蛍光融合タンパク質ベースのレポーターを用いたジェノトキシン誘発性PARP1/PARP2活性化の可視化および定量解析
April 17th, 2026
ここでは、固定哺乳類細胞におけるポリ(ADP-リボース)(PAR)濃縮焦点の細胞ベースの可視化、細胞内局在化、定量解析の方法を説明します。このアッセイにより、ジェノトキシン曝露細胞の核におけるDNA損傷によるPARP活性化部位の定量化が可能となり、塩基切除修復や単鎖断裂修復に関連する部位も含まれます。
当研究室では、正常細胞および形質転換細胞におけるPARP1およびPARP2依存のDNA修復およびDNA損傷応答経路を研究しています。この分野の課題は、細胞溶解を避けつつ細胞内のPARP1およびPARP2の活性化を定量的に解析することです。これにより細胞内局在研究が可能になります。
まず、胎児用牛血清375マイクロリットルとペニシリン・ストレプトマイシンフリーDMEMを1.5ミリリットルの無菌マイクロ遠心分離管に追加します。次に、脂質系トランスフェクション試薬10マイクロリットルと必要なプラスミドをチューブに加えます。マイクロ遠心分離チューブを優しく叩き、培地、トランスフェクション試薬、プラスミドDNAを混ぜます。
室温で15〜30分間培養し、DNAおよびトランスフェクション試薬複合体の形成を待ちます。次に、プラスミドとトランスフェクション試薬の混合物を培地を取り出さずに培養した293FT細胞を含む60ミリメートルの皿にドロップ順に加え、細胞をインキュベーターに戻して48時間保存します。次に、トランスフェクトした293FT細胞から培地を採取します。
レンチウイルス粒子を分離するために、収集された培地を無菌の0.45マイクロメートルフィルターでろ過し、レンチウイルス粒子から細胞残骸を分離します。転生のためには、目的の細胞を24時間培養し、細胞の結合度が20%から40%の間であることを確認します。次に、1ミリリットルのウイルス、1ミリリットルの培地、2マイクロリットルのポリブレンを15ミリリットルの円錐形チューブに加え、逆さまに優しく混ぜます。次に、6ウェルプレートから成長培地を取り除きます。
ウイルス、ミディウム、ポリブレンの混合液を各ウェルに加えます。トランスデューション混合の細胞を、32度摂氏、5%二酸化炭素の加湿大気を含むインキュベーターに16〜18時間置きます。カバースリップを含む培養皿ごとに20万個のLivePAR発現細胞をシードし、RNF146アミノ酸(100〜182 EGFP)の発現を検証すること。
細胞をカバースリップに24〜36時間密着させ、培地を調整して複製を始めます。その後、LivePAR発現細胞を与えられた試薬にさらします。細胞を含む培地に直接化合物を加え、カバースリップを塗り、培地を優しく攪拌して化合物を分散させます。
60ミリの皿は37度Cで60〜90分間孵化します。細胞を固定するには培地を取り除き、PBSで洗浄します。細胞に4%ホルムアルデヒドをPBSで15分間室温でプレフィックスします。
ホルムアルデヒドを除去した後、細胞をPBSで3回洗浄します。次に、7:3の比率で冷たいメタノールとアセトンを3ミリリットル加えて固定します。皿をマイナス20度の温度で9分間置きます。
次に、メタノールアセトン溶液を除去します。細胞をPBSで3回洗浄した後、DAPIを含むアンチフェード培地15マイクロリットルをガラススライドにピペットで注ぎます。カバースリップを内側を向いて装着媒体に優しく取り付け、気泡を最小限に抑えます。
カバースリップを中央に固定し、ガラススライドに固定し、側面の端に少量の透明トップコートのネイルエナメルを塗ってシールします。スライドを暗闇に置いてネイルエナメル質を乾かします。画像Jをダウンロードしてインストールした後、画像Jを開き、プラグインをクリックし、マクロを選択しインストールしてマクロテキストファイルLivePAR_Macroをインストールします。
画像J内のすべての共焦点ファイルを開き、元のファイルを保存するためにTIFFファイルとして保存してください。次に、スプレッドシートのドキュメントを開き、Date_CellLineFociAnalysisとして保存します。一度に一つのTIFFファイルを分析してください。
1を押して核を見つけてください。ROIマネージャーのウィンドウが開いたら、すべてのエントリを選択し、追加ボタンを押して核領域を元の画像に重ねます。誤って同定された核を削除し、フレーム内に完全に含まれていない核は除外します。
その後、Freehand Selectionツールで原子核を描き、PAR焦点を定量するために2を押してください。ROIマネージャーで各核を選択し、核ごとの焦点数を数えます。ファイル内のすべての核にスコアを付けた後、定量化されたデータをコピーして開いたスプレッドシート文書に貼り付けます。
同様に、すべてのTIFFファイルに対して分析を繰り返してください。完成後は、選択したソフトウェアで原子核ごとのPAR焦点をプロットします。車両制御細胞では汎細胞のEGFP染色が認められました。
ジェノトキシン処理された細胞は、核内に局在する核焦点の蓄積を示しました。PARP1およびPARP2阻害剤ヴェリパリブによる前処理により、PAR焦点が失われました。時間や治療条件による核ごとのPAR焦点数の定量化も同様の結果を示しました。
このプロトコルにより、ジェノトキシンおよび遺伝子変異に伴うPARP1およびPARP2シグナル伝達軸の活性化を定量化できます。このアッセイでは、従来の免疫蛍光法を用いて、ポリADP-リボースとのタンパク質の共局在を検証しました。今後は、このアッセイをPARP1、PARP2、またはPARP阻害剤の高スループット解析のための遺伝子毒性試験や、PARP1およびPARP2シグナル伝達に関与する新規因子の特定に活用します。
