RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と​​同定するための方法

このビデオの目的は、免疫沈降法を用いて細胞抽出液からリボ核タンパク質複合体のRNAおよびタンパク質成分を単離し、同定する方法を実演することです。こんにちは、私はミズーリ大学の分子・微生物学および免疫学部門の大学院生で、Eli sso博士のもとで研究しているGarrett Domです。ハイスループットシーケンシングと効率的なマイクロアレイ解析の進歩により、多くの研究および疾患モデルにおいて、グローバルな遺伝子発現と解析が、容易かつ迅速に利用可能なデータ収集形態となりました。

しかしながら、標的遺伝子のmRNAの定常状態レベルは、必ずしもタンパク質の定常状態レベルと直接的に相関するとは限りません。この両者の乖離は、RNA結合タンパク質の相互作用によって引き起こされる、転写後遺伝子調節によるものであると考えられます。

転写後調節は、標的mRNAとリボ核タンパク質複合体を形成することにより、mRNAの局在、安定性、および翻訳に影響を与えます。細胞抽出物中のこの複合体から、未知のde novo mRNA標的を同定することは、RNA結合タンパク質のメカニズムと機能を理解し、その結果としてタンパク質産出に及ぼす影響を明らかにするために極めて重要です。本プロトコルでは、リボタンパク質免疫共沈法（RIP）と呼ばれる、リボ核タンパク質複合体に関連する特定のmRNAを同定するための手法について概説します。

実験を開始する前に、すべての試薬、容器、および器具を揃えておくことが不可欠です。ガラス器具は、Ambion社のRNA ZAPなどのRNaseインヒビターで処理し、その後DEPC処理水で洗浄してRNaseフリーにします。また、すべての試薬がRNaseフリーであることを確認してください。手順の最初のステップは、細胞溶解物からリボ核タンパク質複合体を回収することです。各サンプルにつき2〜5 mgの総タンパク質を得るために、対数増殖期の組織細胞を回収します。通常、150 mmの培養皿2枚で十分です。

ここでは、MB 2 31およびMC sevenヒト乳がん細胞株を回収し、RNA結合タンパク質のリボ核酸相互作用を調査しています。調査対象となる各RNA結合タンパク質について、適切な標的mRNAとRNA結合タンパク質の相互作用を最大化するために、総細胞数とタンパク質量を最適化する必要があることに注意してください。4°Cで約1000 RPMで8〜10分間遠心分離して細胞をペレット化し、氷冷PBSで3回洗浄します。最後の洗浄後、チューブの底を軽く叩き、RNaseおよびプロテアーゼ阻害剤を含む調製済みのポリソーム溶解バッファーと同量の容量で細胞ペレットを再懸濁します。

細胞ペレットの正確な容量を測定し、ピペットで穏やかに混合して細胞の凝集を解消した後、溶解物を氷上で5分間インキュベートすることを推奨します。13,000 G、4°Cで20分間遠心分離して溶解物からデブリを除去し、清澄化した上清をあらかじめ冷却したRNaseフリーのマイクロ遠心チューブに直ちに回収してください。その後、氷上に保持し、-80°Cで保存します。

このライセートは、-80°Cで最大6か月間保存可能です。タンパク質やmRNAの分解につながる可能性があるため、凍結融解の繰り返しは避けてください。IPは速やかに実施することが推奨されます。

標準的なBradfordタンパク質定量法を用いて、タンパク質濃度とライセートの定量を行います。次に、目的の特定タンパク質を単離するための材料を準備します。まず、タンパク質を予備膨潤させます。

Spheroビーズを、5%BSAを添加したN NT twoバッファー中で4°Cで一晩置きます。NT twoバッファーをPASビーズと4:1の比率で使用してください。4°Cで最大数ヶ月間の長期保存が可能です。

使用前に0.1% sodium aziを添加した場合、最終的なビーズとバッファーの比率が1:1になるように、余分なNT twoバッファーを除去します。1.5 mLのRNAフリーマイクロ遠心チューブを使用し、SRO speedスラリーを100 µL分取し、個々のIP反応あたり30 µgの抗体を添加します。例えば、本実験ではマウスIgG1抗体であるwho are抗体を使用しています。

したがって、コントロール抗体にもIgGを使用します。次に、抗体ビーズミックスにNT buffer 2を100〜200 µL加えます。さらに、バックグラウンドRNAに対する抗体コントロールとして、アイソタイプ一致抗体または同種の正常血清を並行して使用する必要があります。

適切な抗体をビーズミックスに加え、4 °Cでエンドオーバーエンド回転させて一晩インキュベートする。使用直前に、氷冷したNT2バッファー1 mLで5回洗浄して抗体コートビーズを調製する。ビーズの洗浄は、4 °Cで13,000 Gにて1〜2分間遠心分離して行う。ハンドピペッターまたはアスピレーターを用いて、上清を慎重に取り除く。

この洗浄により、抗体混合物から未結合の抗体およびRNA汚染物質を除去します。最終洗浄が完了したら、ビーズを再懸濁し、氷冷したNT2バッファー700 µLを加え、続いて標的mRNAを保護するために、RNase inhibitor 10 µL、100 mM DTT 10 µL、EDTA 15 µLを含む各種RNA阻害剤で処理します。NT2バッファーを用いて全量を900 µLにします。

