反復漂白に最適化されたワークフローにより、高自家蛍光の臨床サンプルのマルチプレキシティイメージングが拡張されます
2025年7月11日
手動IBEX法による低コストで汎用性の高い光照射技術の実装により、有意な天然自家蛍光でヒト組織の最適なイメージングが可能になります。このプロトコルでは、倒立顕微鏡、広く利用可能な試薬、および画像のアライメントと処理のためのオープンソースソフトウェアを使用して、アーカイブされた臨床サンプルからマルチプレックス化されたホールスライド画像を取得する方法を詳しく説明しています。
[ナレーター]Nature Methods誌の2024年メソッド・オブ・ザ・イヤーに選ばれた空間プロテオミクスを使用することで、免疫細胞の正確な位置と細胞間相互作用を組織内でマッピングすることができます。これにより、臨床転帰に関連する空間パターンが明らかになります。複雑な抗体パネルを構築し、内因性蛍光を高くして組織をイメージングすることは、IBEXやその他の蛍光顕微鏡技術にとって、時間、リソース、専門知識に多大な課題をもたらします。IBEXを使用して、高リスク濾胞性リンパ腫患者およびHuman Cell Atlasの同僚とともに腫瘍特異的特徴が同定されました。ヒト胸腺の包括的な空間地図が作成されました。免疫細胞の組成、空間的相互作用、およびさまざまなマイコバクテリア肺病態にわたるサイトカイン産生の違いについてはほとんど知られていません。このプロトコルは、このギャップを埋めます。このプロトコルは、空間分析のための抗体シグナルを維持しながら、特に困難なFFPEサンプルにおける広域スペクトル組織自家蛍光を大幅に低減する、低コストで適応性のある光照射法を提供します。まず、抗原回収が完了した後、スライドを組織でPBSに浸します。PBSからスライドを1枚取り出し、糸くずの出ないワイプを使用して、ティッシュに触れずに余分なバッファーをすべて慎重に乾かします。疎水性ペンで、スライドの組織部分の周りに境界線を描きます。残りのスライドに対してこのプロセスを繰り返した後、疎水性バリアを10分間乾燥させます。次に、糸くずの出ないワイプを使用して、組織に直接触れずに組織切片からPBSを吸い取ります。次に、スライドに200マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加し、水分チャンバーを閉じます。温度調節機構を備えた非加熱科学用マイクロ波にチャンバーを入れ、以前に確立されたプログラムを5サイクル実行します。ブロッキングインキュベーション中に、フックとFcブロックを含むブロッキングバッファーを備えた一次抗体染色溶液1を調製します。抗体を混ぜ合わせ、カクテルをやさしく混ぜます。マイクロ波サイクルが完了したら、スライドチャンバーを取り外して開き、組織に触れずにスライドからブロッキングバッファーを吸い取ります。次に、200マイクロリットルの一次抗体染色液1をスライドに加えます。チャンバーを電子レンジに戻し、一次抗体プログラムを約30分間再度実行します。一次抗体の標識が完了したら、スライドを垂直に持ちます。スライドを洗浄するには、1,000マイクロリットルのPBSを組織にピペットで流し、流し出させます。余分なPBSを吸い取り、スライドを1%パラホルムアルデヒドで湿度チャンバー内で室温で10分間固定します。固定後、スライドを1,000マイクロリットルのPBSで3〜5回完全に洗浄し、光照射ステップまで組織にPBSの層を残します。光照射ボックスを準備するには、150ワットのLEDランプ、40ワットのRGBWフラッドLEDランプ、容量75.71リットル以上の大きなプラスチック容器、新鮮なPBS、およびペトリ皿を集めます。次に、ペトリ皿に1x PBSを入れて、スライドを完全に沈めます。ランプからの熱を最小限に抑えるために、冷蔵室で光照射手順を実行します。次に、スライドをペトリ皿に入れ、PBS に完全に浸されていることを確認します。次に、40ワットのランプをペトリ皿の真上に置き、光源をスライドに向かって下を向くようにし、ランプを赤色光モードに設定します。最後に、150 ワットと 40 ワットの両方のランプをオンにし、セットアップ全体をプラスチック容器の蓋で覆います。2時間後、ランプを緑色のライトに切り替え、16時間インキュベートします。色素不活性化プロトコルに適合する最も明るい蛍光色素が同定され、低発現マーカーとペアになってシグナル検出を強化しました。自家蛍光は、光照射後、より長いイメージング波長で大幅に減少しました。高度に発現する構造マーカーであるα-平滑筋アクチンとパンサイトケラチンを標的とする直接結合抗体を、750ナノメートルの近赤外チャネルで置換します。 バックグラウンド信号は、染色されていない参照画像とSimpleITK演算を使用して計算的に差し引かれ、しきい値によって真の信号が強化されました。IBEX染色切片のスライド全体イメージングにより、壊死コアとCD15陽性好中球を伴う肉芽腫が明らかになりました。抗抗原 85B 抗体を使用して、肉芽腫壊死コア付近で結核菌または非結核性抗酸菌が検出されました。肉芽腫関連リンパ組織には、肺のすべての免疫細胞の CD20 陽性 B 細胞、CD4 陽性 T 細胞、少数の CD8 陽性 T 細胞、および CD45 標識が含まれていました。IBEX イメージングにより、気管支上皮細胞、動脈平滑筋、CD68 陽性マクロファージなどの肺の解剖学的特徴の視覚化も可能になりました。
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概要
この記事では、自然な自己蛍光を持つヒト組織の画像化を向上させる低コストの写真照射技術を紹介します。このプロトコルは、広く入手可能な試薬とオープンソースソフトウェアを使用して、アーカイブされた臨床サンプルからのマルチプレックス全スライド画像化を可能にします。
主要な研究要素
科学の領域
- 神経科学
- 免疫学
- 蛍光顕微鏡
背景
- 空間プロテオミクスにより、組織内の免疫細胞とその相互作用のマッピングが可能になります。
- 抗体パネルの構築と高自己蛍光を持つ組織の画像化に課題があります。
- IBEX技術は、高リスクリンパ腫患者における腫瘍特異的特徴を特定します。
- マイコバクテリア肺病変における免疫細胞構成についてはほとんど知られていません。
研究の目的
- 抗体シグナルを保持しながら組織の自己蛍光を減少させるプロトコルを提供すること。
- 複雑な組織サンプルにおける免疫細胞の空間解析を容易にすること。
- 様々な病態における免疫細胞相互作用の知識ギャップを埋めること。
使用した方法
- 抗原回復後の組織を持つスライドをPBSに浸します。
- ブロッキングバッファーと一次抗体溶液を準備し、適用します。
- 特定のLEDランプを使用して自己蛍光を減少させる光照射を行います。
- 免疫細胞の相互作用と組織の特徴を視覚化するために全スライド画像化を行います。
主な結果
- 光照射後に自己蛍光が大幅に減少しました。
- 肺組織で肉芽腫と免疫細胞の種類が視覚化されました。
- 特定の抗体で壊死中心付近の結核菌が検出されました。
- IBEX画像化により、肺組織の詳細な解剖学的特徴が明らかになりました。
結論
- このプロトコルは、自己蛍光を最小限に抑えながら複雑な組織の画像化を向上させます。
