RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と​​同定するための方法

このビデオの目的は、免疫沈降法を使用して、細胞抽出物からリボ核タンパク質複合体のRNAおよびタンパク質成分を単離および同定する方法を実証することです。こんにちは、私の名前はギャレット・ドムで、ミズーリ大学の分子微生物学および免疫学部の大学院生で、イーライ・ッソ博士の下で勉強しています。ハイスループットシーケンシングと効率的なマイクロアレイ解析の進歩により、グローバルな遺伝子発現と解析は、多くの研究モデルや疾患モデルにおいて、データ収集の容易で容易に利用できる形式になりました。

しかし、標的遺伝子mRNAの研究状態レベルは、必ずしも定常状態のタンパク質レベルと直接相関するわけではありません。転写後遺伝子調節は、両者の相違を説明する可能性が高いです。RNA結合タンパク質の相互作用によって駆動されます。

転写後調節は、標的mRNAと肋骨核タンパク質複合体を形成することにより、mRNAの局在、安定性、および翻訳に影響を与えます。この複合体の細胞抽出物からこれらの未知のDenovo mRNAターゲットを同定することは、RNA結合タンパク質のメカニズムと機能、およびその結果として生じるタンパク質出力への影響を理解する上で極めて重要です。このプロトコールは、リボタンパク質、免疫免疫沈降、またはRIPと呼ばれる方法の概要を示しており、これにより、リボ核タンパク質複合体に関連する特定のmRNAの同定が可能になります。

実験を開始する前に、すべての試薬、容器、器具を用意することが重要です。RNAフリー アンビオン由来のRNA ZAPなどのR nase阻害剤でガラス製品を処理し、その後dpci処理水ですすいで、すべての試薬がRNAフリーであることが確認されます。手順の最初のステップは、指数関数的に成長する組織細胞を収穫する細胞溶解物から肋骨核タンパク質複合体を収穫して、使用される各サンプルに対して2〜5ミリグラムの総タンパク質を生成することであり、通常は2つのP one 50培養皿で十分です。

ここでは、MB 2、31、およびMCの7つのヒト乳がん細胞株を回収し、RNA結合タンパク質のリボン核相互作用を調査しています。調査対象の各RNA結合タンパク質について、適切な標的mRNAおよびRNA結合タンパク質相互作用を最大化するために、総細胞数とタンパク質量を最適化する必要があることに注意することが重要です。1000RPMで摂氏4度で約8〜10分間遠心分離することにより細胞をペレット化し、氷冷PBSで3回洗浄します 最終洗浄後、チューブの底を静かにフリックし、RNAおよびプロテアーゼ阻害剤を含む等量の調製されたポリソーム溶解緩衝液に細胞ペレットを再懸濁します。

細胞ペレットの正確な量を測定し、混合物を静かにピペットで動かして細胞の塊をバラバラにし、氷上でライセートを5分間インキュベートすることをお勧めします。13, 000 Gで摂氏4度で20分間遠心分離し、破片の溶解物を除去し、透明化した上清を予め冷却したRNAに移します。無料のマイクロ遠心分離管は氷上を保ち、摂氏マイナス80度で保管します。

このライセートは、マイナス80°Cで最大6ヶ月間保存できます。凍結融解サイクルを繰り返すと、タンパク質やmRNAの分解につながる可能性があるため、避けてください。IPはすぐに行うのが最善です。

標準的なBradfordタンパク質アッセイを使用して、タンパク質とライセートの濃度を迅速に定量します。次に、目的の特定のタンパク質を単離するための材料を準備する必要があります。まず、タンパク質を膨潤させます。

Spheroビーズは、摂氏4度で5%BSAを添加したN NTの2つのバッファーで一晩ビーズをビーズで保存します。NT 2 バッファーを 4 対 1 の比率で PAS ビーズで使用します。摂氏4度で最大数ヶ月の長期保存が可能です。

使用前に0.1%アジナトリウムを補充する場合は、余分なNT 2バッファーを取り出して、最終的なビーズとバッファーの比率が1対1になるようにします。1.5ミリリットルのRNAフリーマイクロ遠心チューブを使用して、100マイクロリットルのSROスピードスラリーを除去し、個々のIP反応ごとに30マイクログラムの抗体を追加します。例えば、私たちの実験では、マウスのIgG抗体であるwhoという抗体を使用しています。

したがって、当社のコントロール抗体もIgG抗体です。次に、100〜200マイクロリットルのNT Two Bufferを抗体ビーズミックスに加えます。さらに、アイソタイプが一致した抗体または同じ種由来の全正常血清を、バックグラウンドRNAに対する抗体コントロールとして並行して使用する必要があります。

ビーズミックスに適切な抗体を添加し、摂氏4度でオーバーエンドでタンブリングしながら一晩インキュベートします。1ミリリットルの氷冷NT 2バッファーで5回洗浄することにより、使用直前に抗体コーティングビーズを調製し、13, 000Gで遠心分離によりビーズを4度で1〜2分間洗浄します。ハンドピペッターまたはアスピレーターで上清を慎重に取り除きます。

