ミニバイオリアクターアレイ(MBRA)の組み立てと使用のためのプロトコルの更新

そのため、私たちの研究は腸内細菌叢、特に有害な病原体のコロニー形成を防ぐために腸内細菌叢をどのように操作できるかに焦点を当てています。同時に、私たちはこの植民地化抵抗の背後にある生態学的ルールとメカニズムを理解することにも興味を持っています。次世代シーケンシング、高度なバイオインフォマティクス、無菌マウス、in vitro 腸内モデルなどのテクノロジーはすべて、微生物群集と健康と病気における微生物群集の役割を研究する方法を変革しています。

in vitro 腸内モデルの最大の課題の 1 つは、高スループットで操作することです。私たちが必要としているのは、微生物群集を大規模に機能的に調査できるシステムです。ミニバイオリアクターアレイは、他のシステムのスループット能力の不足に対処するために設計された連続フロー培養システムです。

これにより、複雑で再現性のある微生物群集の行動を捉えながら、実験をスケールアップすることができます。まず、ミニバイオリアクターアレイストリップが3Dプリントされ、6つの独立したバイオリアクターチャンバーが含まれていることを確認してください。アセンブリに必要なすべてのコンポーネントを配置します。

1/4インチ28NFフラクションタップとTハンドルタップレンチを使用します。各チャンバーに3つの1/4インチポートをねじ込んで、フィッティングを挿入します。チャンバーを水で洗浄した後、10 x 3ミリメートルの磁気撹拌棒を各チャンバーに入れ、1ミリリットルの蒸留水を加えます。

次に、バイオリアクターの各ポートの上にゴムワッシャーを配置します。各チャンバーについて、1つのメディアストロースレッドオスルアー、1つの廃ストロースレッドオスルアー、および1つの空のスレッドオスルアーをポートにねじ込みます。次に、6 つのゴム製セプタムを 3/32 インチのメス ルアー バーブに挿入し、各セプタムの上袖を折りたたんで首を覆います。

各チャンバーの指定ポートに取り付けます。Cフレックスチューブストリップを希望の長さと数に切断します。1/8インチのメスルアーバーブを一端に取り付け、各長さのチューブの反対側の端にオスルアーロックコネクタを取り付けます。

次に、内径1.14mmの赤い2ストップE-labチューブと、内径0.89mmのオレンジ色の2ストップE-labチューブの両端に1/16インチのメスルアーバーブを挿入します。準備したE-labチューブをC-flexチューブに接続し、6つのC-flexチューブの長さのそれぞれが、メスルアーを介して1つの赤と1つのオレンジのE-labラインに接続されていることを確認します。次に、必要に応じて C-flex チューブをさまざまな長さに切断します。

1/8 インチのメス ルアー バーブとオスのルアー ロック コネクタを 1 つの 3 インチ ピースと 12 インチの C フレックス チューブの両端に取り付けます。残りの部分の両端にオスルアーロックコネクタを取り付けます。3D図に従って廃棄物ラインツリーを組み立てます。

赤い 2 ストップ E-lab チューブの露出端を、C-flex チューブの長さに基づいて昇順でウェイスト ライン ツリーのターミナル オス ルアー ロックに取り付けます。次に、3 インチの C-flex チューブを 1/8 インチのメス ルアー バーブとオスのルアー ロック コネクタで廃線ツリーの上部に接続します。3D図に従って送りラインツリーを組み立てます。

オレンジ色の2ストップE-labチューブの露出端を、C-flexチューブの長さに基づいて昇順にフィードラインツリーのターミナルオスルアーロックにブリッジし、12インチのC-flexチューブをフィードラインツリーの上部に取り付けます。供給ラインツリーの端にある可変長のCフレックスチューブをバイオリアクターに取り付け、左側の最短線から右側の最長線まで昇順に配置します。廃棄物ラインツリーの端にある可変長のCフレックスチューブを、ポンプの配置に対応するために、最も長い線を左側、最も短い線を右側に降順にバイオリアクターストリップに取り付けます。

