有機溶媒を用いた抽出・沈殿法を用いた大 腸菌 からのエラスチン様ポリペプチド(ELP)の効率的な精製

本研究の範囲は、溶媒抽出沈殿法が融合活性を維持しつつELP融合タンパク質を迅速に精製できるかどうかを問うものです。最近の進展には、エンドトキシン制御の改善による急速溶媒ベースのELP精製が含まれ、標的核酸送達のための能動的自己組み立てナノ粒子を可能にします。まず、大腸菌細胞ペレット1グラムを計量します。

新たに調製したリシスバッファー4ミリリットルを加えて細胞ペレットを再懸浮させます。ペレットが完全に分散しバッファーと混合されるまで、優しく渦巻きます。細胞壁の消化を助けるために、リサスペンションされた細胞に約5ミリグラムのリゾザムを加えます。

その後、チューブを氷に置き、1時間培養します。培養後、マイクロチッププローブソニケーターを用いて5秒間隔でソニケートを行います。サンプルを氷に保管し、通常5〜8分間、目に見える粒子のない均一な溶解液が得られるまで超音波検査を続けます。

超音波溶解液を10,000Gで20度Cで10分間遠心分離して清算します。次に、可溶性分率を含む上清液と不溶性分率を含むペレットを慎重に分離します。上清液を10〜20マイクロリットルピペットで抽出し、同等質量のペレットを溶解バッファーに再懸浮させます。

両方の分画を4倍のラエムリバッファーで混合し、最終的な1倍の濃度にします。その後、サスペンションを95度で5分間加熱します。ELPが主に可溶性の場合は、精製上清液を用いた有機溶媒抽出を進めます。

溶媒抽出を行うには、空気乾燥ペレットまたは上清液に4ミリリットルの有機溶媒または溶媒混合物を加えます。二元溶媒混合物の場合は、1対1の組み合わせでそれぞれ2ミリリットルといった正確な体積比を用いてください。溶剤がペレットに適切に浸透するように、懸濁液を1分間激しく渦巻かせます。

次に、混合物を20度の温度で5分間培養し、細胞外タンパク質の凝集と有機相でのELPの溶解を可能にします。サンプルを13,000Gで20度Cで10分間遠心分離し、溶けたタンパク質と不溶性の破片を分離します。上清液はペレットを乱さずに慎重に採取してください。そこには溶解したELPが含まれているためです。

採取した上清液の体積を正確に測定し、降水の準備をしてください。次に、上清液の体積の2.33倍のアセトンまたはアセトニトリルを加えてタンパク質沈殿を行います。混合物を20度で5〜7分間孵化します。

サンプルを10,000Gで20度Cで10分間遠心分離します。その後、上澄液を捨て、ペレットを穏やかな窒素ガス流の下で10〜15分間自然乾燥させるか、キャップのない遠心分離機チューブを逆さまにして綿くりのないワイプに逆さまに置き、20度Cで1時間乾燥させます。乾燥タンパク質ペレットをPBS50マイクロリットルに再懸浮させます。

その後、ピペットを優しく上下に動かして完全に溶けます。再懸濁タンパク質はマイナス20度の温度で保存し、短期から中期の使用に備えます。SDS-PAGEを用いた検証を行うには、まず精製タンパク質と4×SDS-PAGローディングバッファを混合します。

一時的に均質性の解をボルテックスします。サンプルを10%SDS-PAGEゲルにELPとTEENを融合させ、コリスメントミューターゼに結合させます。トラッキングダイブが底に達するまで、ゲルを100〜120ボルトで動かします。

次に、InstantBlue Coomassieの染色剤または適切な代替品で20度Cで2時間染めます。脱イオン水で澄んだ背景が見えるまですすいでください。有機抽出前の溶解ステップ後、100キロダルトンで100キロダルトンに見られる顕著なELPおよびTEENがコリスマトミューターゼに融合しました。

異なる有機溶媒の組み合わせにより、ELPとTEANがコリスマットミューターゼに融合した際の抽出効率や純度が異なりました。AGとBGの1対1混合は最も高いタンパク質回収率を示しました。AG溶媒抽出のELPおよびTEENをコリスマトミューターゼに融合させたものは、ITC精製タンパク質と比較して約80%の酵素活性を維持し、BGは約50%の活性を維持し、V40対照群ではほとんど活性が見られませんでした。

重要な発見としては、有機溶媒抽出沈殿法が低エンドトキシンでELP融合を迅速に精製しつつ、融合タンパク質活性を維持できることが挙げられます。このプロトコルは、多段階ITCを用いずに、包摂体有無にかかわらず、E.coliからELP融合を迅速に精製する洗剤を使わずにいられる方法の不足に対応します。このプロトコルは、大腸菌ペレットから直接の一段階で迅速精製を行い、融合タンパク質の機能を維持しつつ、非常に純度の高い低エンドトキシンELP融合を実現します。