ヒト好中球と黄色ブドウ球菌バイオフィルムの間の相互作用を視覚化および定量するための標準化されたin vitroアッセイ
June 8th, 2022
本プロトコルは、好中球-バイオフィルム相互作用の研究を記載している。 黄色ブドウ球 菌バイオフィルムは in vitro で確立され、末梢血由来のヒト好中球とインキュベートされます。好中球からの酸化バースト応答を定量化し、バイオフィルム内の好中球局在を顕微鏡で測定します。
これらのプロトコルは、ヒト好中球が細菌バイオフィルムとどのように相互作用して殺すかを理解するように設計されています。目標は、これをよりよく理解し、アッセイ間の変動を制限し、ドナーからドナーへの変動からヒト好中球に固有の問題があることを理解することです。ここにリストされている技術は、特に緩く付着したバイオフィルムを使用して、ユーザーが最小限の変動で実験を実行できるように最適化されています。
さらに、これらのプロトコルは、バイオフィルムを形成する可能性のある他の微生物の研究にも適合させることができます。まず、トリプシン大豆寒天培地などの栄養豊富な寒天プレート上のストリークプレート技術を使用して、凍結保存されたストックから黄色ブドウ球菌の単離されたコロニーを取得します。96ウェルプレートの個々のウェルを滅菌水で希釈した100マイクロリットルのPLLでコーティングし、室温で30分間インキュベートします。
真空アシスト吸引トラップを使用してPLL溶液を無菌的に吸引します。ウェルを室温で一晩乾燥させます。黄色ブドウ球菌のコロニーに2%グルコースを添加したMEM-αに接種し、摂氏37度で毎分200回転で16〜18時間インキュベートすることにより、一晩培養を準備します。
50マイクロリットルを2%グルコースを添加した5ミリリットルの新鮮なMEM-αに移して、一晩培養液を希釈します。次に、対数中期が達成されるまで、毎分200回転で摂氏37度でインキュベートします。MEM-alpha を使用して、中間対数培養をOD 0.1 に正規化します。
150マイクロリットルの標準化培養液をPLL処理96ウェルプレートの各ウェルに移します。プレートを摂氏37度の加湿チャンバーで18〜20時間インキュベートします。上清を吸引して浮遊細胞を除去する。
残りのバイオマスを150マイクロリットルのHBSSで穏やかに洗浄し、付着していない細胞を取り除きます。少なくとも2回繰り返して、すべての浮遊細胞を取り除きます。洗浄したバイオフィルムにHBSSで希釈した100マイクロリットルの20%正常ヒト血清を滴下し、摂氏37度で30分間インキュベートしてバイオフィルムをオプソニン化します。
血清溶液を吸引し、バイオフィルムを150マイクロリットルのHBSSで滴下して洗浄する。HBSSを吸引し、オプソニン化されたバイオフィルムを含むウェルを残します。HBSSに再懸濁した好中球にルミノールを加えて、最終濃度5マイクロモルのルミノールを作ります。
この溶液は、グループAおよびC.Moreにすぐに使用でき、ルミノールと混合した好中球をオプソニン化されたバイオフィルムを含むウェルに追加します。グループDの場合、好中球を含まない別のチューブにHBSS中の50マイクロモルのルミノール溶液を調製し、バイオフィルムを含むウェルに追加します。ルミノールと混合した350マイクロリットルの好中球を分注し、ミリリットルあたり500ナノグラムの最終濃度でPMAを混合物に加える。
グループBの場合、この混合物からの好中球をバイオフィルムのないウェルに追加します。これはポジティブコントロールとして機能します。プレートを270 RCFで摂氏4度で30秒間遠心分離します。
プレートリーダーが摂氏37度に設定されていることを確認し、発光と運動を3分間隔で60分間読み取ります。プレートをプレートリーダーに入れて、好中球によるROS産生を60分間測定します。顕微鏡イメージングを容易にするために、GFPを発現するUSA300などの黄色ブドウ球菌の蛍光株を使用します。
好中球を100マイクロモルのBCDで、摂氏37度のロッカーで5%大気中の二酸化炭素で30分間インキュベートします。サンプルが暗闇でインキュベートされていることを確認し、光への露出を制限します。余分なBCDを洗浄するには、好中球を270 RCFで5分間遠心分離し、上清を吸引します。
好中球を新鮮なHBSSに再懸濁します。次に、エチジウムホモ二量体-1をBCD染色好中球に最終濃度4マイクロモルで添加し、好中球と細菌の死を監視します。HBSSでバイオフィルムを洗浄し、マイクロスライドで成長させた黄色ブドウ球バイオフィルムに150マイクロリットルの好中球を追加します。
マイクロスライドを加湿チャンバーで30分間インキュベートします。細菌細胞の数は、18時間のバイオフィルムプレーティングから得られた細胞数に基づく。蛍光色素に対応する蛍光チャネル、またはタンパク質の励起波長と発光波長を使用して、好中球バイオフィルム相互作用を画像化します。
細菌増殖培地は、インキュベーション期間の30分後に好中球の生存率を約60%に最小化しました。しかし、哺乳類細胞培養培地は好中球の生存率に影響を与えず、黄色ブドウ球バイオフィルムの成長をサポートすることもできます。対照として用いたPMAで処理した好中球は、ROS産生の増加を示した。
バイオフィルムが存在しない場合、PMAで処理された好中球は堅牢なROS産生を示した。黄色ブドウ球菌バイオフィルムの存在下では、PMAで処理された好中球による全体的なROS産生は減少したが、PMAの非存在下では、好中球はバイオフィルムとの相互作用のみに依存し、ROS産生をさらに減少させた。広視野蛍光顕微鏡は、多くの好中球が表面に局在し、いくつかは黄色ブドウ球バイオフィルム内にあることを明らかにしました。
好中球と相互作用する黄色ブドウ球菌細胞のほとんどは死んでいましたが、LIVE/DEAD染色によって決定されたように、いくつかは生きたままでした。エチジウムホモ二量体-1染色されたバイオフィルムは、バイオフィルム内の死んだ黄色ブドウ球菌集団の一部を明らかにした。30分間のインキュベーション後にバイオフィルムと好中球を洗浄して非付着好中球を除去する効果は、死んだ好中球の約33%がまだバイオフィルムに付着していることが明らかになりました。
ここにリストされているプロトコルは、食作用や好中球がバイオフィルムに遭遇したときの好中球細胞外トラップの形成など、好中球の他の機能をさらに研究するためにも使用できます。
概要
このプロトコルは、ヒト好中球と黄色ブドウ球菌バイオフィルムの相互作用を調査します。好中球の酸化バースト反応を定量化し、顕微鏡を用いてバイオフィルム内での局在化を検討します。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 微生物学
- 免疫学
背景
- 好中球は細菌感染に対する免疫応答において重要な役割を果たします。
- バイオフィルムは、免疫応答を回避できる細菌によって形成される複雑な構造です。
- 好中球とバイオフィルムの相互作用を理解することで、治療戦略に情報を提供できます。
- 好中球応答の変動は、ドナーの違いから生じる可能性があります。
研究目的
- 好中球が細菌バイオフィルムとどのように相互作用し、除去するかを解明すること。
- 変動を最小限に抑えるために実験プロトコルを標準化すること。
- 他のバイオフィルムを形成する微生物を研究するための技術を適応させること。
使用された方法
- 96ウェルプレート上での黄色ブドウ球菌コロニーの分離とバイオフィルムの形成。
- ヒト血清によるバイオフィルムのオプソニン化と好中球との相互作用の評価。
- ルミノールを用いた活性酸素種（ROS）産生の測定。
- 好中球の局在化と細菌の生存能を視覚化するための顕微鏡検査。
主要な結果
- 好中球はバイオフィルム表面と内部で様々な局在化を示しました。
- 好中球と相互作用する黄色ブドウ球菌のほとんどは死んでおり、効果的な好中球の作用を示しています。
- ROSの産生はバイオフィルムの存在とPMA処理によって影響を受けました。
- 洗浄後、死んだ好中球の約33%がバイオフィルムに付着したままでした。