すべてのC-flexフィードラインをストリップの左側に束ね、ツイストタイで固定します。C-flexラインの間にオレンジ色の2ストップE-labチューブでループを形成し、オートクレーブテープを使用してループを固定し、バイオリアクターストリップの廃棄物側にある赤色の2ストップE-labチューブに対してこのプロセスを繰り返します。廃棄物の端にあるメスルアーを覆い、汚染を防ぐためにラインツリーにホイルを与えます。

各バイオリアクターチャンバーのセプタム付きおねじ式ルアーを緩め、オートクレーブ滅菌中に蒸気を逃がします。アセンブリをオートクレーブビンに入れた後、飼料ラインと廃棄物ラインの木を、MBRAストリップを含むビンに隣接する別々のビンに伸ばします。システムをポンプに取り付けるには、廃棄物ラインと供給ラインの両方のE-labチューブを固定しているオートクレーブテープを剥がし、C-flexチューブの束をほどきます。

攪拌プレートの上部にある2つのポンプの間にMBRAを配置します。3Dプリントされたホルダーを使用してクランプし、プレート上のマークされた攪拌位置に合わせます。次に、供給ラインの E-lab チューブを蠕動ポンプカートリッジに取り付け、チューブストップをカートリッジスロットに配置します。

撹拌プレートの右側にあるポンプの廃液ラインE-labチューブについて、このプロセスを繰り返します。次に、蠕動ポンプカートリッジをポンプにロックします。3Dプリントされたチューブホルダーを使用して、C-flexチューブをきちんと配置します。

廃水ラインツリーの端を廃水ボトルに接続されたチューブに接続します。次に、フィードラインエントリーチューブのメスルアーを、メディアボトルキャップから12インチチューブのオスコネクタに取り付けます。両方のポンプの電源を入れて媒体の流れを開始し、廃棄物がポンプの右側に配置されたときに両方のポンプが時計回りに回転するように設定されていることを確認します。

各バイオリアクターチャンバー内の液滴サイズとケイデンスを観察します。変動や異常が見つかった場合は、影響を受けるチャンバーに接続されているオレンジ色の2ストップE-labチューブを交換して、流量の変動を減らしてください。チャンバーがいっぱいになったら、両方のポンプを停止し、実験を開始する前にバイオリアクターを24〜48時間放置して汚染がないか確認します。

媒体入力を脱イオン水中の10%漂白剤の1リットル容器に切り替え、両方のポンプの流量を最大に増やして、バイオリアクターチャンバーの内容物を漂白剤で置換します。チャンバーに媒体がなくなったら、MBRAを反転させて充填ラインの上で5分間消毒します。5分後、システムを正し、滅菌のためにさらに5分間待ちます。

チャンバーから培地を取り除き、10分間滅菌した後、漂白剤を1リットルの脱イオン水と交換し、水が通過するまでシステムを洗い流します。次に、バイオリアクターのE-labチューブをポンプから外し、MBRAを取り外します。使用済みのセプタムをバイオリアクターから取り出し、1ミリリットルの水だけが残るまで各チャンバーを排出します。

セプタム、オレンジ色の2ストップE-labチューブを交換し、前に示したように完全に組み立てられたストリップをオートクレーブします。3 サイクルの再利用の後、次の手順に従います。ヒト糞便サンプルを調製し、MBRAシステムで増殖させました。

4日間の連続フローの後、9つのバイオリアクターすべての微生物群集は18の細菌属によって支配され、それぞれが任意の複製で相対存在量の少なくとも2%を占めていました。検出された65属のうち22属は、9つのバイオリアクター反復すべてに存在し、高い再現性を示しました。アルファ多様性分析では、観察された運用分類単位とシャノン多様性指数の両方で、反復間の変動が最小限であることが示されました。