次に、標的複合体を免疫沈降させます。RIP手順後のRNA解析におけるバックグラウンド信号を低減するため、プリクリアステップを行うことを強く推奨します。15 µgのアイソタイプコントロールを用いて、4 °Cで30分間プリクリアを行います。抗体でコーティングされていない、あらかじめ膨潤させたPASビーズを50 µL加えます。

4 °Cで30分間、回転させてインキュベートし、その後、4 °Cで10,000 Gにて遠心分離します。ペレットを回収します。免疫沈降（IP）用に上清を保存してください。

次に、約2〜5 mgのタンパク質を含む、精製・透明化済みライセート100 µLを、調製した抗体ミックスに加えます。ライセートを希釈することで、バックグラウンドを低減させることができます。チューブを密閉し、4 °Cで4時間タンブリングしながらインキュベートします。その後、ビーズを4 °C、5,000 Gで5分間遠心分離してペレット化し、上清は前述の方法に従い-80 °Cで保存し、後の解析に利用できるようにします。ビーズを、氷冷した1 mLのT2バッファーで5回洗浄し、遠心分離します。

その後、ハンドピペッターまたはアスピレーターを用いて上清を除去します。背景ノイズを低減させるために、NT2バッファーにデオキシコール酸ナトリウム、尿素、またはSDSを添加した、より厳格な方法を用いることもあります。標的mRNAの分解を最小限に抑えるため、サンプルは可能な限り氷上で保持し、迅速に操作してください。

最後に、DNaseおよびプロテアーゼK処理を行い、続いてRNA沈殿させることで、リボ核タンパク質RNAを単離します。洗浄後のビーズを、5 µLのRNaseフリーDNase Iを添加した100 µLのN NT two bufferで再懸濁します。サンプルを37 °Cで5〜10分間保持します。1 mLのN NT two bufferを加え、5,000 ×gで5分間遠心分離します。

上清を捨て、SROsペレットを100 µLのNT2バッファー、5 µLのproteinase K（10 mg/mL）、および1 µLの10% SDSで再懸濁します。再懸濁したビーズ混合物を55 °Cのウォーターバスで30分間インキュベートし、10分ごとに軽く弾いて混ぜ合わせます。Proteinase Kがリボ核タンパク質成分の遊離を促進します。その後、ビーズを遠心してペレット化します。

室温で5,000 Gで5分間遠心分離し、約100 µLの上清を回収します。次に、ビーズに200 µLのNT2バッファーを加え、5,000 Gで2分間遠心分離します。約200 µLの上清を回収し、ビーズは廃棄します。

上清を合わせ、300 µLの下層用酸性フェノールを加え、室温で1分間ボルテックスします。その後、室温で最大速度にて1分間遠心分離し、上層を250 µL回収します。

界面を乱すと汚染の原因となるため、細心の注意を払ってください。RNAサンプルに、pH 5.2の酢酸ナトリウム 25 µL、冷却した100%エタノール 625 µL、およびGlycoBlue Mix 5 µLを添加します。よく混ぜ合わせ、-20 °Cで一晩保存します。

さらに、RNAを適切に回収するために GlycoBlue を添加します。GlycoBlue はキャリア分子として機能し、翌日に RNA ペレットの視認性を高めます。チューブを 3～5 回反転させて混ぜ合わせた後、4 °C、12,000 G で 30 分間遠心分離し、上清を捨てます。冷却した 70% エタノール 1 mL を青色のペレットに加え、反転混和またはボルテックスミキサーで混ぜてから、遠心分離します。

4°C、12,000 Gで2分間遠心分離します。上清を捨て、4°C、12,000 Gで1分間さらに遠心分離します。残っている70%エタノールをピペットで取り除き、ペレットを風乾させます。

室温で5分間静置します。20～40 µLのRNase、DNaseフリー水で再懸濁します。これで、NanoDrop分光光度計による定量、およびRNA抽出後の定量的リアルタイムPCRやマイクロアレイ解析などのさらなるダウンストリームアプリケーションに使用可能なサンプルが完成しました。マイクロアレイおよび定量的リアルタイムPCRを実施し、RNA結合タンパク質HuRのmRNAターゲットと、免疫沈降によるそれらの濃縮度を明らかにしました。

ウェスタンブロットによる確認により、リボ核タンパク質の精製が良好に行われたことが明らかになりました。定量PCRでは、IgGコントロールと比較して、標的mRNAであるbeta actinの濃縮倍率が示されています。マイクロアレイ解析では、乳癌細胞株であるMCF-7とMDA-MB-231の間で固有の遺伝子プロファイルが認められました。リボ核タンパク質免疫沈降法は、当グループおよび多くの他の研究グループにおいて、RNA結合タンパク質とそのmRNA標的との相互作用を単離し研究するための優れたツールとして確立されています。本手法は性質および実施において繊細さが求められますが、適切に遂行することで、最近まで発見や解析が困難であったこれらのリボ核タンパク質複合体を単離することが可能です。