Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Summary

Dieser Artikel wird detailliert die Verfahren zur Messung der Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie.

Abstract

Calpaine sind allgegenwärtig intrazellulären Calcium-sensitiven, neutral Cystein-Proteasen

Protocol

Bereiten Sie Reagenzien

Hinweis: Alle PBS enthält Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +}

1. Nachweisreagenz
   Add 20 um 7-Amino-4-chlormethyl Cumarin, t-BOC-Leucin-methioninamid (BOC-LM-CMAC) auf Raumtemperatur PBS. Jede Zellsuspension erfordert 2mL Nachweisreagenz.
2. 1% Paraformaldehyd (Fixed Cells)
   Verdünnen Sie 4% Paraformaldehyd Stammlösung bei Raumtemperatur PBS. Aliquot 1ml 1% Paraformaldehyd jedem FACS-Röhrchen. Drei FACS Röhrchen für jede experimentelle Bedingung erforderlich sind (zB 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 brauchen 9 FACS-Röhrchen)
3. PD150606 (Calpain-Inhibitor)
   Rekonstituieren PD150606 in DMSO in einer Endkonzentration von 100 mM. Schützen Sie dieses Reagenz und alle Zellen mit Inhalt vor Licht behandelt für die Dauer des Experiments.
4. PD98059 (MEK1 Inhibitor)
   Rekonstituieren PD98059 in DMSO in einer Endkonzentration von 50mM.

Bereiten Cells

1. Wachsen 32Dkit Zellen bei 5 x ⁰⁵ bis 1 Oktober x 10 ⁶ Zellen pro ml in Opti-MEM Medium mit 5% fötalem Rinderserum, WEHI-3 Überstand als eine Quelle von IL-3 (oder eine andere Quelle für IL-3, wie ergänzt als rekombinantes Protein), 0,1% 2-Mercaptoethanol und Antibiotika.
2. Sammeln Sie 12 x 10 ⁶ Zellen 32Dkit in drei 15 mL Falcon-Röhrchen (4 x 10 ⁶ Zellen pro Röhrchen).
3. Pellet die Zellen bei 1000 rpm für 5 Minuten bei 15 ° C.
4. Den Überstand aspirieren. Resuspendieren der Zellen in 2 ml Raumtemperatur PBS.
5. Gönnen einer Zelle Fahrwerk mit 50 &mgr; PD150606. Sicherstellen, dass die Probe von Licht durch das Abdecken der Falcon-Röhrchen mit Alu-Folie geschützt. Vortex kurz danach für 20-30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
6. Treat der zweiten Zellsuspension mit 20 um PD98059. Platte die Zellen in einer 35-mm Gewebe Kulturschale und Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C.

Calpain Assay in fixierten Zellen

1. Während der Proben mit PD150606 sind Inkubation beginnen die Calpain-Assay auf den unbehandelten Proben. Beginnen Sie, indem 2 ml Nachweisreagenz jeder Zellsuspension. Unmittelbar 1ml der Zellsuspension / Nachweisreagenz Mischung auf die vorbereiteten FACS-Röhrchen mit 1% Paraformaldehyd (0 Minuten Zeitpunkt).
2. Inkubieren Zellsuspensionen mit Nachweisreagenz für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Dann 1ml der Zellsuspension zu einem FACS-Röhrchen mit 1 ml 1% Paraformaldehyd.
3. Weiter Inkubation der Zellsuspensionen mit Erkennung Mischung für weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur. Dann 1ml der Zellsuspension zu einem FACS-Röhrchen mit 1 ml 1% Paraformaldehyd.
4. Wiederholen Sie die Calpain-Assay auf 32Dkit Zellen, die mit Inhibitoren behandelt wurden.
5. Fix Zellen über Nacht im Dunkeln bei 4 ° C.
6. Am nächsten Tag Pellet die Zellen bei 1800 rpm für 5 Minuten bei 15 ° C.
7. Den Überstand aspirieren. Resuspendieren der Zellen in 750uL PBS. Legen Zellen auf Eis und halten in der Dunkelheit.

