Name: 生存可能な単一細胞を単離するための膵臓組織解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶ膵臓組織解離法により、正常組織や前悪性病変、腫瘍から生存可能な単一細胞を単離できます。この手法は膵がん研究や新規バイオマーカー探索に貢献します。

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データ解析に協力してくださったAvital Sarusi-Portuguez博士と、以前の研究でプロトコルを確立するための支援をしてくれたDror Kolodkin-Gal博士に感謝します。パルナス研究室の過去および現在のすべてのメンバーに感謝します。編集に協力してくださったGillian Kay博士とMichael Kanovsky博士に感謝します。このプロジェクトは、イスラエル科学財団の助成金(No.526/18 O.P.)、Alex U. Soyka Program、およびIsrael Cancer Research Fund(Research Career Development Award)の助成金を受けています。

ヘブライ大学(イスラエル、エルサレム)とハダサ医療センター(イスラエル、エルサレム)の合同倫理委員会(動物実験委員会)は、動物福祉のための研究計画書(MD-18-15417-5「マウスの膵臓癌における組織動態」)を承認し、ここで提示されたプロトコルは、動物実験と研究に関連するすべての倫理規則に準拠しています。ヘブライ大学は、実験動物ケアの評価と認定のための協会国際認定機関です。
注:マウス株ストック#007908、ストック#019378、およびストック#008179は、ジャクソンの研究室から入手しました。PRT(Kras+/LSL-G12D;Ptf1a-CreERです。Rosa26LSL-tdTomato)マウスは、上記の系統を交配して作製した。この研究には、生後6週間から15ヶ月までの男女のマウスが用いられた。タモキシフェンは、粉末をコーン油に溶解することによって調製した。成体マウス(6〜8週齢、雌雄)に、0日目と2日目に400 mg / kgの用量でタモキシフェンを皮下注射し、注射後に週2回検査しました。.腫瘍は内部に位置していたため、測定することはできなかった。したがって、安楽死は、倫理的プロトコルに従って異常な臨床徴候が観察された場合に行われました。マウスは、タモキシフェン導入後のさまざまな時点で、イソフルランと子宮頸部脱臼を使用して安楽死させました。
1.膵臓解剖
注:抽出中の収量を最適化し、良好な細胞生存率を確保するためには、迅速な解剖が重要です。膵臓の分離に必要な時間を短縮するには、マウスを安楽死させる前に、すべての器具と機器を氷上で準備する必要があります。
<ol><li>CO2窒息によりマウスを安楽死させ、子宮頸部脱臼を用いて検証する。このステップから、すべての手順は滅菌された解剖器具で実行する必要があります。</li>
	<li>マウスを固定し、腹部に70%エタノールをスプレーします。ハサミと鉗子で陰部を2.5cmのV字状に切開し、上に向かって腹腔を全開にします。</li>
	<li>マウスの左側にある胃を見つけます。脾臓の近くにある膵臓を見つけます。2つの鉗子を使用して、膵臓を胃と十二指腸から分離します(裂け目なし)。続けて、膵臓を小腸、空腸、回腸から分離します。</li>
	<li>膵臓をマウスの右側に移動します。膵臓と胸腔の間の残りの接続を鉗子で分離して、膵臓と付着した脾臓を完全に剥離します。</li>
	<li>膵臓を取り出し、氷の上のペトリ皿に広げて検査します。 注意: このステップでは、細胞の汚染を避けるために、膵臓のみを除去し、腸間膜脂肪組織または膵臓と他の隣接する組織を除去しないように注意する必要があります。</li>
</ol>2.膵臓の酵素的および機械的解離
<ol><li>以下のバッファーをあらかじめ用意しておきます。<ol><li>解離緩衝液 1:各サンプルに 4 mL のトリプシン C + 6 mL のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)( 表 1 を参照)。</li>
		<li>解離緩衝液 2:9 mL のハンクス平衡塩溶液(HBSS)1x;4%ウシ血清アルブミン(BSA);1 mL のコラゲナーゼ P (10 mg/mL);200 μL のトリプシン阻害剤 (10 mg/mL);および 200 μL の DNase I(10 mg/mL)( 表 1 を参照)。</li>
		<li>洗浄バッファー:50 mLのHBSS 1x;2gのBSA。1 mLのトリプシン阻害剤(10 mg / mL);DNase 1 1 1 mL(10 mg/mL)を添加します。</li>
		<li>酵素活性停止液:5%ウシ胎児血清(FBS)とDNase I(0.2mg/mL)150gを含有するHBSS 1x。</li>
	</ol></li>
	<li>膵臓を氷上の50mLチューブに入れます。HBSS 1xの10%FBSで膵臓をすすぎます。脂肪組織が浮遊し、膵臓が沈みます。これは、膵臓にまだ付着している汚染された白色脂肪組織を視覚化し、迅速に除去する簡単な方法です。</li>
	<li>マウスの膵臓組織を、氷上で5 mLのHBSS 1xを含む滅菌シャーレに移します。膵臓を1〜3mm3 の小片に、Noyesハサミとメスを使用して切断します(図2A)。複数のサンプルの場合、サンプルは10%FBS / HBSS 1xで氷上に保管する必要があります。</li>
	<li>組織を遠心分離管に移します。350 x g 、4°C、5分間遠心分離します。上清を吸引して廃棄し、細胞片と血球を除去します。</li>
	<li>0.02%トリプシンC-0.05%EDTAを含む解離バッファー1に、37°Cで10分間、撹拌(180rpm)しながら再懸濁します。直ちに10%FBS/ダルベッコ変性イーグル培地(DMEM)で洗浄します。4°C、350gで5分間遠心分離します。</li>
	<li>ペレットを10 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、350 x g で4°Cで5分間遠心分離してから、次の解離ステップを行って再度洗浄します。</li>
	<li>膵臓を解離バッファー2で37°Cで15分間、撹拌(180rpm)しながらインキュベートします。</li>
	<li>15分後、サイズを小さくした滅菌ピペット(25、10、5 mLの血清ピペット)で膵臓断片を上下に激しくピペッティングして機械的解離を行い、37°Cに戻します。<ol><li>さらに5分後、機械的解離を繰り返し、光学顕微鏡を使用して、単一細胞懸濁液の量に応じて解離をモニターします。通常、この段階で懸濁液の90%未満が単離された単一細胞で構成されている場合、より長いインキュベーション時間が必要です。トリパンブルーを使用して、細胞の生存率をモニターします。</li>
		<li>インキュベーションを続行し、5分ごとに解離を検出するためのサンプルを採取します。 注:合計インキュベーション時間は組織によって異なり、サンプルによって異なる場合があります。インキュベーションと組織の解離は、細胞の90%が単一細胞に分離されたとき、または生存率の低下が検出されたときに終了する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>膵臓組織が十分に解離した後(膵臓断片の消失と溶液の濁度の増加に対応)(図2)、酵素活性停止液で4°Cで5分間2回洗浄して酵素反応を停止します。 このステップから、細胞懸濁液を氷上に保管します。</li>
