Name: 有機溶媒を用いた抽出・沈殿法を用いた大 腸菌 からのエラスチン様ポリペプチド(ELP)の効率的な精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 学ぶ有機溶媒抽出沈殿法による大腸菌由来エラスチン様ポリペプチドの精製技術。融合タンパク質活性を保持しつつ迅速に高純度ELPを得るスケーラブルな手法を確立する。

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<ol><li>Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+polypeptides%3A+therapeutic+applications+for+an+emerging+class+of+nanomedicines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines.</a> J Control Release. 240, 93-108 (2016).</li>
<li>MacEwan, S. R., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Applications of elastin-like polypeptides in drug delivery.</a> J Control Release. 190, 314-330 (2014).</li>
<li>Jenkins, I. C., Milligan, J. J., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+elastin-like+polypeptides+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded elastin-like polypeptides for drug delivery.</a> Adv Healthc Mater. 10 (13), e2100209(2021).</li>
<li>Ju, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targeting+of+immunosuppressants+using+a+bifunctional+elastin-like+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular targeting of immunosuppressants using a bifunctional elastin-like polypeptide.</a> Bioconjug Chem. 30 (9), 2358-2372 (2019).</li>
<li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 62 (15), 1479-1485 (2010).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally+responsive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally responsive polypeptides.</a> Nat Biotechnol. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li>
<li>VerHeul, R., Sweet, C., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+purification+of+elastin-like+polypeptides+directly+from+whole+cells+and+cell+lysates+by+organic+solvent+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple purification of elastin-like polypeptides directly from whole cells and cell lysates by organic solvent extraction.</a> Biomater Sci. 6 (4), 863-876 (2018).</li>
<li>Sweet, C., Aayush, A., Readnour, L., Solomon, K. V., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+fast+organic+extraction-precipitation+method+for+improved+purification+of+elastin-like+polypeptides+that+is+independent+of+sequence+and+molecular+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Development of a fast organic extraction-precipitation method for improved purification of elastin-like polypeptides that is independent of sequence and molecular weight.</a> Biomacromolecules. 22 (5), 1990-1998 (1990).</li>
<li>Darji, S., Aayush, A., Estes, K. M., Strock, J. D., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+mechanism+of+elastin-like+polypeptide-enzyme+fusion+stabilization+in+organic+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Unravelling the mechanism of elastin-like polypeptide-enzyme fusion stabilization in organic solvents.</a> Biomacromolecules. 25 (1), 272-281 (2024).</li>
<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> J Phys Chem B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li>
<li>Guo, Y., Liu, S., Jing, D., Liu, N., Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+construction+of+elastin-like+polypeptides+and+their+applications+in+drug+delivery+system+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">The construction of elastin-like polypeptides and their applications in drug delivery system and tissue repair.</a> J Nanobiotechnology. 21, 418(2023).</li>
<li>Yi, A., Sim, D., Lee, S. -B., Sarangthem, V., Park, R. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+bioengineered+elastin-like+polypeptide-based+system+for+targeted+gene+delivery+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Application of bioengineered elastin-like polypeptide-based system for targeted gene delivery in tumor cells.</a> Biomater Biosyst. 6, 100050(2022).</li>
<li>Clement, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+the+recombinant+expression+and+chemical+synthesis+of+a+short+cysteine-rich+insecticidal+spider+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Venom+Anim+Toxins+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison between the recombinant expression and chemical synthesis of a short cysteine-rich insecticidal spider peptide.</a> J Venom Anim Toxins Trop Dis. 21, 19(2015).</li>
<li>Miranda, L. P., Alewood, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+chemical+synthesis+of+peptides+and+small+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Accelerated chemical synthesis of peptides and small proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (4), 1181-1186 (1999).</li>
