レプトスピラバイオフィルムの定量的、構造的、機能的分析のためのモジュール式ワークフロー

私たちは、環境および宿主の持続を可能にする保護構造としてのバイオフィルムを研究し、形成動態、分子組成、適応的特徴、感染への寄与を調査しています。結晶バイオアッセイ、タイムテキストイメージング、共焦点顕微鏡、走査型電子顕微鏡、トランスクリプトミクスを当研究室で組み合わせることで、統合された多次元解析を通じてバイオフィルム研究を前進させています。まず、レプトスピラ細胞をEMJH培地で平底スクリューキャップのガラス管で培養します。

培養物を30度の好気条件下で振動せずに培養し、対数相の中間に達するまで培養します。培養物の光学密度が405ナノメートルで0.2から0.4の範囲に達し、これは2〜5×10の8細胞の乗数に相当します。暗野顕微鏡を20倍倍で使い、細胞がモーダルで塊化していないことを確認します。

検証済みの中間ログ不整脈相培養を新鮮なEMJH培地で1対100の比率で希釈し、約1×10の10の6細胞毎ミリリットルのべき乗を得て、渦巻かずに逆行で優しく混合します。次に、滅菌鉗子を使って、0.1マイクロメートルの無菌親水性ポリカーボネート膜を各ウェルの底に平らに置き、蓋付きの滅菌24ウェルプレートに置きます。各ウェルに滅菌EMJH培地を1ミリリットル加え、膜を30度で2時間浸けます。

次に、膜を置き去りにせずに各井戸から浸漬液を取り出し、薄めた細菌懸濁液を1.5ミリリットル加えて膜が底にしっかりと固定されるようにします。その後、湿度を保つために水を入れたトレイをインキュベーター内に置きます。プレートを30度の静的な条件下で培養し、バイオフィルムの形成を促します。

成長の遅い株は最大3週間放置します。希望のタイミングで、バイオフィルムを乱さずにできるだけ多くの培養培地を慎重に吸引してください。膜を底に平らにしたまま、それぞれのウェルを1ミリリットルの滅菌PBSで優しくすすぎます。

各ウェルにPBS中の4%パラホルムアルデヒドを1ミリリットル加え、37度で30分間培養してバイオフィルムサンプルを固定します。孵化後、固定剤を除去し、PBS1ミリリットルで優しく2回洗い流します。各井戸に0.1%のクリスタルバイオレット溶液を1ミリリットル加え、室温で15分間培養します。カバースリップが完全に浸透していることを確認してください。

その後、各ウェルからクリスタルバイオレット染料を捨て、PBS1ミリリットルで2回洗い流します。皿を傾けて、残った液体をすべて抜きます。プレートを室温のまま自然乾燥させ、基質が完全に乾いたように見えるまで、できれば一晩かけて乾かしてください。

次に、各井戸に50%エタノールと50%氷河酢酸からなるエルシアン緩衝液500マイクロリットルを加えます。ピペットを上下に動かして、バイオフィルムに結合した染色を完全に溶かします。次に、各サンプルのうち200マイクロリットルを光学的にクリアな96ウェルマイクロプレートに移します。

570ナノメートルで吸収を測定し、すべての工程で処理された無接種コントロールから背景値を差し引います。少なくとも3回の技術的再現の平均と標準偏差を記録してください。前述のウェルプレートでバイオフィルムを入手します。

4%パラフォームアルデヒド溶液と1%グルターアルデヒドを0.2モルナトリウムバッファーにpH7.4でウェルに加えます。固定サンプルを37度の環境で30分間培養します。固定剤を除去し、表面付着したバイオフィルムを保護しつつ剥離を最小限に抑えるためにPBSでサンプルを2回洗い流します。

次にカバースリップをPBSで希釈した1%四酸化オスミウムに浸し、走査型電子顕微鏡のコントラストを高めるために1時間培養します。その後、PBSで基質を2回洗い流します。試料を段階化されたエタノール系列に10分間順次浸して脱水します。

次に、ヘキサメチルジシラザネ500マイクロリットルを加え、5分間培養します。その後、新鮮なヘキサメチルジシラザネに交換し、さらに5分間培養します。その後、余分な溶液を取り除き、サンプルをフルームフードの下で完全に自然乾燥させます。

次に、乾燥した試料を両面導電カーボンテープを使って走査型電子顕微鏡のスタブに取り付けます。試料に約10ナノメートルの金または白金の薄い層をスパッターコーティングし、イメージング用の電子コントラストを高めます。最後に、準備済みのスタブを適切なサンプルホルダーを使って走査型電子顕微鏡に取り込みます。

可能であれば、画像品質を向上させるために一晩チャンバーを空にしてください。その後、適切な倍率を使って5〜15キロボルトの二次電子画像を取得し、バイオフィルムの超構造を可視化します。21日間の潜伏後、クリスタルバイオレット染色により、レプトスピラ・インターロガンおよびレプトスピラ・ビフレクサのポリカーボネートフィルターおよびガラスカバースリップに目に見えるバイオフィルムパターンが明らかになりました。

それぞれの種は点状、分岐、網目状など、独自の建築的足跡を示します。570ナノメートルでの吸収度測定により、レプトスピラ・バイフレクサバイオフィルムの結晶バイオフィルムの結晶バイオレット保持率がすべての時間点でレプトスピラのインターロガンより優れていることが確認され、株内でのバイオマス蓄積量が増加していることが示されました。レプトスピラ・インターロガンのバイオフィルムの走査型電子顕微鏡は、3日前のバイオフィルムに初期の細胞外マトリックス沈着、成熟しチャネル化された基底面、3次元構造を持つ14日目、21日目には高密度な構造を持つ完全なマトリックス固結を捉えました。

当社の最適化されたプロトコルは、同一培養からの補完的な読み取り値を同期させ、堅牢性を高め、変動性を低減し、動的および構造的情報を明らかにし、単一手法で利用可能です。補完分析を統合することで、バイオフィルム評価を標準化し、レプトスピラの動態と構造を明らかにしました。これらは構造と病原性を結びつけ、再現性のある比較研究を強化します。

将来の変異体は、調節とバイオフィルムの形態や動態を結びつけ、環境持続性を明確にし、バイオフィルム情報の妨害や拡散を促進する戦略を評価することを目指します。