	<li>細胞懸濁液を70μmのナイロンメッシュに通し、顕微鏡で細胞の生存率を確認します。ナイロンメッシュのサイズが小さいと、細胞の生存率が低下する可能性があります。</li>
	<li>ペレットを再懸濁し、5〜10 mLの氷冷緩衝洗浄液で洗浄します。セルを数えます。</li>
	<li>複数の赤血球が観察された場合は、赤血球溶解緩衝液で室温で2分間処理します。凝集塊が観察された場合は、ステップ2.5で説明したように、サンプルをトリプシンで再度処理する必要があります。生存率は顕微鏡下のトリパンブルーで検出し、生存率が80%未満の場合は、MACS MSカラムを備えた磁気活性化細胞ソーティング(MACS)死細胞除去キットを使用して生細胞を単離する必要があります( 表1を参照)。</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2019.</a> CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Author+correction%3A+single-cell+RNA-seq+highlights+intra-tumoral+heterogeneity+and+malignant+progression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cell Research. 29 (9), 777(2019).</li>
<li>Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+progression+in+the+pancreatic+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Genetic progression in the pancreatic ducts.</a> The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).</li>
<li>Schlesinger, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+of+pancreatic+preinvasive+lesions+and+cancer+reveal+acinar+metaplastic+cells%27+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity.</a> Nature Communications. 11 (1), 4516(2020).</li>
<li>Kolodkin-Gal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senolytic+elimination+of+Cox2-expressing+senescent+cells+inhibits+the+growth+of+premalignant+pancreatic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions.</a> Gut. 71 (2), 345-355 (2021).</li>
<li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Sox9-dependent+acinar-to-ductal+reprogramming+as+the+principal+mechanism+for+initiation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).</li>
<li>Elyada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+single-cell+analysis+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+reveals+antigen-presenting+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts.</a> Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).</li>
<li>Bernard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+pancreatic+cancer+precursors+demonstrates+epithelial+and+microenvironmental+heterogeneity+as+an+early+event+in+neoplastic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression.</a> Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).</li>
<li>Moncada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+microarray-based+spatial+transcriptomics+and+single-cell+RNA-seq+reveals+tissue+architecture+in+pancreatic+ductal+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas.</a> Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).</li>
<li>Hwang, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+spatial+transcriptome+profiling+of+pancreatic+cancer+identifies+multicellular+dynamics+associated+with+neoadjuvant+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment.</a> Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).</li>
<li>Cui Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+drivers+and+transitional+cell+populations+cooperate+with+the+microenvironment+in+untreated+and+chemo-resistant+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
</ol>