<li>Eweje, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+protein+nanoparticles+for+cytosolic+delivery+of+nucleic+acids+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Self-assembling protein nanoparticles for cytosolic delivery of nucleic acids and proteins.</a> Nat Biotechnol. , (2025).</li>
<li>Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+polypeptides+as+a+purification+tag+for+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. 6 (11), 1-16 (2010).</li>
<li>Yakhnin, A. V., Vinokurov, L. M., Surin, A. K., Alakhov, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+purification+by+organic+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein purification by organic extraction.</a> Protein Expr Purif. 14 (3), 382-386 (1998).</li>
<li>Aayush, A., Darji, S., Estes, K. M., Yeh, E., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+elastin-like+polypeptide-based+nucleic+acid+delivery+system+targeted+to+EGFR%2B+bladder+cancer+cells+using+a+layer-by-layer+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Development of an elastin-like polypeptide-based nucleic acid delivery system targeted to EGFR+ bladder cancer cells using a layer-by-layer approach.</a> Biomacromolecules. 25 (9), 5729-5744 (2024).</li>
<li>Christensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+order+controls+expression+level+and+activity+of+elastin-like+polypeptide+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Fusion order controls expression level and activity of elastin-like polypeptide fusion proteins.</a> Protein Sci. 18 (7), 1377-1387 (2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>バイオ・ラッド</td><td>161-0710</td><td>SDS-PAGEコンポーネント</td></tr><tr><td>30% アクリルアミド/ビスアクリルアミド</td><td>TCI</td><td>A3218</td><td>SDS-PAGEコンポーネント</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A949</td><td>有機溶媒</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A996</td><td>有機溶媒</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>ゴールドバイオ - ゴールドバイオテクノロジー</td><td>A-301-25</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>APS(過硫酸アンモニウム)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610700</td><td>SDS-PAGEコンポーネント</td></tr><tr><td>ブタノール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>L13171</td><td>有機溶媒</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャー・バイオリエージェント</td><td>BP118-500</td><td>リシスバッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>デコン・ラボ</td><td>UN1170</td><td>有機溶媒</td></tr><tr><td>エチルアセテート</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>E195</td><td>有機溶媒</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>リサーチプロダクツ・インターナショナル</td><td>G22020-0.5</td><td>Terrific Broth(TB)メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A144SI-212</td><td>リシスバッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>インスタントクーマジーステイン</td><td>アブカム</td><td>AB119211</td><td>SDS-PAGEコンポーネント</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>ゴールドバイオ - ゴールドバイオテクノロジー</td><td>12481C25</td><td>タンパク質発現成分</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A451-1</td><td>有機溶媒</td></tr><tr><td>K2HPO4(リン酸カリウムモノカルシウム)</td><td>ウォーズの科学</td><td>470302-246</td><td>パート2 バッファ成分</td></tr><tr><td>KH2PO4(リン酸二塩基ポタシウム)</td><td>ウォーズの科学</td><td>470302-254</td><td>パート2 バッファ成分</td></tr><tr><td>L-プロリン</td><td>リサーチプロダクツ・インターナショナル</td><td>P5200-500.0</td><td>Terrific Broth(TB)メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>リソザイム</td><td>ゴールドバイオ - ゴールドバイオテクノロジー</td><td>L-040-1</td><td>リシスバッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A452</td><td>有機溶媒</td></tr><tr><td>ネイティブサンプルバッファ</td><td>バイオ・ラッド</td><td>161-0738</td><td>SDS-PAGEコンポーネント</td></tr><tr><td>プロテインラダー</td><td>ゴールドバイオ - ゴールドバイオテクノロジー</td><td>P008-500</td><td>SDS-PAGEコンポーネント</td></tr><tr><td>解析ゲルバッファ</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610798</td><td>SDS-PAGEコンポーネント</td></tr><tr><td>ソディム・ドデシル硫酸塩(SDS)</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>J18220-36</td><td>SDS-PAGEコンポーネント</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S318-500</td><td>リシスバッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>スタッキングゲルバッファ</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610799</td><td>SDS-PAGEコンポーネント</td></tr><tr><td>テメッド</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610801</td><td>SDS-PAGEコンポーネント</td></tr><tr><td>トリス・ベース</td><td>フィッシャー・バイオリエージェント</td><td>BP-152</td><td>リシスバッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>リサーチプロダクツ・インターナショナル</td><td>T60065-1000.0</td><td>Terrific Broth(TB)メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>リサーチプロダクツ・インターナショナル</td><td>Y20025-1000.0</td><td>Terrific Broth(TB)メディアコンポーネント</td></tr></tbody></table>

