分離ブロッコリーRNAレポーターを用いた in vitro RNAクラスターにおける分子間RNA塩基対の可視化および定量化

私たちは、スプリットブロッコリーRNAレポーターアッセイを用いて、in vitroでRNAクラスター内の分子間塩基対を検出・定量します。化学的プローブやシミュレーションはRNA相互作用を示唆しますが、直接測定することはできません。このプロトコルにより、RNAクラスター内で直接的かつ正確な評価が可能になります。

in vitro RNA転写用のDNAテンプレートを準備した後、作業面、チューブラック、ピペットをリボヌクレアーゼ除染液で拭きます。ピペッティングのすべての工程ではリボヌクレアーゼフリーのろ過先端を使用してください。転写キットに付属していた反応バッファーとヌクレオチド溶液、ウリジン三リン酸シアニン5(UTP-Cy5)を氷上で解凍します。

使用前にすべてのチューブを2,000gで2秒間遠心分離してください。次にDNA中のチミン塩基の数を計算します。RNA種間で一貫した標識密度を維持しつつ、20マイクロリットルの転写反応に必要なUTPおよびUTP-Cy5の体積を決定します。

次に、提示された試薬を組み合わせて20マイクロリットルの転写反応を準備します。ピペットで上下にピペットし、2,000gで遠心分離機で2秒間よく混ぜます。反応を37度Cで6時間培養した後、キットに付属のデオキシリボヌクレアーゼ1マイクロリットルを加え、ピペッティングで十分に混ぜてから再度遠心分離機で処理します。

その後、37度でさらに15分間孵化します。反応を1.5ミリリットルの管に移します。キットに付属するヌクレアーゼフリー水115マイクロリットルと、酢酸アンモニウムストップ溶液15マイクロリットルを加えます。

混ぜた後、2,000gで2秒間遠心分離機で溶液を保ちます。次に、チューブにフェノールクロロホルム150マイクロリットルを加え、優しく混ぜて相を混ぜます。遠心分離機で16,000g、10分間、摂氏4度で。

その後、上部水相を新しいチューブに移します。移した溶液に等量のクロロホルムを加え、適切な相相互作用を確保するために十分に混ぜます。次に16,000gで4度Cの温度で2分間遠心分離し、再び相分離のプロセスを繰り返します。

その後、約100〜150マイクロリットルの水層を新しいチューブに移します。イソプロパノールを900マイクロリットル加え、よく混ぜます。溶液を別々のチューブに分断した後、サンプルはマイナス20度の温度で一晩または最大1か月間保存します。

RNAサンプルをイソプロパノール16,000gで4度Cで15分間遠心分離します。RNAペレットを乱さずに慎重にイソプロパノールを除去してください。次に、ヌクレアーゼフリー水で調製した70%エタノールを1ミリリットル加えます。

遠心分離機は16,000gで2分間、4度Cで使用。エタノールを除去した後、ヌクレアーゼフリー水で調製した70%エタノールを1ミリリットルチューブに加え、遠心分離を繰り返します。最終エタノール洗浄時には、1,000マイクロリットルのピペットを使ってほとんどのエタノールを除去します。

2,000gで2秒間、作業台上のミニ遠心分離機で遠心分離機を使い、残ったエタノールは20マイクロリットルのピペットで除去します。RNAペレットが乾燥したら、ヌクレアーゼフリーの水20マイクロリットルに再懸浮させます。サンプルは氷に保管し、光から守ってください。

マイクロ体積分光光度計を用いてRNA濃度と純度を測定します。吸収比は260対280ナノメートルで約2.0、260対230ナノメートルの吸収比が2.0より大きいことを確認してください。100ミリモラーのスパーミン溶液と50%ポリエチレングリコール8,000を氷で溶かします。

示された成分を組み合わせて10X RNAリフォールディングバッファーを新たに調製します。ピペッティングで成分を十分に混ぜた後、2,000gの遠心分離機で2秒間、ベンチトップのミニ遠心分離機で処理します。共フォールディング条件として、200マイクロリットルのPCRチューブ内に、in vitroで転写された上または下の配列を持つRNA、RNAリフォールディングバッファー、ヌクレアーゼフリー水を組み合わせます。