著者らは、競合する利害関係がないことを宣言します。

この記事では、膵臓組織解離のプロトコルを紹介します。このプロトコルはシンプルで使いやすく、固形腫瘍を含む悪性腫瘍プロセス中のさまざまな段階で、膵臓組織から生細胞を分離するためのツールを提供します。以前の研究では、膵臓を消化するためにさまざまな種類のコラゲナーゼが使用されました8,9。コラゲナーゼDなどの非常に強力なコラゲナーゼを使用すると、免疫細胞の集団が多くなり、上皮細胞の割合が低くなります。コラゲナーゼPの使用により、無傷または腫瘍の膵組織に適した膵臓消化が可能になります。
私たちの観察に基づいて、すべての細胞タイプを単離することができます。私たちは以前、免疫組織化学5を用いて免疫T細胞の浸潤を検証しました。分析で観察された相対的な細胞数は、壊れやすく、したがって過小評価されていた腺房細胞を除いて、組織内の細胞の実際の表現に適切な近似であると考えています。組織内の細胞タイプの正確な比率が必要な場合は、免疫組織化学ま...

膵管腺がん(PDAC)は、最も侵攻性のがんの1つです1。臨床的証拠は、PDACがKRASがん原遺伝子2の変異によって引き起こされる腺房細胞を含む外分泌系細胞から長年にわたって発生するという考えを支持しています。
膵臓腫瘍には多くの異なる種類の細胞が含まれ、悪性細胞は腫瘍量の20%〜50%にしかカウントされないことが実証されています3。さまざまな種類の細胞が上皮細胞と相互作用し、その形質転換をサポートし、腫瘍の形成と増殖を促進します。初期のイベントは腺房化生を引き起こし、膵臓上皮内腫瘍(PanIN)と呼ばれる顕微鏡的病変を引き起こし、場合によってはPDAC4に発展する可能性があります。
これらの相互作用を調査し、重要なシグナルを標的にすることが非常に重要になっています。シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)は、シングルセルの分解能で遺伝子発現を明らかにする強力な手法であり、それによって上皮細胞が受ける変化を追跡し、膵臓がんの発生の調査を可能にします。 
単一細胞への組織の解剖と消化は、scRNA-seq実験の最初の段階です。いくつかの要因により、膵臓組織の消化が特に困難になります:i)腺房細胞は膵臓の90%以上を占め、腺房細胞には、RNAベースのライブラリの質を低下させるプロテアーゼやRNaseなどの消化酵素が大量に含まれています。(ii)腺房細胞は非常に敏感であり、標準的なプロトコルを使用すると溶解する可能性があります。(iii)腺房細胞は、少数の遺伝子を非常に高いレベルで発現します。したがって、実験中にこれらの細胞を溶解すると、他の細胞の観察された遺伝子発現プロファイルが汚染される可能性があります。(iv)腫瘍から回収された膵臓組織は線維形成性であり、細胞を傷つけずに解剖することは困難です。したがって、すべての細胞タイプで高い生存率を維持する必要がありますが、腺房細胞の数と感度が大きいため、複雑さが増します。これらの要因により、scRNA-seq実験に必要な80%以上の生存率と凝集塊のない単一細胞懸濁液の実現が困難になります。 
ここでは、トリプシンCとコラゲナーゼPを使用し、頻繁な組織モニタリングとともにプロトコルを開発しました。これにより、単一細胞への解離がサポートされ、高い生存率が維持され、scRNA-seq実験の成功を裏付けます5,6。

