イムノブロット解析

イムノブロッティングは、ウェスタンブロッティングとも呼ばれ、タンパク質サンプル内でポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体によって認識される特異的抗原を同定するために使用されます。この手順は、通常、1Dまたは2Dゲル電気泳動に続き、分離されたタンパク質のニトロセルロース膜への転写を伴います。これらのメンブレンを一次抗体および二次抗体とインキュベーションし、直接的または間接的に酵素に結合させ、着色または蛍光基質反応を用いてこれらのメンブレン上のタンパク質抗原を可視化します。

このビデオでは、イムノブロッティング法のステップバイステップのデモンストレーションを提供します。こんにちは、私はUVPIのSean Gallagherで、KE大学院研究所のプロテオミクスセンターと協力しています。今日は、イムノブロッティング解析についてお見せします。

これには、タンパク質の分離、メンブレンへのタンパク質のブロッティング、免疫プローブ、発色基質およびキムルミネッセンス基質による可視化など、多くのステップが含まれます。それでは始めましょう。イムノブロッティング法を開始する前に、まずタンパク質サンプルを、小型または標準サイズの1次元または2次元ゲルを用いた電気泳動で分離する必要があります。

抗原性サンプルを調製し、ゲル上のレーンにロードし、染色済みまたはビオチン化タンパク質、分子量標準試料をゲルレーンの1つ以上に含めます。これらのタンパク質マーカーはメンブレンに転写され、免疫染色後のタンパク質のメンブレン配向とサイズを便利に示します。電気泳動が完了したら、イムノブロットを組み立てる準備が整います。

イムノブロットを組み立てるには まず、ゲルサンドイッチを分解し、スタッキングゲルを取り外し、ゲルを30分間平衡化します 室温で転写バッファー内で、この平衡化は、ゲルが平衡化している間の転写中のゲルのサイズの変化を防ぐために必要です。プラスチック転写カセットを保持するのに十分な大きさのトレイに転写サンドイッチを組み立て始め、カセットが覆われるように転写バッファーを充填します。次に、スコッチブライトパッドまたはスポンジをプラスチック転写カセットの下半分に置きます。

次に、ジェルと同じサイズにカットされた濾紙を取ります。トランスファーバッファーで事前に濡らし、スコッチブライトパッドの上に置きます。30分間のゲル平衡化が完了したら、ゲルを濾紙の上に置きます。

ゲルの表面を試験管またはガラス棒で静かに転がして、ゲルと濾紙の間の気泡を取り除きます。または、BioRadキットに付属のBioRadローラーを使用することもできます。濾紙、ジェル、メンブレンを操作するときは、手袋を使用することを忘れないでください。

あなたの手から油が移動をブロックします。次に、転写膜を調製します。メンブレンをゲルと同じサイズにカットし、各端に1〜2ミリメートル

次に、メンブレンを蒸留水にゆっくりと入れ、一方の端を45度の角度にすると、水がメンブレンに吸い上げられ、最終的に表面全体を濡らします。水に素早く2つ挿入すると、空気が閉じ込められ、膜に白い斑点として現れます。タンパク質はこれらの領域に移動しません。

メンブレンが完全に濡れたら、10〜15分間平衡化し、バッファーを移します。この湿潤手順は、ニトロセルロースおよびナイロンメンブレンに有効です。PVDFメンブレンのみが疎水性であり、蒸留水に入れたり、移したりするだけで濡れることはありません。バッファ。

PVDF膜は、最初に100%メタノールに1〜2秒間浸漬し、次に10〜15分間平衡化する必要があります。転送バッファ内。メンブレンを乾かさないでください。

これが発生した場合は、メタノールで再度湿らせてから、トランスファーバッファーで濡らします。メンブレンの準備ができたら、事前に濡らしたメンブレンをゲルの上面に直接置きます。試験管ガラスロッドまたはBioRadローラーをメンブレンの表面に優しく転がして、ゲルとメンブレンの間の気泡をすべて取り除くことを忘れないでください。

次に、ワトマン3mm濾紙をもう一枚濡らします。次に、それをメンブレンの上に置き、再度、すべての気泡を取り除きます。次に、この濾紙の上に別のスコッチブライトパッドまたはスポンジを置きます。

イムノブロットサンドイッチの組み立てを完了するには、転写カセットの上半分を所定の位置にロックします。イムノブロットサンドイッチが組み立てられたので、タンパク質をゲルからメンブレンに移す準備が整いました。転写手順を開始するには、エレクトロブロッティングタンクに転写バッファーを充填し、サンドイッチを含む転写カセットをエレクトロブロッティング装置に入れます。

メンブレンがタンクのアノードまたは正に帯電した側に面するようにサンドイッチすることが重要です。電源のリード線を、エレクトロブロッティング装置の対応するアノード側とカソード側に接続します。この特定の基準ブロッターには、冷却氷ブロックが付属しています。

現在、電気泳動により、タンパク質をゲルからメンブレンに50ボルトで30〜60分間移動させ、冷却するか、冷蔵室で14ボルトで一晩中移動させます。転送が完了したら、電源を切り、装置を分解します。次に、ブライト装置からメンブレンを取り外し、角を切って向きをメモします。

この時点で、メンブレンは乾燥させ、摂氏4度の再封可能なビニール袋に1年間保管できます。さらに処理する前に、乾燥したPVDFメンブレンを少量の100%メタノールに入れてメンブレンを濡らす必要があります。次に蒸留水でメタノールを除去します。

配向が確定したら、ゲルを染色して転写効率を確認します。転写されたタンパク質を視覚化するには、シプロルビーで膜を可逆的に染色するか、カマシブルーインディアインク、ナフトールブルー、またはコロイド金で不可逆的に染色することができます。これらの不可逆的な染色手順は、ナイロンメンブレンとは互換性がありません。