先ほど示した通り、ピペットで上下にピペットを使い、遠心分離機で十分に混ざり合います。サンプルを90度で2分間加熱します。すぐにサンプルを室温に移します。

光から守り、1時間孵化させてください。別個の折りたたみ状態の場合、RNAサンプルを200マイクロリットルのPCRチューブで加熱し、すぐに氷に冷やして少なくとも15分間保管します。200マイクロリットルのPCRチューブで、in vitroで転写されたRNAを上部または底部配列、10倍RNAリフォールディングバッファー、ヌクレアーゼフリー水を組み合わせます。

反応を室温で30分間、光から守って培養します。次に、上部と下部のRNAサンプルを1本のPCRチューブにまとめ、ピペットで上下に混ぜて十分に混合します。2,000gの遠心分離機を2秒間、ベンチトップのミニ遠心分離機で使います。

室温で30分間培養します。両方の条件に対して、100ミリモラースパーミンと50%ポリエチレングリコール8,000の1〜2プレミックスを6マイクロリットル加えます。内容物を混ぜた後、2,000gで2秒間、ベンチトップのミニ遠心分離機で離心分離機を置きます。

次に、1ミリモラのDFHBI-1Tを2マイクロリットル混合して反応し、再び遠心分離機で行います。反応をガラスのチャンバー付きカバーグラスに装填します。蒸発を最小限に抑えるために、室内温の暗闇で4時間、カバーをつけて培養します。

ガラスチャンバー付きのカバーガラスを顕微鏡ステージに載せます。レーザーをオンにし、接眼レンズを使ってサンプルを特定し、ピントを合わせます。各Z面でまずシアニン5チャンネルで各領域を画像化するように顕微鏡を設定します。

次に、緑色蛍光タンパク質チャネルを使って同じ関心領域を画像化します。全チャンネルの露光時間を500ミリ秒に設定してください。次に、緑色蛍光タンパク質チャネルのレーザー出力を80%、シアニン5チャネルの出力を40%に設定します。

Zステップサイズ150ナノメートルを用いて、室温下で反応液滴の外側にあるカバースリップ領域をイメージします。その後、画像解析ソフトウェアを使って分子間塩基対を定量化します。RNAのクラスタリング誘導により、両方のRNAは個別または一緒にクラスターを形成しました。

RNAクラスター内のDFHBI-1T蛍光率は、上または下のRNA単独で共折りたたみ条件に比べて有意に低かった。別個の折りたたみ条件では、正規化されたDFHBI-1T信号は0.031で、上または下だけで観測された基準値と同等でした。シュウトップ、シュウボトム、シュアンチトップ、シュアンチボトムはそれぞれDFHBI-1T蛍光が最小限で示されました。

シュウトップとシュウボトムの共折りたたみやシュアンチトップとシュアンチボトムの組み合わせは、分離折りたたみよりも高いDFHBI-1T信号を生み出しました。シュウトップとシュウボトムの共フォールディングにより、正規化されたDFHBI-1T蛍光が5.63倍増加しました。シュウトップとシュウボトムの別々のフォールドは、ベースラインレベルと同等の1.04パール増加のみを示しました。

シュウトップとシュアンチボトム、シュアンチトップとシュウボトムの組み合わせは、同じ向きのペアよりも高いDFHBI-1T蛍光を示しました。シュウトップとシュアンチボトム、シュアンチトップとシュウボトムの共折り合わせにより、それぞれDFHBI-1T蛍光が61.86倍と82.60倍増加しました。これらの混合ペアの個別の折りたたみは、それぞれ2.69倍と4.94倍とより小さい増加をもたらしました。

最も重要な考慮点は、堅牢なシグナル生成にはクラウディング試薬が必要であり、感度は分解されたブロッコリーRNAの効率的な二量体化と折りたたみに依存するということです。このアッセイは、RNAクラスター内の分子間塩基対を研究するためのRNAプルダウンおよびゲル電気泳動アプローチを補完します。このアッセイは、RNA配列、ヘリカーゼ、イオンがRNAクラスター内の分子間塩基対に与える影響を調べることができます。