<table><tbody><tr><td>試薬またはリソース</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &micro;mナイロンメッシュ&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>キャット##431751</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>ネコ#A7906</td><td></td></tr>コ<tr><td>ラゲナーゼP</td><td>ロシュ</td><td>ネコ#11213857001</td><td></td></tr><tr><td>クリティカルコマーシャルアッセイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>ネコ#MBD0015</td><td></td></tr>ド<tr><td>ナーゼI</td><td>ロシュ</td><td>ネコ#10104159001</td><td></td></tr><tr><td>実験モデル:生物/株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 南米</td><td>サーモフィッシャー</td><td>猫#10270106</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス バランス塩溶液</td><td>生物産業</td><td>猫#02-018-1A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>KRASLSL-G12Dマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>JAX008179</td><td></td></tr><tr><td>MACS死細胞除去キット</td><td>ミルテニーバイオテック</td><td>猫#130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>生物産業</td><td>猫#02-023-1A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ptf1a-CreER mice</td><td>ジャクソン研究所</td><td>JAX019378</td><td></td></tr><tr><td>Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice</td><td>ジャクソン研究所</td><td>JAX007908</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン C-EDTA 0.05%</td><td>生物産業</td><td>cat# 03-053-1A</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤</td><td>ロシュ</td><td>キャット#T6522</td><td></td></tr></tbody></table>

生存可能な単一細胞を単離するための膵臓組織解剖

Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells

膵臓には、ホルモンを産生・分泌する内分泌系と、膵臓の約90%を占め、消化酵素を産生・分泌する細胞を含む外分泌系の2つの主要なシステムがあります。消化酵素は膵腺房細胞で産生され、接合菌と呼ばれる小胞に蓄えられ、膵管 を介して 十二指腸に放出され、代謝プロセスを開始します。腺房細胞によって産生される酵素は、細胞を殺したり、無細胞RNAを分解したりする可能性があります。さらに、腺房細胞は壊れやすく、一般的な解離プロトコルでは、多数の死細胞と無細胞プロテアーゼおよびRNaseが生じます。したがって、膵臓組織の消化における最大の課題の1つは、無傷で生存可能な細胞、特に腺房細胞を回復させることです。この記事で紹介するプロトコルは、このニーズを満たすために開発した2段階の方法を示しています。プロトコルが正常な膵臓、前悪性病変を含んでいる膵臓、または多数の間質および免疫細胞を含んでいる膵臓の腫瘍を消化するのに使用することができる。

最近発表された研究5では、上記のプロトコルを適用して、マウスモデルを使用してPDAC開発の初期段階を調査しました。マウスは、タモキシフェン注射後に腺房細胞で恒常的に活性なKRASを発現させるカセットPtf1a-CreER、LSL-Kras-G12D、LSL-tdTomato7を含むように遺伝子操作されました。 
子宮頸部脱臼後(マウスの倫理的プロトコルによる)、膵臓を切除し、上記のプロトコルを適用しました( 図1およびプロトコルを参照)。
解離プロトコルを最適化するために、解離は、トリプシンCによる組織のプレインキュベーションの有無にかかわらず行った。トリプシンCとのプレインキュベーションは、生存率に影響を与えることなく解離を促進することがわかりました。さらに、コラゲナーゼD、コラゲナ...

膵臓の転生細胞は、膵臓腫瘍を引き起こす悪性細胞の前駆体です。しかし、無傷の生膵細胞を単離することは困難です。ここでは、膵臓組織を解離するための効率的な方法を紹介します。その後、細胞はシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)または2次元または3次元の共培養に使用できます。

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for ...