Erfassung von Daten für die fixierten Zellen

1. Analysieren Sie die Zellen mit einer LSR II (BD Bioscience). Die Filter sind für die Lightwave Xcyte (UV)-Laser, Anregung Linie 355nm und Laserleistung 25mW, die Emission von 405 und 450 nm für Substrat und Produkt bzw. eingestellt. Bandpass-Filter für Substrat und Produkt sind 405/20 und 450/50. Langpassfilter für Substrat und Produkt sind 405 und 450. Die PMT-Spannung wurde auf 350-375 für Substrat und 325-350 für das Produkt eingestellt.
2. Set-up eine BD FACSDiva Experiment mit den folgenden Parametern: forward scatter; side scatter; Indo-1 Blue (log); Indo-1 Violet (log). Auf dem Arbeitsblatt einrichten die folgenden Grafiken: forward scatter vs side scatter Dot-Plot mit einem Tor an lebenden Zellen (Abbildung 1a), Indo-1 Blue-Histogramm, Indo-1 Violet Histogramm, Indo-1 Blue vs Indo-1 Violet Dot-Plot.
3. Kalibrieren Sie den LSR II mit AlignFlow und AlignFlow sowie fluoreszierende Kügelchen (Invitrogen). Die PMT-Spannung soll an die Spitze des Bead-Fluoreszenz-Histogramm in dem gleichen Kanal vor jedem Experiment Ort sein.
4. Begin Erfassung von Daten über die 32Dkit Zellen in der 0-Minuten-Zeitpunkt. Stellen Sie Parameter Spannungen wie nötig. Erfassen und speichern, 10.000 Ereignisse pro Probe.
5. Wiederholen Sie die Übernahme für jede Probe, Spülen der Maschine mit FACS-Puffer zwischen den einzelnen Röhre.
6. Export der Daten. Stellen Sie sicher, LSR II ist nach Instituts-Richtlinien gereinigt.

Calpain Assay in lebenden Zellen

1. Bereiten Sie die Zellsuspensionen wie oben, ohne PD150606. Bringen Sie die Proben an die LSR II und Filter einrichten und Parameter wie oben. Richten Sie das Arbeitsblatt wie oben. Fügen Sie eine große Dot-Plot zeigt Indo-1 Blue-Zeit. Stellen Sie das Programm, um die maximale Zahl erwerbenber von Veranstaltungen (kein Stop-Tor).
2. Add 50 &mgr; PD150606 zu einer Zellsuspension von 32Dkit Zellen. Halten Sie die Probe im Dunkeln und bei Raumtemperatur inkubieren für 20-30 Minuten.
3. Begin Erfassung von Daten über die 32Dkit Zellsuspension ohne PD150606. Verwenden Sie eine geringe Strömungsgeschwindigkeit von 200-300 Ereignisse pro Sekunde. Nach 30 Sekunden bis 1 Minute den Schlauch aus der Maschine. Add 20 um BOC-LM-CMAC zu den Zellen. Vortex kurz danach weiterhin den Erwerb der Daten.
4. Erfassung von Daten für 10-20 Minuten oder bis der Calpain-Aktivität Plateaus.
5. Wiederholen Sie die Schritte 3 und 4 mit 32Dkit Zellen mit PD150606 behandelt.
6. Export der Daten. Stellen Sie sicher, LSR II ist nach Instituts-Richtlinien gereinigt.

Calpain Assay in Complex (Mixed) Zellpopulationen

* Dieses Experiment wird 32Dkit Zellen in einer Zellsuspension aus einer Maus-Milz geerntet zu identifizieren.