タンパク質がメンブレンに転写されたので、免疫プローブとタンパク質の目視検出に進みます。このステップでは、メンブレン上の固定化されたタンパク質を特異的抗体でプローブし、存在する抗原を同定し、定量します。まず、メンブレンを20ミリリットルのブロッキングバッファーを入れたプラスチック製のインキュベーショントレイに置きます。

バッグを使用する人もいますが、トレイは、異なる一次抗体溶液で多数のストリップを処理する場合に特に役立つため、代わりによく使用されます。次に、密封されたメンブレンを室温で30〜60分間インキュベートし、オービタルシェーカーまたはロッキングプラットフォームで攪拌します。メンブレンがインキュベートしている間に、一次抗体とブロッキングバッファーを希釈します。

希釈は経験的に決定されますが、通常は1〜100〜1000です。ポリクローナル抗体の場合、ハイブリッド上清では100分の1〜1、モノクローナル抗体を含むマウス酸液では1〜1000個以上。インキュベーションが完了したら、ブロッキングバッファーを注ぎます。

緩衝液を希釈した一次抗体と交換し、室温で30〜60分間、絶えず攪拌しながらインキュベートします。次に、100ミリリットルで攪拌してメンブレンを4回洗浄します。ニトロセルロースまたはPVDFフィルター用のTTBS、またはナイロンフィルター用のTBS。

メンブレンを洗浄している間、毎回10〜15分間洗浄し、二次抗体をブロッキングバッファーで希釈します。二次抗体の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ、抗IGコンジュゲート、市販の酵素コンジュゲートが挙げられる。二次抗体は通常、使用前に1〜200〜1〜25,000に希釈されます。

洗浄ステップが完了し、洗浄材料が廃棄された後、希釈した西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ、抗IGコンジュゲートを添加し、室温で30〜60分間、絶えず攪拌しながらインキュベートします。30〜60分後、ビンからメンブレンをはがし、毎回10〜15分、4回洗います。前述のようにTTBSで。

洗浄が完了したら、視覚化ステップに進む準備が整います。しかし、最初に、代替の免疫プローブ手順を示します。この代替免疫プローブ手順は、Vector Labsのベクター染色A BCキットに基づいています。

アビダンビオチン錯体を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはHRPOまたはアルカリホスファターゼA APをビオチン化二次抗体に結合します。本日は、HRPOキットのデモを行います。TTBSは、アバドンビオチンシステムのブロッキングバッファーとして適しています。

しかし、ナイロンフィルターの場合、脱脂粉乳にはビオチンが残留しており、イムノアッセイに支障をきたすため、タンパク質結合試薬が推奨されます。ブロッキングステップでは、オービタルシェーカーまたはロッキングプラットフォームを使用して、一定の攪拌を伴うオープントレイ内のブロッキングバッファーでメンブレンの平衡化を開始するためだけに使用する必要があります。メンブレンが平衡化している間に、メンブレンを室温で30〜60分間インキュベー

一次抗体溶液を調製します。ニトロセルロースまたは高感度のアデンのPVDFメンブレンにはTTBSを使用してください。ビオチンシステム。

一次抗体を含むセラの希釈は、一般に1000分の1から100,000分の1の範囲です。化学発光化学を使用するには、より広い範囲の希釈が必要です。私たちの場合、発色性を示しています。

私たちは、一次の 5 、 000 分の 1 の希釈を使用しています。e平衡化が完了したら、ブロッキングバッファーを取り出します。次に、メンブレンを覆うのに十分な一次抗体溶液を添加します。

メンブレンを室温で30分間インキュベートし、30分後に穏やかに揺とらいます。ニトロセルロースのTTBSでメンブレンを5分間隔で3回洗浄します 洗浄ステップ中に、1滴のビオチン化抗体を10ミリリットルのTTBSで希釈することにより、ビオチン化二次抗体溶液を調製します。洗浄ステップが完了したら、二次抗体溶液を添加します。

メンブレンを室温で30分間インキュベートし、メンブレンを二次抗体とインキュベートしながらゆっくりと揺さぶります。これを行うには、アバドンビオチンHRPOを準備します。2滴のvti染色試薬Aと2滴の試薬Bを10ミリリットルに混合します。

ニトロセルロースのTTBS。二次抗体のインキュベーションが完了したら、室温で30分間インキュベートします。メンブレンをTTBSまたはTBSで15分間に3回洗浄します。

次に、アビダンビオチン酵素溶液をメンブレンに加え、室温で30分間ゆっくりと揺さぶってインキュベートします。次に、メンブレンをTTBSで10分間隔で3回洗浄します。免疫プローブ手順が完了したので、膜結合タンパク質を発色基質で視覚化する準備が整いました。

この最後の可視化ステップでは、基板4、CN dab、slash、ICL 2、およびTMBを、ウマダイザビ、ペルオキシダーゼベースの免疫検出手順で一般的に使用します。イムノプローブ手順中の最終的なメンブレン洗浄をTTBSで行った場合、メンブレンを室温で50ミリリットルで15分間洗浄しました。TBSは、膜を発色可視化溶液に配置します。

タンパク質バンドは10〜30分で現れるはずです。30分間のインキュベーション後、基質反応混合物を廃棄し、蒸留水を加えて反応を終了します。イムノブロッティングは、1Dまたは2D電気泳動後に特定のタンパク質の存在を検出するために、何千ものラボで使用されている多段階の手順です。

免疫血液分析の方法をお見せしました。というわけで、これだけです。あなたの実験に頑張ってください、そして見てくれてありがとう。