実証された膵臓組織解離プロトコルはシンプルで、固形腫瘍を含む悪性腫瘍プロセス中のさまざまな段階で、膵臓組織から生細胞を分離するためのツールを提供します。無傷で生存可能な房状細胞を回復させることは大きな課題です。プロトコルは正常な膵臓、前悪性の損害がある膵臓、または多数の間質および免疫細胞を含んでいる膵臓の腫瘍から生存可能な単一セルを回復できる。ヒトの膵臓腫瘍や炎症を起こした膵臓を解剖するためにこのプロトコルを使用することは、これらの疾患を調査して新しいバイオマーカーや治療法を見つけるのに役立つ可能性があります。この方法は使いやすく、最小限の練習で望ましい結果を得ることができます。このビデオは、プロトコルの詳細を確認するのに役立ちます。解剖を開始する前に、すべての器具と機器を氷上に準備しておいてください。安楽死させたマウスを固定した後、腹部に70%エタノールをスプレーします。ハサミと鉗子を使用して、動物の生殖器領域に2.5センチメートルのV字型切開を行い、上向きに進んで腹腔を完全に開きます。マウスの左側にある胃と、脾臓の近くにある膵臓を見つけます。2つの鉗子を使用して、膵臓を胃と十二指腸から引き裂かずに分離します。続けて、膵臓を小腸、空腸、回腸から分離します。膵臓を右側に移動し、膵臓と胸腔の間の残りの接続を鉗子で分離して、膵臓と付着した脾臓を完全に剥離します。腸間膜脂肪やその他の隣接組織を含まない膵臓を慎重に摘出し、氷上のペトリ皿に広げて検査します。本文中に記載されている組成に従って、解離緩衝液1、2、洗浄緩衝液、酵素活性停止液を予め調製する。膵臓を氷上の50ミリリットルのチューブに入れ、10%ウシ胎児血清(FBS)とハンク平衡塩溶液(HBSS)ですすいでください。脂肪が浮き、膵臓が沈みます。これは、膵臓にまだ付着している汚染された白色脂肪組織を視覚化し、迅速に除去する簡単な方法です。次に、マウスの膵臓組織を、5ミリリットルのHBSSを含む滅菌シャーレに移し、氷上で切断するまで保管します。Noyesのはさみとメスを使用して、膵臓を1〜3立方ミリメートルの小片に切ります。組織を遠心チューブに移した後、350G、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を吸引して廃棄し、細胞片と血球を除去します。0.02%トリプシン-Cおよび0.05%EDTAを含む解離バッファー1に断片を再懸濁し、摂氏37度で10分間攪拌します。直ちに10%FBSとDulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)で洗浄し、350G、摂氏4度で5分間遠心分離します。ペレットを10ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁し、次の解離ステップの前に5分間遠心分離することにより、再度洗浄します。膵臓を解離バッファー2で摂氏37度で15分間インキュベートし、毎分180回転で攪拌します。15分後、滅菌血清ピペットを使用して膵臓断片を上下に10回激しくピペッティングすることにより、機械的解離を行います。25、10、5ミリリットルから始めて、サイズが小さくなるピペットを使用して繰り返します。サンプルをインキュベートして摂氏37度にします。光学顕微鏡を使用して、懸濁液中の単一細胞の量に応じて解離をモニターします。トリパンブルーを使用して細胞生存率をモニターします。インキュベーションを継続し、5分ごとにサンプルを採取して解離を確認します。細胞の90%が単一細胞に分離されるまでインキュベートします。膵臓組織が十分に解離した後、膵臓断片の消失および溶液の濁度の増加によって示され、酵素活性停止溶液で摂氏4度で5分間2回洗浄することにより酵素反応を停止する。このステップから、細胞懸濁液を氷上に保管します。細胞懸濁液を70ミクロンのナイロンメッシュに通します。ナイロンメッシュサイズが小さいと、細胞の生存率が低下する可能性があります。顕微鏡で細胞の生存率を確認します。細胞を数える前に、ペレットを再懸濁し、5〜10ミリリットルの氷冷緩衝洗浄液で洗浄します。複数の赤血球が観察された場合は、赤血球溶解緩衝液で室温で2分間細胞を処理します。凝集塊が観察された場合は、前述のように、サンプルをトリプシンで再度処理する必要があります。生存率が80%未満の場合は、磁気活性化セルソーティング、またはMACS MSカラムを備えたMACS死細胞除去キットを使用して生細胞を単離する必要があります。単離された膵臓組織の赤色は、腺房細胞におけるtdTomatoの発現に起因しています。解離の初期段階では、単離された細胞の数が少なく、多数の凝集塊がありました。その後、生細胞の数を減らすことなく、単離された生細胞が得られました。インキュベーションが長くなると、細胞の生存率が低下しました。tdTomato陽性細胞は、蛍光活性化細胞選別法を用いて推定した。穏やかな解離プロトコルは、複数の細胞タイプの回収をサポートし、高い生存率で、目的の細胞タイプの細胞選別をフォローアップすることができました。生細胞から死細胞までのカウントは、血球計算盤を使用して行いました。凍結した膵臓切片の蛍光画像は、tdTomato陽性の房状細胞を示しました。シングルセルRNAシーケンシングにより、すべての時点で切除された各組織において、蛍光活性化セルソーティングで検出されたすべての細胞タイプが検出されることが確認されました。腺房細胞におけるカルボキシペプチダーゼ1(CPA1)の発現が研究され、他の細胞タイプのトランスクリプトームとのコンタミネーションが最小限に抑えられていることが示されました。インキュベーション時間が長くなると細胞の生存率が低下するため、サンプルをモニターし、顕微鏡下で数分ごとに組織の解離と細胞の生存率を観察することが重要です。細胞単離プロトコルは、単一細胞RNAシーケンシング、細胞培養、またはオルガノイドの出発物質として使用できます。この技術により、膵臓がんがどのように発生するかを調べ、炎症組織やがん組織に浸潤する細胞間の相互作用を調べることができます。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

