蛍光融合タンパク質ベースのレポーターを用いたジェノトキシン誘発性PARP1/PARP2活性化の可視化および定量解析
2026年4月17日
ここでは、固定哺乳類細胞におけるポリ(ADP-リボース)(PAR)濃縮焦点の細胞ベースの可視化、細胞内局在化、定量解析の方法を説明します。このアッセイにより、ジェノトキシン曝露細胞の核におけるDNA損傷によるPARP活性化部位の定量化が可能となり、塩基切除修復や単鎖断裂修復に関連する部位も含まれます。
当研究室では、正常細胞および形質転換細胞におけるPARP1およびPARP2依存のDNA修復およびDNA損傷応答経路を研究しています。この分野の課題は、細胞溶解を避けつつ細胞内のPARP1およびPARP2の活性化を定量的に解析することです。これにより細胞内局在研究が可能になります。
まず、胎児用牛血清375マイクロリットルとペニシリン・ストレプトマイシンフリーDMEMを1.5ミリリットルの無菌マイクロ遠心分離管に追加します。次に、脂質系トランスフェクション試薬10マイクロリットルと必要なプラスミドをチューブに加えます。マイクロ遠心分離チューブを優しく叩き、培地、トランスフェクション試薬、プラスミドDNAを混ぜます。
室温で15〜30分間培養し、DNAおよびトランスフェクション試薬複合体の形成を待ちます。次に、プラスミドとトランスフェクション試薬の混合物を培地を取り出さずに培養した293FT細胞を含む60ミリメートルの皿にドロップ順に加え、細胞をインキュベーターに戻して48時間保存します。次に、トランスフェクトした293FT細胞から培地を採取します。
レンチウイルス粒子を分離するために、収集された培地を無菌の0.45マイクロメートルフィルターでろ過し、レンチウイルス粒子から細胞残骸を分離します。転生のためには、目的の細胞を24時間培養し、細胞の結合度が20%から40%の間であることを確認します。次に、1ミリリットルのウイルス、1ミリリットルの培地、2マイクロリットルのポリブレンを15ミリリットルの円錐形チューブに加え、逆さまに優しく混ぜます。次に、6ウェルプレートから成長培地を取り除きます。
ウイルス、ミディウム、ポリブレンの混合液を各ウェルに加えます。トランスデューション混合の細胞を、32度摂氏、5%二酸化炭素の加湿大気を含むインキュベーターに16〜18時間置きます。カバースリップを含む培養皿ごとに20万個のLivePAR発現細胞をシードし、RNF146アミノ酸(100〜182 EGFP)の発現を検証すること。
細胞をカバースリップに24〜36時間密着させ、培地を調整して複製を始めます。その後、LivePAR発現細胞を与えられた試薬にさらします。細胞を含む培地に直接化合物を加え、カバースリップを塗り、培地を優しく攪拌して化合物を分散させます。
60ミリの皿は37度Cで60〜90分間孵化します。細胞を固定するには培地を取り除き、PBSで洗浄します。細胞に4%ホルムアルデヒドをPBSで15分間室温でプレフィックスします。
ホルムアルデヒドを除去した後、細胞をPBSで3回洗浄します。次に、7:3の比率で冷たいメタノールとアセトンを3ミリリットル加えて固定します。皿をマイナス20度の温度で9分間置きます。
次に、メタノールアセトン溶液を除去します。細胞をPBSで3回洗浄した後、DAPIを含むアンチフェード培地15マイクロリットルをガラススライドにピペットで注ぎます。カバースリップを内側を向いて装着媒体に優しく取り付け、気泡を最小限に抑えます。
カバースリップを中央に固定し、ガラススライドに固定し、側面の端に少量の透明トップコートのネイルエナメルを塗ってシールします。スライドを暗闇に置いてネイルエナメル質を乾かします。画像Jをダウンロードしてインストールした後、画像Jを開き、プラグインをクリックし、マクロを選択しインストールしてマクロテキストファイルLivePAR_Macroをインストールします。
画像J内のすべての共焦点ファイルを開き、元のファイルを保存するためにTIFFファイルとして保存してください。次に、スプレッドシートのドキュメントを開き、Date_CellLineFociAnalysisとして保存します。一度に一つのTIFFファイルを分析してください。
1を押して核を見つけてください。ROIマネージャーのウィンドウが開いたら、すべてのエントリを選択し、追加ボタンを押して核領域を元の画像に重ねます。誤って同定された核を削除し、フレーム内に完全に含まれていない核は除外します。
