ明らかにされていない8。脊椎形成は一過性であり得、シナプス後可塑性を反映する可能性があるが、これらの脊椎はシナプス前ニューロン9を有するシナプスに安定する前に排除され得る。
共局在化は、シナプス前およびシナプス後タンパク質を免疫染色することができるため、脊椎分析よりもシナプスのより良いプロキシを提供する。しかしながら、シナプスタンパク質は、タンパク質が並置され、一貫して重なり合わない可能性があるため、低い共局在値をもたらす可能性がある。したがって、タンパク質は完全に重ね合わされていないため、共局在化技術は、この欠落した情報のためにシナプス形成の変化を正確に測定できない可能性がある。最後に、電子顕微鏡(EM)とアレイ断層撮影法の両方がシナプスの高解像度画像を提供しますが、時間がかかります。EMはさらに特殊な装置を必要とし、研究者は任意の実験のために少量の組織に制限されている。アレイ断層撮影法は、超薄切片上の多くのタンパク質を優雅にスクリーニングする能力を提供し、EM10と組み合わせることができるが、この技術はあまりにも労働集約的であり、シナプス形成の変化を迅速にスキャンする必要がある実験の範囲を超えている可能性がある。
DetectSynは、デュオリンク近接ライゲーションアッセイの特定のアプリケーションです。PLAアッセイは、タンパク質間相互作用の一般的な検出を可能にします。DetectSynは、タグ付きのシナプス前およびシナプス後タンパク質によって放出される蛍光シグナルを互いに40nm以内に増幅することによって、シナプス後部のプロキシブリッジ測定を行います。シナプスタンパク質がシナプス間隙内と同様に40nm以内にある場合、DNAプローブを含む二次抗体は環状DNAにハイブリダイズする。このハイブリダイズした環状DNAは蛍光プローブを発現し、次いでこれを増幅し、標準的な蛍光顕微鏡技術で検出する( 図1参照)。重要なことに、EMやアレイ断層撮影法とは異なり、この技術は特別な装置を必要とせず、標準的な免疫組織化学とほぼ同じ時間がかかります。したがって、この技術のアクセシビリティにより、研究集約型機関以外の研究者はシナプト病理学研究に参加することができます。さらに、この技術は、単一の実験内で複数の脳領域におけるシナプス密度の変化を調べることができ、疾患または治療によるシナプス変化のより全体的な表現を提供する。

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP39920</td><td>PBSは自社製でも機能します。</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB012929</td><td>組織スライスの場合、滅菌済みのプレートは不要な場合があります。</td></tr><tr><td>50 mLコニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-078-290</td><td></td></tr><tr><td>チキン抗MAP2抗体</td><td>アブカム</td><td>ab5392</td><td></td></tr><tr><td>クリアマニキュア</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>NC1849418</td><td>その他のクリアマニキュアも機能します。</td></tr><tr><td>コールドブロック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13131012</td><td></td></tr><tr><td>コンピュータワークステーション</td><td>HP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点または蛍光顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>A1R HD25</td><td></td></tr><tr><td>ロバ アンチチキン FITC</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>SA1-72000</td><td></td></tr><tr><td>Duolinkロバ アンチマウスPLUS</td><td>シグマ</td><td>DUO92001</td><td></td></tr><tr><td>Duolinkロバ アンチウサギマイナス</td><td>Sigma</td><td>DUO92005</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ 検出試薬 遠赤色</td><td>Sigma</td><td>DUO92013</td><td>ライゲーションストック、増幅ストック、リガーゼ、ポリメラーゼが含まれています。</td></tr><tr><td>DAPIシグマ</td><td>DUO82040</td><td></td>を使用した<td>Duolink In Situ封入剤</td></tr><tr><td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td><td>Sigma</td><td>DUO82049</td><td>Wash Buffer AおよびWash Buffer Bが含まれています。Wash Buffer BをdiH20で1%に希釈し、1% Wash Buffer Bを調製してください。</td></tr><tr><td>細い先端の絵筆</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9691026</td><td>セーブルの髪、サイズ00または000は、また、工芸品店で見つけることができます</td></tr><tr><td>フィッシャーブランドカバーメガネ:長方形フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12545MP</td><td>カバーガラスは、すでにガラスカバースリップに培養ニューロンのために不要です。</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド スーパーフロスト プラス マイクロスコープ スライド</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>1255015</td><td>ガラスのカバースリップにすでに付着している培養ニューロンの場合、スーパーフロスト スライドは不要な場合があります。</td></tr><tr><td>冷凍庫、-20°C;C</td><td>VWR</td><td>76449-108</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>125480</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>・フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>画像処理ソフト</td><td>(例:NIS Elements, ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15-015-2633</td><td></td></tr><tr><td>大型シャーレ、100mm</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td>・サイエンティフィ<td>ック FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>分子グレードの水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP24701</td><td></td></tr><tr><td>マウス 抗シナプシン1抗体</td><td>シナプスシステム</td><td>106-011</td><td></td></tr><tr><td>正常ロバ血清</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-106-1013</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>02-707-025</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-388-100</td><td>作業量は3 & マイクロの範囲です。Lから500&micro;L</td></tr><tr><td>プラスチックパスツールピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>02-708-006</td><td></td></tr><tr><td>精密ピンセット/フォアセップ</td><td>ス フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗PSD95抗体</td><td>アブカム</td><td>ab18258</td><td>他の抗体ペアも最適化して機能する可能性があります。</td></tr><tr><td>冷蔵庫</td><td>VWR</td><td>76470-402</td><td></td></tr><tr><td>小型シャーレ、60 mm</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>タイマー</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン 20</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP337-100</td><td></td></tr></tbody></table>

detectsyn:シナプス密度の変化を検出するための迅速で偏りのない蛍光法

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

シナプスはニューロン間のコミュニケーションの部位です。神経回路の強さはシナプス密度に関係しており、シナプスの破壊は大うつ病性障害(MDD)やアルツハイマー病などの疾患状態の特徴です。シナプス数を調べるための伝統的な技術には、蛍光マーカー(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP))の遺伝子発現、ニューロンを満たす色素(例えば、カルボシアニン色素、DiI)、および脊椎マーカーの免疫蛍光検出(例えば、シナプス後密度95(PSD95))が含まれる。これらのプロキシ技術の主な注意点は、シナプス後の変化のみを識別することです。しかし、シナプスはシナプス前終末とシナプス後脊椎との間の接続である。シナプスの形成/除去を測定するためのゴールドスタンダードには、時間のかかる電子顕微鏡またはアレイ断層撮影技術が必要です。これらの技術には、専門的なトレーニングと高価な機器が必要です。さらに、限られた数のニューロンしか評価できず、脳領域全体に対する変化を表すために使用される。DetectSynは、疾患状態または薬物活性に起因するシナプス形成または消失の変化を識別する迅速な蛍光技術である。DetectSynは、迅速な近接ライゲーションアッセイを利用して、並置されたシナプス前部およびシナプス後部タンパク質と標準的な蛍光顕微鏡法を検出します。得られた穿刺の蛍光検出により、実験の迅速かつ公平な分析が可能になります。DetectSynは、限られた数の蛍光ニューロンよりも広い領域を分析できるため、電子顕微鏡よりも代表的な結果を提供します。さらに、DetectSynは 、インビトロ 培養ニューロンおよび固定組織スライスに対して機能します。最後に、この技術から収集されたデータを分析するための方法が提供される。全体として、DetectSynは、治療または疾患状態にわたるシナプス密度の相対的な変化を検出するための手順を提供し、従来の技術よりもアクセスしやすい。

Heaney et al.6から改変されたデータは、シナプス形成の増加が予想される実験を実証するために提示されている(メカニズムの詳細およびより詳細な議論については、6を参照されたい)。以前に、迅速な抗うつ薬が有効であるためには、阻害性代謝受容体GABAB(γ-アミノ酪酸サブタイプB)の活性化が必要であることが実証された13。さらに、以前のデータは、迅速な抗うつ薬がシナプス後マーカーを増加させることを示した14;したがって、DetectSynは、迅速な抗うつ薬がシナプス数を増加させるという仮説を検証するために使用された。
培養ニューロンにおいて、4つの条件が試験される。まず、 図2Aのトップパネルにおいて、培養ニューロンを、実験対照と同じ条件下でビヒクルで処理した。ただし、PSD95一次抗体は、DetectSynアッセイの技術的対照を...

