反復漂白に最適化されたワークフローにより、高自家蛍光の臨床サンプルのマルチプレキシティイメージングが拡張されます

[ナレーター]Nature Methods誌の2024年メソッド・オブ・ザ・イヤーに選ばれた空間プロテオミクスを使用することで、免疫細胞の正確な位置と細胞間相互作用を組織内でマッピングすることができます。これにより、臨床転帰に関連する空間パターンが明らかになります。複雑な抗体パネルを構築し、内因性蛍光を高くして組織をイメージングすることは、IBEXやその他の蛍光顕微鏡技術にとって、時間、リソース、専門知識に多大な課題をもたらします。IBEXを使用して、高リスク濾胞性リンパ腫患者およびHuman Cell Atlasの同僚とともに腫瘍特異的特徴が同定されました。ヒト胸腺の包括的な空間地図が作成されました。免疫細胞の組成、空間的相互作用、およびさまざまなマイコバクテリア肺病態にわたるサイトカイン産生の違いについてはほとんど知られていません。このプロトコルは、このギャップを埋めます。このプロトコルは、空間分析のための抗体シグナルを維持しながら、特に困難なFFPEサンプルにおける広域スペクトル組織自家蛍光を大幅に低減する、低コストで適応性のある光照射法を提供します。まず、抗原回収が完了した後、スライドを組織でPBSに浸します。PBSからスライドを1枚取り出し、糸くずの出ないワイプを使用して、ティッシュに触れずに余分なバッファーをすべて慎重に乾かします。疎水性ペンで、スライドの組織部分の周りに境界線を描きます。残りのスライドに対してこのプロセスを繰り返した後、疎水性バリアを10分間乾燥させます。次に、糸くずの出ないワイプを使用して、組織に直接触れずに組織切片からPBSを吸い取ります。次に、スライドに200マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加し、水分チャンバーを閉じます。温度調節機構を備えた非加熱科学用マイクロ波にチャンバーを入れ、以前に確立されたプログラムを5サイクル実行します。ブロッキングインキュベーション中に、フックとFcブロックを含むブロッキングバッファーを備えた一次抗体染色溶液1を調製します。抗体を混ぜ合わせ、カクテルをやさしく混ぜます。マイクロ波サイクルが完了したら、スライドチャンバーを取り外して開き、組織に触れずにスライドからブロッキングバッファーを吸い取ります。次に、200マイクロリットルの一次抗体染色液1をスライドに加えます。チャンバーを電子レンジに戻し、一次抗体プログラムを約30分間再度実行します。一次抗体の標識が完了したら、スライドを垂直に持ちます。スライドを洗浄するには、1,000マイクロリットルのPBSを組織にピペットで流し、流し出させます。余分なPBSを吸い取り、スライドを1%パラホルムアルデヒドで湿度チャンバー内で室温で10分間固定します。固定後、スライドを1,000マイクロリットルのPBSで3〜5回完全に洗浄し、光照射ステップまで組織にPBSの層を残します。光照射ボックスを準備するには、150ワットのLEDランプ、40ワットのRGBWフラッドLEDランプ、容量75.71リットル以上の大きなプラスチック容器、新鮮なPBS、およびペトリ皿を集めます。次に、ペトリ皿に1x PBSを入れて、スライドを完全に沈めます。ランプからの熱を最小限に抑えるために、冷蔵室で光照射手順を実行します。次に、スライドをペトリ皿に入れ、PBS に完全に浸されていることを確認します。次に、40ワットのランプをペトリ皿の真上に置き、光源をスライドに向かって下を向くようにし、ランプを赤色光モードに設定します。最後に、150 ワットと 40 ワットの両方のランプをオンにし、セットアップ全体をプラスチック容器の蓋で覆います。2時間後、ランプを緑色のライトに切り替え、16時間インキュベートします。色素不活性化プロトコルに適合する最も明るい蛍光色素が同定され、低発現マーカーとペアになってシグナル検出を強化しました。自家蛍光は、光照射後、より長いイメージング波長で大幅に減少しました。高度に発現する構造マーカーであるα-平滑筋アクチンとパンサイトケラチンを標的とする直接結合抗体を、750ナノメートルの近赤外チャネルで置換します。 バックグラウンド信号は、染色されていない参照画像とSimpleITK演算を使用して計算的に差し引かれ、しきい値によって真の信号が強化されました。IBEX染色切片のスライド全体イメージングにより、壊死コアとCD15陽性好中球を伴う肉芽腫が明らかになりました。抗抗原 85B 抗体を使用して、肉芽腫壊死コア付近で結核菌または非結核性抗酸菌が検出されました。肉芽腫関連リンパ組織には、肺のすべての免疫細胞の CD20 陽性 B 細胞、CD4 陽性 T 細胞、少数の CD8 陽性 T 細胞、および CD45 標識が含まれていました。IBEX イメージングにより、気管支上皮細胞、動脈平滑筋、CD68 陽性マクロファージなどの肺の解剖学的特徴の視覚化も可能になりました。