Name: 蛍光融合タンパク質ベースのレポーターを用いたジェノトキシン誘発性PARP1/PARP2活性化の可視化および定量解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T13:48:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学ぶ、蛍光融合タンパク質ベースのレポーターを用いて哺乳類細胞におけるPARP1/PARP2活性化とPAR蓄積を可視化・定量する方法。この技術はDNA修復動態のリアルタイム解析と遺伝毒性スクリーニングに有用である。

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<table><tbody><tr><td>試薬、化学薬品、ペプチド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro;m Durapore steriflip フィルター</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>20 x 20 mm 顕微鏡カバーガラス</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 22-170-371</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A18-1</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿、100 mm</td><td>VWR</td><td>Cat# 25382-166</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿、60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 430166</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート、6ウェル</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-161</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials、2 mL</td><td>VWR</td><td>Cat# 89499-722</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 60-29-7</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# BP231-1</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て滅菌フィルター、0.45 &micro;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>Cat# 15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、200プルーフ</td><td>Decon Labs</td><td>Cat# 2701</td><td></td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>熱処理された胎児ウシ血清</td><td>Atlanta Biologics</td><td>Cat# S11150</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A144-212</td><td></td></tr><tr><td>ハイグロマイシン</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10687010</td><td></td></tr><tr><td>大型キムワイプ</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Cat# 34256</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X GoStix Plus キット</td><td>Takara</td><td>Cat# 631280</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>MNNG</td><td>Molport</td><td>Cat# N493990</td><td></td></tr><tr><td>NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル]-4H-ピリジン-3-カルボキサミド)</td><td>Marie Migaud または NuChem Sciences Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PARG 阻害剤 (PDD00017273)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SML1781</td><td></td></tr><tr><td>PARPi 阻害剤 (Veliparib、ABT-888)</td><td>MedChemExpress</td><td>Cat# HY-10129</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>tBuOOH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 180345000</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-x2 (トランスフェクション試薬)</td><td>Mirus</td><td>Cat# MIR-6006</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>VWR</td><td>Cat# 0694</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (H-1000) アンチフェードマウンティングメディア</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# NC1695563</td><td></td></tr><tr><td>細胞株&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>293-FT&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>(SV40 大T 抗原で形質転換されたヒト胚腎細胞由来)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>LN428&nbsp;</td><td>提供いただいた</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>(ヒトグリoblastoma 腫瘍細胞株)</td><td>Ian Pollack 博士 (ピッツバーグ大学)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>(ヒト hTERT 不死化網膜色素上皮細胞)</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>U2OS&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>(ヒト骨肉腫細胞株)</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>組換えDNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>ラボ在庫# 253</td><td>Addgene, Cat# 12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>ラボ在庫# 254</td><td>Addgene, Cat# 12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>ラボ在庫# 252</td><td>Addgene, Cat# 12259</td><td></td></tr><tr><td>pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR は RNF146 の WWE ドメイン、アミノ酸残基 100-182、EGFP に融合; ハイグロマイシン耐性カセットを含む)</td><td>ラボ在庫# 1727</td><td>Addgene, Cat# 176063&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェアとアルゴリズム&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator (図の準備用)</td><td>Adobe Systems</td><td>バージョン 2024</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>バージョン 10.5.0&nbsp;(Mac OS X)</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/ij/download.html</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光融合タンパク質ベースのレポーターを用いたジェノトキシン誘発性parp1/parp2活性化の可視化および定量解析

Visualization and Quantitative Analysis of Genotoxin-Induced PARP1/PARP2 Activation in Cells Using a Fluorescent Fusion Protein-Based Reporter

蛍光融合タンパク質ベースのレポーターを用いたジェノトキシン誘発性PARP1/PARP2活性化の可視化および定量解析

Poly(ADP-ribose) (PAR) is a polymer of ADP-ribose synthesized by four members of the ADP-ribose polymerase family of enzymes&#8212;PARP1, PARP2, PARP5a, ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

生きた細胞内でユビキチン - プロテアソーム活性をモニターするための方法が記載されている。デグロン - 不安定化のGFP（GFP-DGN）と安定したGFP-dgnFS融合タンパク質が生成され、レンチウイルス発現ベクターを用いて細胞内に伝達される。この手法は、ユビキチン -...