結論
- この研究は、バイオフィルムに対する好中球の応答に関する洞察を提供します。
- 標準化されたプロトコルは、将来の研究における再現性を向上させることができます。
- 結果は、バイオフィルム関連感染症の治療法開発に影響を与える可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Standardized in vitro assays for quantifying human neutrophil interactions with Staphylococcus aureus biofilms address a critical gap in understanding immune evasion by biofilm-forming pathogens. These protocols enable reproducible measurement of neutrophil responses, supporting predictive confidence in early-stage anti-infective discovery and mechanistic de-risking of host-pathogen interactions. The approach enhances portfolio decision-making by providing robust, quantitative data on immune cell efficacy against clinically relevant biofilm models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neutrophil-mediated killing mechanisms against biofilm-embedded bacteria.
- Supports biological de-risking by quantifying immune cell efficacy in disease-relevant biofilm systems.
- Facilitates functional target validation for anti-biofilm therapeutic strategies.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible assays for evaluating immune-biofilm interactions.
- Delivers quantitative ROS and cell viability readouts for reliable compound or biologic screening.
- Establishes assay conditions that minimize donor and procedural variability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with in vivo infection models by using human-derived neutrophils and clinically relevant biofilms.
- Supports translational biomarker development by quantifying immune responses to biofilm challenges.
- Enables risk-adjusted advancement of anti-infective candidates targeting biofilm-associated infections.
Pipeline & Workflow Integration
These assays position within the discovery continuum from early immune-pathogen interaction studies to preclinical validation of anti-biofilm interventions.
- Discovery Biology: Quantifies neutrophil functional responses and clarifies immune evasion mechanisms in biofilm contexts.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for comparing immune-modulating compounds or biologics.
- Analytics: Enables statistical comparison of ROS production and cell viability across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro immune response data with in vivo infection outcomes when supported by further studies.
- Enterprise Reuse: Protocols are adaptable for other biofilm-forming pathogens, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immune-targeted anti-infective strategies.
- Operational Value: Standardizes immune-biofilm assays for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing robust, quantitative immune efficacy data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates targeting biofilm-associated infections.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neutrophil isolation, biofilm culture, and fluorescence microscopy.
- Needs access to plate readers for ROS quantification and imaging platforms for cell localization studies.
- Demands cross-team standardization to minimize donor and procedural variability.
- Adaptable to other microbial biofilms with protocol optimization.
- Dependent on quality of human neutrophil preparations and biofilm consistency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Preparation of In Vitro Biofilm
2:34
Measurement of ROS Production by Neutrophils
4:14
Imaging the Biofilm-Neutrophil Interactions
5:31
Results: Assessing Neutrophils and Biofilms Interactions via Standardized In Vitro Assays
6:56
Conclusion