膵島は、ランゲルハンス島とも呼ばれ、グルコース調節やその他の重要な生物学的機能のためのホルモンを産生する内分泌細胞のクラスターです。このプロトコルでは、最初にAmpulla of...

コラゲナーゼ灌流による膵島単離:膵島細胞を単離するための酵素的方法

レーザーマイクロダイセクションでは、実質の微量から選択された細胞の回復を可能にする技術です。ここでは、トランスクリプトーム研究のために使用される手術標本からヒト膵島を取得するためのプロトコルを記述します。我々のプロトコルは、このように彼らのコレクションを容易にして、ヒトβ細胞の内因自家蛍光を向上させます。...

手術標本からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクションのために改良されたプロトコル

ランゲルハンス単離したマウスの膵島を用いたin vitroβ細胞機能をアッセイすることは、糖尿病の病態と治療薬の研究に重要な要素である。多くの下流のアプリケーションが利用可能であるが、このプロトコルは、具体的にはβ細胞機能を決定する本質的なパラメータとして、細胞内サイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）の測定を記載する。...

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

我々は、新生児マウスから無傷の膵島を単離するために、本明細書のプロトコルを記述します。膵臓は、部分的に洗浄し、ハンドピッキング続いて、コラゲナーゼで消化しました。 20から80膵島クラスタは、いくつかの島の研究に適しており、新たに生まれたマウスから膵臓ごとに取得することができます。...

新生児マウスの膵臓からの機能性膵島の効果的な分離

ここでは、間葉系細胞の単離に着目し、胚、新生児および成体マウス組織からの膵臓微小環境内の細胞を単離するための方法を記載します。この方法は、膵臓の発達、機能、及び腫瘍形成を調節する外因性シグナルを解明するために、細胞遺伝子発現およびタンパク質分泌のプロファイリングを可能にします。...

フローサイトメトリーによる膵臓間葉の細胞を単離と解析

この島分離プロトコルは、外分泌組織を消化するコラゲナーゼ注射の新しい経路と、マウスから島を精製するための簡略化された勾配手順を説明した。これは、酵素消化、勾配分離/精製、およびアイレット手摘みを含みます。分離に成功すると、マウスあたり250~350の高品質で完全に機能する島が生じます。...

マウスからの膵島分離のための簡単な高効率プロトコル

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

このプロトコルは、全膵臓からのマウス内皮細胞の単離を説明しています。...

マウス膵臓内皮細胞の単離

本研究は、マウス膵臓から機能的な一次膵島および腺皮細胞を効率的に抽出する簡略化された方法を開発し、急性膵炎誘発性糖尿病の病因における細胞間コミュニケーションの研究に貴重なツールを提供しました。...

マウスから一次膵島および一次膵臓細胞を同時に分離するための簡単かつ迅速な方法

このプロトコルは、ルイスラット膵島の外科的収穫、酵素的消化、密度勾配精製のための標準化された方法を説明し、移植や in vitro...

酵素による消化および密度-勾配分離を用いたルイスラットからの膵島の分離と精製

学ぶ膵臓組織解離法により、正常組織や前悪性病変、腫瘍から生存可能な単一細胞を単離できます。この手法は膵がん研究や新規バイオマーカー探索に貢献します。

生存可能な単一細胞を単離するための膵臓組織解剖

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