1. Ernte der Milz von jeder Maus. Lyse der roten Blutkörperchen mit NH ₄ Cl für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
2. Bereiten Sie einzelne Zellsuspensionen in 2 ml PBS.
3. Teilen Sie jede Zellsuspension in zwei Teile. Gönnen 1 Zelle Fahrwerk mit 50 &mgr; PD150606 für 20-30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
4. Gehen Sie wie oben für die Calpain Assay in fixierten Zellen (Schritte 1-6)
5. Den Überstand aspirieren. Waschen Sie die Zellen in 500μL PBS. Den Überstand aspirieren.
6. Resuspendieren der Zellen in 200 ul Färbepuffer mit 2% BSA. Inkubieren für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
7. Bereiten Sie den primären Antikörper (FITC-anti-Maus CD117). Der Antikörper sollte bei einer Verdünnung von 1:200 in Färbepuffer verwendet werden. Sicherstellen, dass die Antikörper im Dunkeln gehalten wird.
8. Add 200 ul primären Antikörpers zu den Zellen. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
9. Fügen Sie 400μL PBS, um die Lautstärke für die Durchflusszytometrie erhöhen. Legen Sie die Zellen auf Eis und halten in der Dunkelheit.
10. Gehen Sie wie in Acquire Daten für fixierte Zellen beschrieben. Add FITC, um die Parameter und verfügen über ein Histogramm für FITC auf dem Arbeitsblatt.

Analyse und repräsentative Ergebnisse

1. Analysieren von Daten mit FlowJo (Treestar). Tor an lebenden Zellen auf Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht-Profil (Abb. 1a) basiert. Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenz für Indo-Blue aus der lebensfähigen Zellen Tor (Abb. 1b).
2. a) Für die gemischten Zellpopulation
   • Verwendung FITC Fluoreszenz-Histogramme und Dot-Plots der 32Dkit Bevölkerung identifizieren
   • Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenz für Indo-Blue der 32Dkit Bevölkerung
3. Verwenden Sie Microsoft Excel, um Graphen die mittlere Fluoreszenz (Abbildung 2a). Berechnen Sie die Steigung der Geraden zwischen 5 und 10 Minuten. Graph die Steigung als Balkendiagramm an Calpain-Aktivität in den Zellen zu bestimmen (Abbildung 2b).

Abbildung 1a. Bestimmung lebenden Zellen auf Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht-Profil.

Abbildung 1b. Mittlere Fluoreszenz Wechsler 10 Minuten Zeit, natürlich.

Abbildung 2a. Representative Graph des durchschnittlichen Fluoreszenz.

Abbildung 2b. Calpain-Aktivität in 32Dkit Zellen mit Inhibitoren.

Discussion

Die Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Zellen 32Dkit hat in diesem Video-Protokoll bestimmt. Die Behandlung der Zelllinie mit dem Calpain-Inhibitor PD150606 führte zu einer vollständigen Hemmung von Calpain-Aktivität in den Zellen. Darüber hinaus führte die Behandlung mit dem Inhibitor PD98059 MEK1 in eine vollständige Hemmung von Calpain-Aktivität in den Zellen. ERK ist ein wichtiger Aktivator von Calpain-2 ^3. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Calpain-2-Aktivität überwiegt in der 32Dkit Zellen ist. Aktuelle Arbeiten in unserem Labor untersucht die Folgen der erhöhten Calpain-Aktivität und die Beiträge von Calpain-1 und Calpain-2 bei Leukämie.

Dieses Protokoll Details der ersten durchflusszytometrischen basierender Assay zur Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen zu messen und kann verwendet werden, um den Mechanismus von Calpain Regulierung und ihre Rolle in pathologischen Prozessen mit intakten Zellen zu verstehen.

Dieses Protokoll kann geändert werden, um die Auswirkungen von Inhibitoren oder Gen-Manipulationen an Calpain-Aktivität zu untersuchen. Darüber hinaus kann dieses Tests verwendet werden, um Calpain-Aktivität in einer komplexen Mischung von Zellen, wie zB Nabelschnurblut oder zu identifizieren und zu messen Calpain-Aktivität in Zell-Subpopulationen aus der Milz isoliert zu messen.

Dieser Test unterscheidet nicht zwischen Aktivität durch verschiedene Isoformen von Calpain erzeugten unterscheiden. Genetische oder pharmakologische Reagenzien, die Knock-down oder hemmen bestimmte Calpainen kann verwendet werden, um dieses Problem zu beheben sein.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde	Invitrogen		Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C
PD150606	Invitrogen		Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.
PD98059	Cell Signaling Technology
AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth.