2.9: 플라스미드 정제

플라스미드는 원형, 여분의 염색체, DNA 분자이며 분자 생물학에서 특정 DNA 단편에 대한 운반체 또는 벡터로 작용합니다. 박테리아는 플라스미드를 복제하는 데 사용되므로 관심 DNA가 대량으로 생성됩니다. 연구자가 박테리아에서 플라스미드를 얻는 과정을 플라스미드 정제라고 하며, 이에 대해서는 이 비디오에서 설명합니다.

분명히 플라스미드 정제에는 플라스미드 정제가 포함되지만 정확히 무엇을 의미합니까? 플라스미드를 정제하려면 박테리아 염색체, 단백질, 박테리아 막 및 박테리아 리보솜에서 분리해야 합니다.

플라스미드 정제를 위한 다양한 키트가 존재하지만, 플라스미드 정제의 기본 원리는 모두에게 동일하게 유지됩니다. 먼저, 선택한 박테리아 콜로니는 올바른 항생제를 함유한 적절한 배양 배지에서 성장합니다. 플라스미드에 의해 암호화된 항생제 내성 유전자 덕분에 플라스미드를 포함하는 박테리아만 이 배지에서 자랄 수 있습니다. 박테리아는 높은 pH에서 수확되고 용해됩니다. pH를 중화하고 소금을 첨가한 다음 혼합물을 회전시켜 파편과 게놈 DNA를 제거합니다.

중화된 세포 용해물을 실리카 컬럼에 첨가합니다. 플라스미드 DNA는 음이온 교환(negative ion exchange)이라는 메커니즘을 통해 컬럼에 부착되는 것으로 여겨지며, 여기서 강한 음이온인 DNA는 양이온 염 브리지를 통해 음전하를 띤 컬럼에 결합합니다. 단백질과 같은 용해물에서 다른 물질은 높은 염 완충액으로 컬럼을 통해 세척됩니다. 마지막으로, 정제된 플라스미드는 저염 완충액이 추가되어 염교를 파괴할 때 컬럼에서 방출됩니다.

이 절차를 위해 실험실 가운, 일회용 장갑 및 보호 고글을 착용해야 합니다.

원하는 플라스미드 DNA로 형질전환된 박테리아 배양물은 적절한 항생제를 함유한 성장 배지에서 하룻밤 동안 성장해야 합니다. C 쉐이킹 인큐베이터.

다음날, 박테리아 배양액은 원심분리에 의해 펠릿화되고 상층액은 제거됩니다. 나머지 펠릿은 용해 완충액에 재현탁됩니다.

일단 재현탁되면 박테리아는 용해 완충액이 추가되는 더 작은 튜브로 전달될 수 있습니다. 용해 완충액은 pH가 높으며 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate)과 같은 세제를 함유하고 있어 박테리아 막을 파괴하여 박테리아를 용해시킵니다. 용액은 용해 완충액을 추가하면 흐려지고 혼합 후 용액이 더 투명해집니다. 게놈 DNA를 전단하거나 분리할 수 있으므로 혼합물을 와류로 만들어서는 안 되며, 이는 플라스미드 DNA 정제를 오염시킬 수 있습니다.

그런 다음 중화 완충액을 첨가하여 알칼리 조건을 중화하고 pH를 낮춥니다. 게놈 DNA와 이에 결합된 모든 단백질을 부드럽게 혼합하면 플라스미드 DNA는 용액에 남아 있습니다. 다시 한 번 와류를 피하여 플라스미드가 게놈 DNA 오염이 없도록 하십시오.

그런 다음 혼합물을 원심분리하고 게놈 DNA/단백질 침전물을 펠렛화합니다. 상등액에는 플라스미드 DNA와 용해성 단백질이 포함되어 있습니다.

이 상등액은 디캔팅(decanting), 붓기 위한 멋진 이름 또는 피펫팅(pipetting)을 통해 컬럼에 배치됩니다. 펠릿은 버릴 수 있습니다.

다음으로, 고염분 세척 완충액은 DNA가 실리카에 결합된 상태로 유지되는 동안 컬럼을 통과합니다. 고염 완충액을 사용한 반복적인 세척 단계는 엔도뉴클레아제, RNA, 단백질, 염료 및 저분자량 불순물을 제거합니다. 세척 단계의 플로우 스루는 폐기해야 합니다. 마지막 세척 단계 후에는 버퍼가 남아 있지 않고 필터가 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 플라스미드 DNA는 여전히 필터에 있습니다.

플라스미드 DNA는 멸균수 또는 용출 완충액으로 용리됩니다. DNA는 다양한 응용 분야에서 즉시 사용할 수 있습니다.

정제 후 플라스미드의 순도를 확인하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 분광계는 플라스미드 DNA의 농도를 결정하기 위해 서로 다른 파장에서의 흡광도를 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 정제된 플라스미드의 아가로스 겔 분석은 플라스미드가 올바른 크기이고 오염 물질이 없는지 확인할 수 있습니다. 이 단계는 게놈 DNA 오염이 없고 플라스미드가 박테리아에서 변형되지 않았음을 보장합니다.

플라스미드 정제 절차는 다양한 플라스미드 크기, 복제 수, 배양 부피를 수용하도록 수정할 수 있으며 결합, 세척 및 용리 단계를 위한 다양한 장비를 포함할 수 있습니다. 수율은 플라스미드 제제 간의 가장 두드러진 차이점 중 하나이며, 원하는 수율에 따라 종종 minipreparation 또는 miniprep, midiprep, maxiprep 및 megaprep으로 나뉩니다.

다운스트림 응용 분야와 관련하여, 플라스미드 정제 후에 일반적으로 뒤따르는 한 가지 절차는 transfection이며, 이는 플라스미드 DNA를 진핵 세포에 도입하는 것과 관련이 있습니다. 종종 transfection 실험의 목표는 여기에서 볼 수 있는 이미지에서 뉴런을 표지하는 것과 같은 리포터 단백질로 세포와 조직의 구조를 시각화하는 것입니다.

때로는 여러 정제 분취제에 의해 정제된 여러 플라스미드가 동일한 박테리아에 도입될 수 있으며, 이에 따라 플라스미드에 의해 암호화된 여러 효소의 생산을 통해 전체 생합성 경로를 재생할 수 있습니다. 그 결과 세포에서 여기 보이는 항생제와 같은 복잡한 화합물이 생성됩니다.

정제된 플라스미드는 박테리아에 재도입되어 플라스미드에 의해 인코딩된 많은 양의 단백질을 생성할 수 있습니다. 여기에서 표적 단백질을 분리하기 위해 친화성 정제(affinity purification)라는 기술을 수행하기 전에 박테리아 세포가 균질화되고 용해되는 것을 볼 수 있습니다. 정제된 단백질이 결정화되고 그 구조가 확인됩니다.

당신은 방금 JoVE의 플라스미드 정제에 대한 소개를 시청했습니다. 이 동영상에서는 이 방법의 기본 원리, 단계별 설명 및 플라스미드 준비의 몇 가지 응용 분야에 대해 논의했습니다. 언제나 그렇듯이 시청해 주셔서 감사합니다!