有機溶媒を用いた抽出・沈殿法を用いた大 腸菌 からのエラスチン様ポリペプチド(elp)の効率的な精製

Efficient Purification of Elastin-Like Polypeptides (ELPs) from E. coli Using an Organic Solvent-based Extraction and Precipitation Method

プロトコルの最終段階を経た後、次のステップはSDS-PAG分析とクマッシーブルー染色による抽出-沈殿結果の可視化です。有機抽出前に溶解段階がある場合、顕著なELPバンドが見られます。ELP-I-Cm2の場合、このバンドは100 kDaで現れます(図3A)。
異なる有機溶媒の組み合わせのスクリーニングでは、抽出効率にばらつきがあり(図3B)、各組み合わせで異なる濃度と純度が得られることが示されました。融合タンパク質の純度と機能性アッセイに基づいて抽出-沈殿に最適な組み合わせを選び、その後の大規模ELP精製に用いています。AG(イソプロパノール:アセトニトリル)とBG(ブタノール:アセトニトリル)1:1の混合物は、ELP-I-Cm2の場合、他の組み合わせと比較して最も高いタンパク質回収率(2.2〜2.6 g/L)を生み出しました。
有機抽出後に精製されたELPが機能を維持するかどうかを判断するために、融合タンパク...

有機溶媒を用いた抽出・沈殿法を用いた大 腸菌 からのエラスチン様ポリペプチド(ELP)の効率的な精製

Elastin-like polypeptides (ELP) are engineered biopolymers built from repetitive pentapeptide sequences that mimic motifs found in mammalian tropoelastin. ...

efficient-purification-elastin-like-polypeptides-elps-from-e-coli

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ここで、我々は、高活性Hsp104、六量体AAA +タンパク質酵母、タンパク質の分解に結合ATPの加水分解からの精製のためのプロトコルについて説明します。このスキームでは、からアフィニティー精製のためのしたHis6...

Hsp104の精製、タンパク質Disaggregase

このビデオでは、消化されたタンパク質溶解物混合物からペプチドを精製する逆相高速液体クロマトグラフィーのデモを行います。これらの精製されたペプチドは、凍結乾燥され、ダウンストリームアプリケーションのために保存されます。ペプチドの解析は、細胞シグナル伝達とがんに関与するメカニズムを理解するのに役立ちます。...

ペプチド精製:RP-HPLCを用いた消化タンパク質溶解物からのペプチド抽出技術

エラスチン様ポリペプチドは、組換えタンパク質の精製からの薬物送達に至るまでのアプリケーションとの刺激応答性のバイオポリマーである。このプロトコルは、クロマトグラフィーへの単純な代替手段としての下限臨界溶液温度の相転移挙動を使用して大腸菌のエラスチン様ポリペプチドおよびそれらのペプチドやタンパク質融合物の精製および特性について説明します。...

からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

組換え技術により、材料設計者は組織工学アプリケーション向けにカスタマイズされた機能を持つ新しい人工タンパク質を作成することができました。例えば、人工細胞外マトリックスタンパク質は、天然ECMに由来する構造的および生物学的ドメインを組み込むように設計することができます。ここでは、エラスチン様リピートを含むaECMタンパク質の構築と精製について説明します。...

人工細胞外マトリックス（AECM）タンパク質からの設計と構築<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;皮膚組織工学のための

プロトコルは、アルギン酸塩のような細胞外ポリマー（ALE）を抽出するために、好気性粒状汚泥を可溶化するための方法論を提供します。...

好気性グラニュール汚泥からの構造細胞外高分子物質の抽出

組換え蛋白質設計ヒドロゲルは、ポリマー主鎖としたがって、細胞の微小環境の完全な可変性を可能にする彼ら 3 D 細胞培養のために有利です。ここでは、組換えのエラスチンのような蛋白質の浄化のプロセスと 3 D...

カプセル化と 3 D の細胞の免疫染色のエラスチン様タンパク質ゲルの生産

ここに提示されるペプチドベースの小さなユニラメラ小胞の作成のためのプロトコルは、成長することができる。膜ペプチドのベシキュロ産生を容易にするために、これらの小胞は転写翻訳システムおよびペプチドコードプラスミドが装備されている。...

自律性小胞成長のためのペプチド膜前駆体のベシキュロ合成

有機溶媒および水性溶媒の界面では、カスタマイズされた両親媒性エラスチン様タンパク質は、環境パラメータによって引き起こされる小胞、繊維、コアセルベートなどの複雑な上分子構造に組み立てられます。記載された組立プロトコルは、調整可能な特性を有するタンパク質膜ベースのコンパートメント(PMBC)を生成し、様々な貨物のカプセル化を可能にする。...

エブラスチン様タンパク質の定義された上膜構造とカーゴカプセル化への組み立て

細菌は、生理活性のある生体分子を運ぶナノメートルサイズの細胞外小胞(EV)を分泌します。EVの研究は、それらの生合成、微生物-微生物および宿主-微生物の相互作用および疾患における役割、ならびにそれらの潜在的な治療用途を理解することに焦点を当てています。EV研究の標準化を促進するために、さまざまな細菌からEVをスケーラブルに分離するためのワークフローが提示されます。...

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

本プロトコールは、質量分析前のプロテオームサンプルの堅牢かつ迅速な回収および精製のための制御された条件下での溶媒ベースのタンパク質沈殿を記載する。...

質量分析に先立つ堅牢なプロテオーム精製のための有機溶媒ベースのタンパク質沈殿

この記事では、C41(DE3)発現系で毒性ヌクレアーゼである組換えNsp15を過剰発現し、その後、アフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用してタグ付きタンパク質を精製する方法論について説明します。これらのプロトコルは、他の困難な有毒タンパク質にも適応できます。...

大腸菌からの有毒ヌクレアーゼの過剰発現と精製

学ぶ有機溶媒抽出沈殿法による大腸菌由来エラスチン様ポリペプチドの精製技術。融合タンパク質活性を保持しつつ迅速に高純度ELPを得るスケーラブルな手法を確立する。

有機溶媒を用いた抽出・沈殿法を用いた大腸菌からのエラスチン様ポリペプチド(ELP)の効率的な精製

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