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Overview
This article presents a quantitative, cell-based assay for visualizing and measuring poly(ADP-ribose) (PAR) accumulation in response to DNA damage. By using a PAR-binding domain (PBD) from RNF146 fused to enhanced green fluorescent protein (EGFP), the protocol enables real-time analysis of PARP1 and PARP2 activation and PAR foci formation in mammalian cells without cell lysis. The method combines lentiviral transduction, confocal microscopy, and semi-automated image analysis to assess DNA repair dynamics.
Key Study Components
Area of Science
- DNA repair
- Cellular imaging
- Molecular biology
Background
- PAR is a post-translational modification synthesized mainly by PARP1 and PARP2 in response to DNA breaks.
- PAR levels are regulated by both synthesis (PARP1/PARP2) and degradation (PARG).
- PAR chains recruit DNA repair and DNA damage response (DDR) factors via specific PAR-binding domains (PBDs).
- Quantitative, live-cell analysis of PAR dynamics is challenging but essential for understanding DNA repair processes.
Purpose of Study
- To develop a live-cell assay for quantifying PAR accumulation and PARP1/PARP2 activation.
- To enable subcellular localization studies of PAR foci in response to DNA damage.
- To facilitate high-throughput genotoxicity testing and identification of novel PARP pathway factors.
Methods Used
- Production of lentiviral particles encoding RNF146 (PBD/WWE domain)-EGFP fusion protein.
- Transduction of mammalian cells and validation of LivePAR-EGFP expression.
- Treatment of cells with genotoxins and PARP inhibitors to induce or inhibit PAR formation.
- Fixation, confocal fluorescence microscopy, and semi-automated quantification of PAR foci using ImageJ macros.
Main Results
- Vehicle control cells displayed diffuse EGFP staining, while genotoxin-treated cells showed nuclear PAR foci.
- Pretreatment with PARP1/PARP2 inhibitor veliparib abolished PAR foci formation.
- Quantification revealed dynamic changes in PAR foci per nucleus depending on treatment and time.
- The assay was validated by colocalization with traditional immunofluorescence techniques.
Conclusions
- The protocol enables quantitative, live-cell analysis of PARP1/PARP2 activation and PAR accumulation.
- It is suitable for high-throughput genotoxicity testing and screening of PARP inhibitors.
- The method can identify novel factors involved in PARP signaling and DNA repair pathways.