この洗浄は、抗体混合物から未結合の抗体およびRNA汚染物質を除去するのに役立ちます。最終的な洗浄が完了したら、ビーズと700マイクロリットルの氷冷Tツーバッファーを懸濁し、続いて、10マイクロリットルのRNA、100マイクロリットルのDTTおよび15マイクロリットルのEDTAのうち、標的mRNAを保護するためのさまざまなRNA阻害剤で処理します。NT 2バッファーで容量を900マイクロリットルにします。

次に、標的複合体を免疫沈降させます。RIP手順後のRNA解析のバックグラウンドシグナルを低減するために、15マイクログラムのアイソタイプコントロールを摂氏4度で30分間行うプレクリアステップを使用することを強くお勧めします。50マイクロリットルのプレズ膨潤PASビーズを抗体でコーティングしていないものに加えます。

回転しながら摂氏4度で30分間インキュベートし、摂氏4度で10, 000Gの遠心分離機でインキュベートします。ペレット2個。IPのスーパーナチンを保存します。

次に、調製した抗体ミックスに、約2〜5ミリグラムのタンパク質を含む100マイクロリットルの単離透明溶解液を加えます。希釈ライセートは、バックグラウンドラップチューブとパラフォームを減らして、タイトな天井を確保し、摂氏4度で4時間インキュベートし、摂氏4度で5分間000Gの次のペレットビーズで転倒し、摂氏4度で5分間、前述のようにマイナス80°Cで保存することにより、潜在的な分析のためのスーパーナトを保存します。ビーズを1ミリリットルの氷冷とT2バッファーで5回洗浄し、遠心分離します。

次に、ハンドピペッターまたはアスピレーターでスーパーナチンを取り除きます。NT 2バッファーにデオキシナトリウムコート、尿酸またはSDSを添加することにより、バックグラウンドを低減するために、より厳格な方法を使用することができる。サンプルをできるだけ氷上に保ち、ターゲットmRNAの分解を最小限に抑えるために迅速に作業します。

最後に、DNAおよびプロテイナーゼK処理とそれに続くRNA沈殿を使用して、100マイクロリットルのN NTで再懸濁ビーズを洗浄した後、リボン核タンパク質RNAを単離します。2つの緩衝液に5マイクロリットルのRNAフリーDNAを補充します。サンプルを摂氏37度に5〜10分間保管します。N NT 2バッファーの1ミリリットルを追加し、5、000 Gで5分間回転させます。

SUPERNAT Reeseスピンプロテイン、SROsペレット、NTペレット100マイクロリットル、NT2バッファー、5マイクロリットルのプロテイナーゼK、10ミリグラム/ミリリットル、1マイクロリットルの10%SDSを廃棄し、再懸濁したビーズ混合物を摂氏55度の水浴で30分間インキュベートし、10分ごとに静かにフリックします。プロテイナーゼKは、肋骨核タンパク質成分の放出を助けます。ペレットビーズ。

室温で5分間5, 000 Gを加え、容量が約100マイクロリットルのスーパーネームを収集します。次に、2つのビーズ、200マイクロリットルのNT 2バッファー遠心分離機を5、000Gで2分間追加します。約200マイクロリットルのスーパーナチンを集めてビーズを捨てます。

スーパーナチンを組み合わせ、300マイクロリットルの下層酸性フェノールボルテックスを追加します。室温で1分間、室温で1分間遠心分離します。上層を250マイクロリットル集めます。

インターフェースを乱さないように十分注意してください。RNAサンプルは、5.2 625マイクロリットルの冷却、100%エタノール、および5マイクロリットルのグリコブルーミックスのpHで酢酸ナトリウムの25マイクロリットルを追加します。マイナス20°Cで一晩保存してください。

さらに、RNAの適切な回収を確実にするため。グリコブルーの添加は、翌日、キャリア分子として作用し、3〜5回反転してチューブを混合することにより、RNAペレットの視認性を高めます。1ミリリットルの冷やした70%エタノールを青色ペレットに加え、反転遠心またはボルテックス遠心分離機で混合します。

12, 000 Gで4°Cで2分間サンプルを採取します。スーパーナットを廃棄し、摂氏4度で1分間12, 000 Gで遠心分離します。ピペットと空気乾燥ペレットで残留した70%エタノールを取り除きます。

室温で5分間加えます。20〜40マイクロリットルのRNAで再使用し、DNAフリーの水を使用します。サンプルは、NanoDrop分光法による定量の準備が整い、さらに定量的リアルタイムPCRやRNA単離後のマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーション、マイクロアレイおよび定量的リアルタイムPCRを実施して、RNA結合タンパク質のmRNAターゲットを明らかにし、免疫沈降から得られるそれらの濃縮

ウェスタンブロットによる確認により、タンパク質が誰であるかが明確に分離されます。定量PCRは、IgG oneコントロールと比較したmRNA標的βアクチンの倍濃縮を示しています。マイクロアレイ解析により、MC 7とMB 2 31の間のユニークな遺伝的プロファイルが明らかになる一方で、乳がん細胞株全体の肋骨核タンパク質免疫沈降は、RNA結合タンパク質とそのMRとの間の相互作用を単離および研究するために使用される優れたツールとして確立されています。私たちのグループや他の多くの研究グループによる標的は、性質と実践において敏感ですが、この手順を適切に実行すると、最近まで発見と分析が不可能だったこれらの肋骨核タンパク質複合体の単離が得られます。