Name: ポリソームプロファイルを用いた熱ストレス下での翻訳効率試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学ぼう、ポリソームプロファイルを用いて熱ストレス下のArabidopsis thalianaにおける翻訳効率を解析する方法。スパイクインノーマライゼーションを活用した標準化されたプロトコルで、植物のストレス耐性メカニズムを詳細に解明できます。

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<meta charset="utf8"></head><body>熱ストレスシロイヌナズナにおける並進制御の解析

<ol><li>Picard, F., Loubière, P., Girbal, L., Cocaign-Bousquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+translation+regulation+in+the+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">The significance of translation regulation in the stress response.</a> BMC genomics. 14, 1-11 (2013).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL エッペンドルフチューブ</td><td>Labcon</td><td>3012-870-000-9</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>13.2 mL遠心チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331372</td><td>超遠心分離</td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Honeywell</td><td>32712</td><td>ポリソームプロファイル</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Honeywell</td><td>32211</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>シクロヘキシミド(CHX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-C7698</td><td>ポリソームプロファイル</td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>GeneChip 真核生物 Poly-A RNAコントロールキット</td><td>Invitrogen</td><td>900433</td><td>標準化</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Honeywell</td><td>15523</td><td>正規化</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-H3149</td><td>ポリソームプロファイル</td></tr><tr><td>HiScript III RT SuperMix qPCR キット用</td><td>Vazyme</td><td>R323-01</td><td>Normalization</td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T.Baker</td><td>&nbsp;3040-01</td><td>ポリソームプロファイル</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-M8266</td><td>ポリソームプロファイル</td></tr><tr><td>MS 基礎培地</td><td>Phyto</td><td>M524</td><td>植物培養</td></tr><tr><td>ピークチャート シリンジポンプ</td><td>ブランデル</td><td>SYN4007LS</td><td>ポリソームプロファイル</td></tr><tr><td>ポリオキシエチレン-10-トリデシルエーテル (PTE)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P2393</td><td>ポリソームプロファイル</td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td>ポリソームプロファイル</td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム (DOC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-D6750</td><td>ポリソームプロファイル</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td>ポリソームプロファイル</td></tr><tr><td>SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>BP170-8882</td><td>Normalization</td></tr><tr><td>TRI reagent</td><td>MRC</td><td>TR118</td><td>RNA extraction</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>J.T.Baker</td><td>&nbsp;4109-06</td><td>ポリソームプロファイル</td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマンコールター</td><td>オプティマL-100K</td><td>超遠心分離</td></tr><tr><td>機UV/VISDETECTOR</td><td>ブランデル</td><td>UA-6</td><td>ポリソームプロファイル</td></tr></tbody></table>