デグロンを使用した生細胞におけるユビキチン·プロテアソーム活性のモニタリング（DGN）·不安定化緑色蛍光タンパク質（GFP）ベースのレポータータンパク質

このプロトコルは、DNA損傷だけでなく、有糸分裂時にその局在化に応答して活性化されたDNA二重鎖切断シグナル伝達タンパク質を可視化するための方法を説明します。...

DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

有糸分裂を受けている癌細胞でナントPJ-34の細胞傷害活性は、ライブ共焦点イメージングによりリアルタイムで文書化されました。...

ライブ癌細胞で共焦点イメージングで観測異常有糸分裂と関連付けられる細胞死

レーザー microirradiation は、細胞の DNA 修復の研究のための便利なツールです。様々 な DNA 損傷を誘発する UVA レーザーの使用のための方法論的アプローチが表示されます。正常な細胞周期; を維持するローカルの microirradiation...

タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

このプロトコルの目標はレーザー microirradiation を使用してさまざまな種類の比較的単純な鎖切断と被害サイト体内に DNA 損傷シグナル伝達と修復因子アセンブリを勉強する、複雑な損傷を含む DNA の損傷を誘発する方法を記述することです。.

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

このプロトコルを記述するカスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC);自分の活性化の最初のステップであるイニシエーター カスパーゼの誘起近接を視覚化に使用することができますイメージング...

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

ここで細胞の蛍光イメージング解析による効率を再封止膜を測定する高スループット蛍光を用いた測定について述べる。この試金は、薬や哺乳類細胞における原形質膜を再シールするターゲット遺伝子をスクリーニングするために使用できます。...

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

この資料では、蛍光タンパク質凝集の効果と蛍光レポーターのコンテキストで新しく,...

酵母におけるポリグルタミン毒性の試金を使用して融合パートナーの蛍光タンパク質の効果

DNA損傷の後、ヒト細胞はゲノムの完全性を回復するために不可欠な修復経路を活性化する。ここでは、DNA修復タンパク質を検出し、その空間的および時間的なリクルートメントを分析し、DNA損傷部位におけるタンパク質とタンパク質相互作用を問い合わせた手段として、間接的な免疫蛍光の方法を説明する。...

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

本プロトコルは、トポイソメラーゼ阻害剤およびホルムアルデヒドによって誘導されるユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化を含む、DNA-タンパク質架橋(DPC)およびそれらの翻訳後修飾(PTM)を検出および定量するための改変方法を強調し、それによってDPCおよびそのPTMの形成および修復の研究を可能にする。...

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

この研究では、催奇形性化学物質を同定するための in vitro 細胞アッセイを提示します。ヒト人工多能性幹細胞(iPS)レポーター細胞において線維芽細胞増殖因子(FGF)/血清応答因子(SRF)シグナル伝達の動態を測定し、このシグナル伝達経路の化学的破壊を定量化することにより催奇形性のリスクを評価した。<br...

ヒト人工多能性幹細胞における線維芽細胞成長因子シグナル破壊のリアルタイムモニタリングに基づく発生毒性アッセイ

学ぶ、蛍光融合タンパク質ベースのレポーターを用いて哺乳類細胞におけるPARP1/PARP2活性化とPAR蓄積を可視化・定量する方法。この技術はDNA修復動態のリアルタイム解析と遺伝毒性スクリーニングに有用である。

蛍光融合タンパク質ベースのレポーターを用いたジェノトキシン誘発性PARP1/PARP2活性化の可視化および定量解析

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