その後、Freehand Selectionツールで原子核を描き、PAR焦点を定量するために2を押してください。ROIマネージャーで各核を選択し、核ごとの焦点数を数えます。ファイル内のすべての核にスコアを付けた後、定量化されたデータをコピーして開いたスプレッドシート文書に貼り付けます。
同様に、すべてのTIFFファイルに対して分析を繰り返してください。完成後は、選択したソフトウェアで原子核ごとのPAR焦点をプロットします。車両制御細胞では汎細胞のEGFP染色が認められました。
ジェノトキシン処理された細胞は、核内に局在する核焦点の蓄積を示しました。PARP1およびPARP2阻害剤ヴェリパリブによる前処理により、PAR焦点が失われました。時間や治療条件による核ごとのPAR焦点数の定量化も同様の結果を示しました。
このプロトコルにより、ジェノトキシンおよび遺伝子変異に伴うPARP1およびPARP2シグナル伝達軸の活性化を定量化できます。このアッセイでは、従来の免疫蛍光法を用いて、ポリADP-リボースとのタンパク質の共局在を検証しました。今後は、このアッセイをPARP1、PARP2、またはPARP阻害剤の高スループット解析のための遺伝子毒性試験や、PARP1およびPARP2シグナル伝達に関与する新規因子の特定に活用します。
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概要
本記事では、DNA損傷に応答したポリ(ADP-リボース) (PAR) の蓄積を可視化および測定するための、定量的な細胞ベースのアッセイを紹介します。RNF146由来のPAR結合ドメイン (PBD) と強化緑色蛍光タンパク質 (EGFP) を融合させたものを用いることで、本プロトコルでは、細胞溶解を行うことなく、哺乳類細胞におけるPARP1およびPARP2の活性化とPARフォーカスの形成をリアルタイムで解析することが可能です。この手法は、レンチウイルス導入、共焦点顕微鏡観察、および半自動画像解析を組み合わせることで、DNA修復ダイナミクスを評価します。
研究の主要構成要素
科学分野
- DNA修復
- 細胞イメージング
- 分子生物学
背景
- PARは、DNA断裂に応答して主にPARP1およびPARP2によって合成される翻訳後修飾である。
- PARレベルは、合成（PARP1/PARP2）と分解（PARG）の両方によって調節される。
- PAR鎖は、特定のPAR結合ドメイン（PBD）を介して、DNA修復因子およびDNA損傷応答（DDR）因子をリクルートする。
- PARダイナミクスの定量的な生細胞解析は困難であるが、DNA修復プロセスの理解には不可欠である。
研究の目的
- PAR蓄積およびPARP1/PARP2活性化を定量化するための生細胞アッセイを開発すること。
- DNA損傷に応答したPARフォーカスの細胞内局在研究を可能にすること。
- ハイスループットな遺伝毒性試験および新規のPARP経路因子の同定を促進すること。
使用した方法
- RNF146 (PBD/WWEドメイン)-EGFP融合タンパク質をコードするレンチウイルス粒子の作製
- 哺乳類細胞への導入およびLivePAR-EGFP発現の検証
- PAR形成の誘導または抑制を目的とした、ジェノトキシンおよびPARP阻害剤による細胞処理
- 固定、共焦点蛍光顕微鏡観察、およびImageJマクロを用いたPARフォーカスの半自動定量化
主な結果
- ベヒクル対照細胞ではEGFP染色の拡散が見られたが、ジェノトキシン処理細胞では核内にPARフォーカスが認められた。
- PARP1/PARP2阻害剤であるveliparibによる前処理により、PARフォーカスの形成が消失した。
- 定量解析により、処理内容および時間経過に応じて、核あたりのPARフォーカス数が動的に変化することが明らかになった。
- このアッセイは、従来の免疫蛍光法との共局在によって検証された。
結論
- 本プロトコルにより、PARP1/PARP2の活性化およびPAR蓄積の定量的かつライブセル解析が可能になります。
- 本法は、ハイスループットな遺伝毒性試験およびPARP阻害剤のスクリーニングに適しています。
- 本手法を用いることで、PARPシグナリングおよびDNA修復経路に関与する新規因子の特定が可能です。
よくある質問
産業界への適応性と意義
