静電容量式バイオセンサを用いた動的マルチパラメータ血小板機能評価

私たちは、膜容量センサーを使用して半硬質微小環境で血小板を活性化することにより、現在のアッセイの限界に対処するために、生理学的環境で血小板機能を評価するアッセイを設計しています。このアッセイは、血小板数、刺激強度、および活性化経路を測定します。このツールは、止血中の血小板メカニズムを研究するための包括的なアプローチを提供します。

私たちのプロトコルは、生理学的条件下で単一のアッセイで血小板の複数のパラメータを評価できます。このプロトコルの改善と、他の止血評価センサーの開発に注力します。まず、標準的なCADレイアウトソフトウェアを使用して、原稿に記載されている微細加工プロセス用の4インチシリコンウェーハ基板用のチーム膜キャパシタンスチップ(MCC)のレイアウトを設計します。

バイオ機能化のためには、TMCCの検出電極を酸素プラズマを用いて100ワットで45秒間洗浄します。200プルーフエタノール中のDo Decanal溶液をTMCCs上のサンプルウェルに加え、乾燥窒素で満たされた容器にTMCCsを入れます。

容器を密封し、パラフィルムで24〜48時間包みます。2日後、TMCCの金表面を脱イオン水と200プルーフエタノールですすいでください。TMCCを窒素ガスで室温で乾燥させます。

TMCCのサンプルウェルにPBS中のヒトフィブロネクチン溶液を添加し、37°Cで2〜8時間インキュベートします。キャパシタンスセンサーのセットアップには、マイクロポジショナーとニードルプローブを備えたLCRメーターを使用して、センサーとの電気的接触を確立します。3Dプリントされたプラスチック製の固定具を使用して、TMCCとBMCCをしっかりと配置します。

TMCCをBMCC上に正確に位置合わせし、コンデンサを形成するために、底面の固定具にXY軸にストッパーが装備されていることを確認してください。100 キロヘルツで 0.5 ボルトの正弦波信号を 8 ヘルツのサンプリング レートで印加します。濃縮された多血小板血漿(CPRP)を得るには、ヒトの血液サンプルを遠心分離します。

CPRPを滅菌容器に移し、血小板数を測定します。阻害剤の研究では、CPRPをTyrodeの緩衝液中の事前定義された濃度のアスピリンとインキュベートします。血小板機能アッセイでは、3DプリントされたフィクスチャでTMCCとBMCCを組み立てます。

組み立てたMCCのベースライン静電容量を5分間測定し、TMCCのサンプルウェルに45マイクロリットルのCPRPを加え、血小板がTMCCのフィブロネクチン被覆電極に付着するまで30分間待ちます。次に、付着した血小板を乱さずにサンプルウェルから30マイクロリットルのCPRPを取り出し、ウェルにタイロード緩衝液を補充します。最後の洗浄後、10マイクロリットルのアゴニスト溶液を所望の濃度で加え、サンプルを80分間平衡化します。

30分間の接着後の静電容量の最大変化を測定して、デルタCの接着を決定します。活性化フェーズでは、デルタC活性化と呼ばれる静電容量の最大変化を測定します。活性化後200秒から300秒の間の静電容量曲線の傾きを計算して、S活性化を決定します。

テューキーの術後検定で分散分析を使用して統計分析を実行し、グループ間で結果を比較します。Shapiro-Wilk 適合度を使用して、正規分布を検定します。血小板数があらかじめ決められたCPRP溶液は、接着中に静電容量が直線的に減少することを示しました。

トロンビン活性化後、指数関数的な定常状態の減少が観察されました。デルタC接着値は、血小板数の範囲にわたって血小板数と強い相関を示し、1.3ミリモルのアスピリン濃度で有意に減少しました。血小板刺激後の静電容量の指数関数的減少率は、細胞濃度とともに増加しました。

また、高濃度化に伴い静電容量損失の大きさも大きくなり、デルタCの活性化に明確な上昇傾向が見られました。S活性化と血小板数についても同様の傾向が観察されました。アスピリンの投与量が増えると、静電容量、デルタC活性化、およびS活性化は減少傾向を示しました。

高用量と中用量の間でS活性化に統計的に有意な差が観察されましたが、デルタC活性化には有意差は見られませんでした。.トロンビンで活性化されたCPRPサンプルの静電容量信号は、トロンビン濃度の増加とともに静電容量の減少がより顕著になることを示しました。デルタC活性化とS活性化はどちらも、トロンビンレベルで統計的に有意な傾向を示しました。.