ポリソームプロファイルを用いた熱ストレス下での翻訳効率試験

Translation Efficiency Test Using Polysome Profiles Under Heat Stress

シロイヌナズナの野生型であるCol-0は、16時間:8時間の光日長でMS培地で増殖しました。防除には、熱ストレス処理を施さずに生後5日の苗木を使用しました。熱ストレス群は予熱水浴中で40°Cで1時間の熱処理を行い、回収群は熱処理直後に22°Cで2時間行った。異なる熱処理条件と回収条件を採用することで、後続のステップを利用してそれらの並進効率を測定できます。
RNA抽出の前に、まずスクロースグラジエントを調製する必要があります。非ポリソームRNAとポリソームRNAを密度差に基づいて分離するために、ショ糖濃度12.5%、24.4%、36.3%、48.1%、および60%のグラジエント溶液を調製しました。次に、グラジエント溶液を高濃度から低濃度にロードしました(図1A)。その後、このグラジエントを利用して、低密度の非ポリソームRNAを上層で分離し、高密度のポリソームRNAをスクロース濃度の高い下層に分布させることができます。非ポリソームおよびポリソームRNAは、処理済みまたは未処理のCol-0から抽出した。溶液中の粒子がポリソームプロファイリング分析の結果に影響を与えるのを防ぐために、RNA含有溶液をセルストレーナーでろ過し、粒子を含まない抽出溶液を得る必要があります。ろ過した上清を、あらかじめ調製したショ糖グラジエントにロードし、平衡化しました。スクロースグラジエントをロードしたサンプルを超遠心分離した後、非ポリソームおよびポリソームRNAをショ糖グラジエント内の密度に応じて分布させました。続いて、密度勾配フラクショネーターを使用してポリソームプロファイリングを行いました(図1B)。密度勾配フラクショネーターは、最初に脱イオン水で校正されたソフトウェアを使用して制御されます。キャリブレーション後、サンプルは超遠心分離後に分留装置にロードされます。ソフトウェア制御モードで動作するマイクロボリュームシリンジポンプは、ショ糖勾配よりも高い濃度のショ糖溶液をグラジエントに注入し、サンプルを押し出します。これにより、密度が低いショ糖勾配の上部から開始し、密度が高い下部に向かって測定を進めることができます。その後、ソフトウェア設定がアクティブになってデータ取得が開始され、OD254 測定を通じてポリソームプロファイルグラフが生成されます(図1B)。ポリソーム画分でより高い信号強度が観察された場合、それはサンプルがより高い翻訳効率を示すことを示しています。
図 2に、さまざまな処理下での生後5日齢のCol-0実生のポリソームプロファイリングのプロットを示します。対照群の結果は、非ポリソーム画分とポリソーム画分との間に明確な分離を示しています(図2A)。しかし、40°Cで1時間の熱ストレスの後、ポリソーム画分の信号強度は大幅に減少しました(図2B)。熱処理した苗木を22°Cで2時間回復させると、ポリソーム画分の信号強度は対照群と同様のレベルに回復しました(図2C)。その結果、1時間の熱ストレス処理により、シロイヌナズナの苗の翻訳効率が大幅に低下したことが示されました。しかし、植物は、熱ストレスを受けていない苗木に匹敵するレベルまで翻訳効率を回復するために、2時間の回復を必要としました。
異なる処理条件下でのCol-0実生の翻訳効率を比較するさらなる証拠を収集するために、非ポリソームおよびポリソームRNA画分を単離して抽出しました。非ポリソームおよびポリソームRNAフラクションの収集は、ポリソームプロファイル測定の結果によって導かれました。非ポリソームおよびポリソームRNAの抽出には、フェノール/グアニジニウムチオシアン酸試薬を使用して、単離された非ポリソームおよびポリソームRNAサンプルを抽出します。私たちが使用したRNA抽出法により、次の分析で安定した高品質のRNAを得ることができます(表1)。その後、抽出した RNA を GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit で標準化し、さまざまな抽出損失によるエラーを軽減します。次に、リアルタイムPCRを用いて、キットに添加した枯草菌遺伝子に含まれるDAP遺伝子の発現を定量しました。非ポリソームRNA群とポリソームRNA群との間のDAP遺伝子発現レベルの比較解析を行い、比例損失条件下でのRNA含量を推定しました(図3A)。正規化されたポリソームRNAと全RNAの比率を計算して、それらの間の翻訳効率を明らかにしました(図3B)。最後に、ポリソーム中のRNAの比率を、正規化されたRNA含量を用いて計算しました(図3C)。Col-0の異なる処理下でのポリソーム中のRNA比の結果は、図2Aに示すポリソームプロファイルの結果と一致するパターンを示しました。どちらの結果も、熱ストレスがポリソーム画分のRNA比を大幅に減少させ、この影響は22°Cで2時間回復した後に逆転させることができることを示しています(表1)。
この方法から、我々は、RNAを追加の画分23に分離するのではなく、全非ポリソームまたはポリソームRNA画分を高品質で得ることができる。また、私たちの結果は、ポリソームプロファイルとポリソーム中のRNAの割合の両方が、異なる治療条件のシロイヌナズナの翻訳効率を効果的に反映できることも示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig01.jpg"> 図1:ポリソームプロファイリングワークフロー図(A)13 mL遠心チューブでのショ糖勾配の調製の概略図。(B)フローチャートは、ポリソームプロファイリングの実験プロセスを示しています。まず、トランスラトームを抽出します。その後、非ポリソームRNAとポリソームRNAは、密度の違いに基づいて、さまざまな密度のショ糖勾配で超遠心分離を使用して分離されます。OD254は、密度勾配フラクショネーターを使用して測定され、以下のポリソームプロファイリング結果グラフが得られます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig02.jpg"> 図2:異なる条件下でのCol-0のポリソームプロファイリング。 (A、B、C)(A)熱処理なし(コントロール)、(B)40°Cで1時間熱処理、(C)22°Cで1時間回復した条件でのCol-0のポリソームプロファイリング結果。非ポリソームおよびポリソームRNAは、12.5%〜60%のショ糖勾配を用いて分画した。非ポリソーム(NP)RNAおよびポリソーム(PL)RNAの位置は、プロファイルに示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig03.jpg"> 図3:非ポリソームおよびポリソームRNA抽出ワークフロー図(A)スパイクインによるRNA標準化の図。(B)非ポリソームRNAとポリソームRNAの分離、およびポリソームRNAの割合の計算の図。(C)さまざまな条件で処理されたCol-0中のポリソームRNAの割合。エラーバーは、SD±平均を示します(n = 3生物学的リピート)。*p値&lt;0.01、スチューデントのt検定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>コンテンツ(ng)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">コントロール</td>
			<td>RNAのNP</td>
			<td>758.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>RNAのPL</td>
			<td>302.3</td>
			<td>2.21</td>
			<td>2.13</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">熱ストレス</td>
			<td>RNAのNP</td>
			<td>821.5</td>
			<td>2.2</td>
			<td>2.15</td>
		</tr><tr><td>RNAのPL</td>
			<td>174.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.21</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">回復</td>
			<td>RNAのNP</td>
			<td>797.2</td>
			<td>2.17</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>RNAのPL</td>
			<td>300.9</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.18</td>
		</tr></tbody></table>表1:非ポリソームおよびポリソームRNAの含有量と品質。 この表は、RNAの含有量と性質が分析されたことを示しています。RNA含量は、改良された方法を使用して抽出後に正規化されました。