DetectSynは、治療または疾患状態にわたる相対シナプス(シナプス前およびシナプス後関与)数の変化を測定する、偏りのない迅速な蛍光アッセイです。この技術は、培養ニューロンおよび固定組織の両方において使用することができる近接ライゲーション技術を利用する。

DetectSyn:シナプス密度の変化を検出するための迅速で偏りのない蛍光法

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

DetectSynは、近接ライゲーションアッセイ技術を利用して、シナプスの変化を迅速に特定します。また、結果を分析するためのプロトコルも提供しています。DetectSynの主な利点は、分析可能な組織の広い領域で結果が得られる速さです。まず、細胞を乱すことなく、プラスチック製のパスツールピペットでブロッキング溶液を慎重に取り除きます。それからパラフィルムで大きなプラスチック製のペトリ皿を並べる。そして鉗子を使って、カバースリップをパラフィルムに慎重に移します。60マイクロリットルの一次抗体溶液をカバースリップの上部に加え、抗体溶液がカバースリップの側面にこぼれないようにします。湿度を確保し、インキュベーション中にサンプルが乾燥するのを防ぐために、超純水を小さなペトリ皿に加え、カバースリップの周りに皿を慎重に置きます。次いで、より大きなシャーレを覆い、培養細胞を室温で1時間インキュベートする。一次抗体とのインキュベーション後、鉗子を使用してカバースリップからペーパータオルに一次抗体溶液を慎重にタップオフし、カバースリップを500マイクロリットルのPBSで満たされた元の24ウェルプレートに移します。次いで、サンプルをPBSで3回、それぞれ10分間、オービタルシェーカー上で穏やかな攪拌で洗浄する。最後の洗浄後、カバースリップを大きなペトリ皿に戻し、カバースリップの上部に40マイクロリットルの二次抗体溶液を加えます。ペトリ皿を覆い、サンプルを摂氏37度で1時間インキュベートする。ライゲーションの場合、リガーゼをコールドブロック上に保持しながら、ライゲーションストックを使用してリガーゼ1〜40を希釈し、直ちに40マイクロリットルのリガーゼミックスをカバースリップに加える。ペトリ皿を覆い、サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートする。増幅のために、増幅ストックを使用してコールドブロック上でポリメラーゼ1280を希釈する。次いで、40マイクロリットルの増幅ミックスをカバースリップに加え、サンプルを摂氏37度で100分間インキュベートする。次に、マウントのために、3マイクロリットルのマウントメディアをスライド上に落とします。カバースリップから余分な洗浄バッファーをタップオフし、細胞が取り付け媒体に下を向いた状態でカバースリップを置きます。カバースリップを所定の位置に保持するために、少量の透明なマニキュアで側面をシールします。スライスした組織を取り付けるには、組織スライスを用意したスライドに慎重に移し、平らに置きます。次いで、5〜10マイクロリットルのマウント培地を組織スライス上に滴下する。前述のように、ガラスカバースリップをティッシュスライスの上に置き、カバースリップを透明なマニキュアで密封します。共焦点顕微鏡によるデジタルイメージングでは、各蛍光チャンネルのゲイン、オフセット、レーザーパワーを調整して、バックグラウンドノイズを低減し、蛍光シグナルを強化します。蛍光シグナルが過飽和になっていないことを確認します。培養ニューロンについては、[ND取得]タブで、[ファイルに保存]をクリックします。次に、[参照] で、画像を保存するファイルを選択し、ファイル名を入力します。次に、[Z] タブで、[範囲で定義される対称モード] オプションを選択します。フォーカスを最適なマップ 2 平面に設定し、[相対] ボタンをクリックして、このフォーカル プレーンを Z スタックの中央として設定します。次に、範囲を1マイクロメートルステップで5マイクロメートルに設定し、Z移動中にアクティブなシャッターを閉じるをチェックします。「波長」タブで、「オプティカル構成」で以前に構成した集録設定でオプティカルボタンの名前を選択し、「今すぐ実行」をクリックします。スライスされた組織の場合、取得メニューから「大きな画像をスキャン」を選択し、キャプチャパネルの下で、以前に構成した集録設定の光学ボタンを選択します。また、このパネルで正しい目的を選択します。次に、エリアパネルとアイピースの下で、矢印キーを使用して、関心領域またはROIの境界を設定します。次に、[大きな画像をファイルに保存]をクリックし、画像の保存パスファイル名を作成します。最後に、セットアップパネルで、マルチチャンネルキャプチャがチェックされていることを確認します。次に、オプティカルコンフィギュレーションで以前に設定した集録設定でオプティカルボタンの名前を選択します。ImageJ で、画像メニューに移動し、[調整]、[しきい値] の順にクリックして、しきい値オプションを開きます。画像の背景が暗い場合は、[暗い背景]オプションを選択します。次に、以前に決定した最適化されたしきい値設定ごとにしきい値の上限と下限を調整し、[適用]をクリックします。培養細胞の場合、MAP2チャネルとフリーハンドROIツールを使用して、樹状突起およびソーマを含む各ニューロンのROIを描画します。スライスされた組織の場合、関心領域をカプセル化するスライス画像内にフリーハンドROIを描画する。次に、[分析]メニューを開き、[測定]をクリックしてROIの領域を取得します。各ROI内のプンタの数を検出するには、粒子分析などの自動検出ツールを使用します。[解析]メニューから[解析されたパーティクル]を選択し、穿刺サイズの直径を定義します。次に、[表示]ドロップダウンメニューから[オーバーレイマスク]オプションを選択し、[結果の表示]オプションをオンにして[OK]をクリックします。プンタの数を個々のROIの面積で割るには、結果ポップアップから各画像の結果をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。取得したファイルを特定し、データを取得してサンプリングし、ROI の領域をプンタの数で割ります。最後に、結果を対照サンプルに正規化するために、対照試料の結果を平均化し、得られたすべての試料の結果を対照の平均で除算する。GABABアゴニストであるバクロフェンは、迅速な抗うつ薬Ro-256981のインビトロ有効性に必要である。シナプス形成の増加は、白色プンタの増加によって実証される。バクロフェンがなければ、シナプス形成の増加は見られない。インビボでは、迅速な抗うつ薬の腹腔内注射は、生理食塩水対照と比較してシナプス形成の増加をもたらす。テクニカルコントロール画像にはいくつかのプンタが表示されますが、他のパネルの大きなプンタと比較して、白い仕様で示されているサイズとは通常同じではありません。さらに、これらのプンタは、ソーマ内に現れるいくつかのプンタによって実証されたのと同じ場所にはない。DetectSynは、疾患状態または薬物治療によるシナプスの変化を同定することができる。この方法は、シナプスの発達または分解に影響を与える障害を研究する研究のあらゆる分野に洞察を提供するのに役立ちます。