- 様々な疾患における免疫細胞相互作用の研究に貴重なツールを提供します。
- この方法は幅広い臨床応用に適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Multiplexed imaging of highly autofluorescent clinical samples is a persistent bottleneck in translational research, limiting the ability to resolve spatial immune cell phenotypes in archived tissues. The optimized IBEX workflow with iterative bleaching and photoirradiation directly addresses this challenge, enabling high-resolution, quantitative spatial proteomics in FFPE samples using accessible instrumentation. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports robust biomarker discovery across diverse disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables deep phenotypic mapping of immune cell populations within intact tissue architecture.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying spatial relationships and cell-cell interactions in disease contexts.
- Facilitates functional target validation through quantitative, multiplexed readouts in clinically relevant samples.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, low-autofluorescence tissue sections for downstream multiplexed imaging workflows.
- Improves assay reproducibility and quantitative signal detection by minimizing background interference.
- Enables scalable, whole-slide imaging for high-content screening of immune and structural markers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial proteomics outputs with translational biomarker strategies in pulmonary and infectious disease models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis of archived clinical specimens.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering high-content, spatially resolved data from challenging samples.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatial proteomics in FFPE tissues, supporting both early mechanistic studies and translational biomarker validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification through spatially resolved immune profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative multiplexed imaging outputs suitable for comparative analysis.
- Analytics: Provides high-content, whole-slide data for robust statistical comparison of immune cell distributions and tissue features.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in archived clinical samples.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable imaging protocol for diverse tissue types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in spatial immune profiling.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across sample types.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust data generation from archived samples.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody panel design and fluorescence imaging.
- Needs access to widefield microscopy and LED-based photoirradiation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for antibody validation and image analysis workflows.
- Adaptable to various FFPE tissue types but may require protocol optimization for different sample matrices.
- Practical limitations include potential epitope loss and spectral overlap, necessitating careful panel design and validation.