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ポリソーム分離灌流マウスの心臓でプロファイリングを実行するためのプロトコルをご紹介します。心の灌流、プロファイリング、ポリソーム Mrna、Mirna、・ ポリソーム...

動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

生きた酵母や哺乳動物細胞におけるホルムアルデヒド架橋を用いた翻訳(タンパク質生合成)複合体を迅速に安定化させる技術を紹介する。このアプローチにより、一過性の中間体と動的RNA:タンパク質相互作用の解剖が可能になります。架橋された複合体は、深いシーケンシングベースのプロファイリング方法、顕微鏡、質量分析など、複数のダウンストリームアプリケーションで使用できます。...

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

このプロトコルでは、自動グラジエントメーカーやグラジエント分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを生成する方法について説明します。...

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

ヒートショック法による大腸菌へのプラスミドDNAの形質転換

このビデオでは、バイオフィードバックを使用して強調して人の精神生理学的反応を評価する一つの方法を説明します。我々はまた、治療計画のための一般的なガイドラインを紹介します。...

バイオフィードバックを用いた精神生理学的ストレス評価

学ぼう、ポリソームプロファイルを用いて熱ストレス下のArabidopsis thalianaにおける翻訳効率を解析する方法。スパイクインノーマライゼーションを活用した標準化されたプロトコルで、植物のストレス耐性メカニズムを詳細に解明できます。

ポリソームプロファイルを用いた熱ストレス下での翻訳効率試験

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