detectsyn-rapid-unbiased-fluorescent-method-to-detect-changes-synapse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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光学顕微鏡で学ぶシナプス前サイレントシナプス

このプロトコルは、解離神経培養および免疫細胞化学を用いて脳切片の両方シナプス数を定量化する方法を詳しく説明します。コンパートメント特異的抗体を用いて、我々は、シナプス前終末だけでなく、シナプス後部の専門のサイトにラベルを付けます。我々は、これらのマーカーによって生成された信号間の共局在のポイントとしてシナプスを定義します。...

定量シナプス：シナプス数を定量する免疫細胞ベースのアッセイ

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私たちは、機能的な神経末端での画像シナプス小胞のリサイクルへのスチリルのFM色素の使用を記載している。このプロトコルは、誘発するだけでなく、自発的な、ミニチュアシナプス活動にも適用することができる。プロトコルは、効果的に評価することができシナプス様々なイベントが展開されます。...

誘発、自発的、およびミニチュアシナプス活動中に、FM色素を用いたシナプス小胞のリサイクルの検討

この論文は、シナプトブレビン2-pHluorinコンストラクトと全反射蛍光顕微鏡を使用して、神経芽細胞腫細胞における神経伝達物質小胞動態を調査する方法を提供します。また、画像処理とデータ分析のために開発された戦略についても報告されています。...

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

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のシナプス変調を分析<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;長時間の光照射後の感光体

正確に特定および蛍光抗体法を用いた海馬スライスにおけるシナプスの分析のためのプロトコルは、この資料に記載されています。...

海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価

シナプス小胞 (SV) 培養神経細胞におけるリサイクルの光分析について述べる。このプロトコルを組み合わせて二重トランスフェクション シナプス...

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

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蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

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正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

学ぼう、近接結合アッセイ技術を用いたシナプス密度変化の迅速かつ偏りのない蛍光検出法。培養ニューロンや固定組織の広範囲な領域を効率的に解析し、神経科学および細胞生物学研究におけるシナプス動態の理解を支援します。

DetectSyn:シナプス密度の変化を検出するための迅速で偏りのない蛍光法

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