生細胞におけるPARP1/PARP2活性化の定量的可視化は、DNA修復ターゲットのバリデーションにおけるメカニズム的なリスク低減という重要なニーズに応えるものです。この蛍光融合タンパク質ベースのリポーターは、DNA損傷応答ダイナミクスの高コンテンツな細胞内解析を可能にし、初期探索およびリード化合物同定段階における予測の信頼性を向上させます。本アプローチは、遺伝毒性試験や阻害剤スクリーニングに堅牢で定量的なリードアウトを提供することで、ポートフォリオの意思決定を強化します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- ゲノトキシカンスや遺伝的改変に応答したPARP1/PARP2活性化の直接的な定量化を可能にします。
- 生細胞内のDNA損傷部位におけるPAR蓄積を局在化させることで、メカニズム的なリスク低減をサポートします。
- 定量的なイメージングを通じて、DNA修復経路標的の機能的な検証を促進します。
- パイプラインにおけるDNA修復モジュレーターの推進に向けた予測的な信頼性を提供します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- ハイスループットな遺伝毒性およびPARP阻害剤スクリーニングのための、検証済み細胞ベースアッセイを提供します。
- 再現性を確保するため、半自動画像解析を用いてPARフォーカスの定量化を標準化します。
- DNA修復シグナリングに対する化合物影響の、拡張可能なマルチプレックス評価を可能にします。
- ダウンストリームのスクリーニングワークフローに向けた、堅牢な生物学的システムを構築します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- DNA修復経路の解析を、疾患に関連する細胞モデルと整合させます。
- PARP経路モジュレーターの探索から前臨床検証までの一貫性をサポートします。
- トランスレーショナルリサーチにおける、リスク調整後の進展決定のための定量的エンドポイントを提供します。
- ゲノム安定性に関連するPARPシグナリングに関与する新規因子の同定を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本アッセイは、DNA修復ダイナミクスおよびPARPパスウェイ調節の生細胞での定量分析を可能にすることで、創薬から前臨床に至る連続的なプロセスへと組み込まれます。
- 探索生物学： DNA修復ターゲットの仮説検証および経路の解明を支援します。
- スクリーニング： 化合物の評価および阻害剤プロファイリングに、再現性のある定量的なアウトプットを提供します。
- 解析： 比較解析のために、核あたりのPAR fociの画像ベースの測定値を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 初期探索での知見と、DNA修復治療薬の前臨床モデルでの検証を橋渡しします。
- 組織内での再利用： プログラム全体における継続的な遺伝毒性および経路解析のために、再利用可能でスケーラブルなプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：DNA修復ターゲットのバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：生細胞の定量化を標準化し、拡張可能なハイスループットワークフローをサポートします。
- 戦略的価値：堅牢な定量データを提供することで、意思決定（go/no-go）の精度と資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：DNA修復モジュレーターのリスク調整済み優先順位付けおよび開発の推進を可能にします。
実施上の留意点
- レンチウイルス導入、共焦点顕微鏡観察、および定量的画像解析の専門知識が必要です。
- 細胞培養、蛍光イメージング、およびデータ処理のための計算基盤へのアクセスが必要です。
- 再現性を確保するため、アッセイのセットアップおよび解析プロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- プロトコルの最適化により、さまざまな哺乳類細胞株やDNA損傷モデルに適応可能です。
- アッセイの特異性を担保するため、PARP阻害およびゲノトキシン応答の検証済みコントロールに依存します。
