Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Summary

Este artículo detallará el protocolo para la medición de la actividad de la calpaína en células fijadas y la vida mediante citometría de flujo.

Abstract

Calpaínas son omnipresentes intracelular, sensible calcio, cisteína proteasas neutras

Protocol

Preparar los reactivos

Nota: Todas las PBS contiene Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +}

1. Detección de los reactivos
   Añadir 20μM 7-amino-4-clorometil cumarina, t-BOC-leucina-metionina amida (BOC-LM-CMAC) a temperatura ambiente PBS. Cada suspensión de células se requieren reactivos de detección de 2 ml.
2. Paraformaldehído al 1% (células fijas)
   Diluir al 4% de paraformaldehído en solución de reserva temperatura ambiente PBS. Alícuota de 1 ml de paraformaldehído al 1% a cada tubo FACS. Tres tubos de FACS se requieren para cada condición experimental (por ejemplo, 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 necesitan 9 tubos FACS)
3. PD150606 (inhibidor de la calpaína)
   Reconstituir PD150606 en DMSO a una concentración final de 100 mm. Proteja el reactivo y todas las células tratadas con ella de la luz durante la duración de este experimento.
4. PD98059 (inhibidor de MEK1)
   Reconstituir PD98059 en DMSO a una concentración final de 50 mm.

Prepare las células

1. Se cultivan las células 32Dkit a ⁵ x 10 5 a 1 x 10 ⁶ células por ml de Opti-MEM suplementado con los medios de comunicación fetal al 5% de suero bovino, WEHI-3 sobrenadante como fuente de IL-3 (o cualquier otra fuente de IL-3 como como proteína recombinante), el 0,1% de 2-mercaptoetanol y antibióticos.
2. Tomar 12 x 10 ⁶ células 32Dkit en tres tubos Falcon de 15 ml (4 x 10 ⁶ células por tubo).
3. Que sedimenten las células a 1000 rpm durante 5 minutos a 15 ° C.
4. Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 2 ml de PBS a temperatura ambiente.
5. El tratamiento de una suspensión celular con 50 micras PD150606. Asegurar que la muestra está protegido de la luz por la que cubre el tubo Falcon con papel de aluminio. Vortex brevemente y luego se incuba durante veinte a treinta minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
6. El tratamiento de la suspensión celular en segundo lugar con 20μM PD98059. Placa de las células en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm y se incuba durante 2 horas a 37 º C.

Calpaína ensayo en células fijas

1. Mientras que las muestras se incuban con PD150606, comenzará el ensayo de la calpaína en las muestras no tratadas. Comience por la adición de reactivos de detección de 2 ml de cada suspensión celular. Inmediatamente agrega 1 ml de la suspensión celular / mezcla de detección reactivos a los tubos previamente preparado FACS con paraformaldehído al 1% (0 puntos minutos de tiempo).
2. Incubar las suspensiones de células con el reactivo de detección durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añadir 1 ml de la suspensión celular a un tubo con 1 mL FACS paraformaldehído al 1%.
3. Continuar la incubación de las suspensiones celulares con la mezcla de detección por otros 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añadir 1 ml de la suspensión celular a un tubo con 1 mL FACS paraformaldehído al 1%.
4. Repita el ensayo de calpaína en células 32Dkit que han sido tratados con inhibidores.
5. Fijar las células durante la noche en la oscuridad a 4 ° C.
6. Al día siguiente, que sedimenten las células a 1800 rpm durante 5 minutos a 15 ° C.
7. Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en PBS 750uL. Colocar las células en hielo y mantener en la oscuridad.

Adquisición de datos para las células fijas

1. Analizar las células utilizando un LSR II (BD Bioscience). Los filtros se establecen para el Xcyte Lightwave (UV) con láser, la excitación línea 355nm y el láser de 25mW de potencia, emisión de 405 y 450 nm para el sustrato y producto, respectivamente. Filtros de paso de banda de sustrato y de producto son 405/20 y 450/50. Filtros de paso largo por el sustrato y productos son 405 y 450. El voltaje de PMT fue creada en el 350-375 de sustrato y 325-350 para el producto.
2. Puesta en marcha un experimento BD FACSDiVa con los siguientes parámetros: dispersión frontal, dispersión lateral; Indo-1 Blue (log), Indo-1 Violeta (log). En la hoja de establecer los siguientes gráficos: dispersión frontal versus dispersión lateral gráfico de puntos con una puerta en las células vivas (Figura 1a), Indo-1 histograma azul, Indo-1 histograma violeta, Indo-1 Azul vs Indo-1 Violeta gráfico de puntos.
3. Calibrar el II LSR con AlignFlow y AlignFlow más perlas fluorescentes (Invitrogen). El voltaje de PMT debe ser ajustada para colocar el pico del histograma de fluorescencia de cuentas en el mismo canal antes de cada experimento.
4. El proceso de adquisición de datos utilizando las células 32Dkit en el punto 0 minutos de tiempo. Ajustar los voltajes de parámetros según sea necesario. Adquirir y registrar 10.000 eventos por muestra.
5. Repetir la adquisición de cada muestra, el enjuague de la máquina con tampón FACS entre cada tubo.
6. Exportar los datos. Asegúrese de LSR II se limpia de acuerdo a las directrices del Instituto.

Calpaína ensayo en células vivas

1. Preparar las suspensiones de células que el anterior, sin PD150606. Llevar las muestras a la II LSR y establecer filtros y parámetros que el anterior. Establecer la hoja de trabajo que el anterior. Incluya un diagrama de puntos que muestra gran Indo-1 azul en función del tiempo. Configurar el programa para adquirir el numero máximonúmero de eventos (no hay puerta de parada).
2. Añadir 50 micras PD150606 a una suspensión celular de las células 32Dkit. Mantener la muestra en la oscuridad y se incuban a temperatura ambiente durante 20-30 minutos.
3. Proceso de adquisición de datos sobre la suspensión de células 32Dkit sin PD150606. Use un caudal bajo de 200 a 300 eventos por segundo. Después de 30 segundos a 1 minuto retirar el tubo de la máquina. Añadir 20μM BOC-LM-CMAC a las células. Vortex brevemente y luego continuar la adquisición de los datos.
4. Adquirir datos durante 10-20 minutos o hasta que la actividad de la calpaina mesetas.
5. Repita los pasos 3 y 4 con las células tratadas con 32Dkit PD150606.
6. Exportar los datos. Asegúrese de LSR II se limpia de acuerdo a las directrices del Instituto.

Calpaína ensayo en el complejo de las poblaciones de células (Mixto)

* Este experimento identificar las células 32Dkit en una suspensión de células recolectadas a partir de un bazo de ratón.

1. Cosecha del bazo de cada ratón. Lisis de los glóbulos rojos con NH ₄ Cl durante 10 minutos a temperatura ambiente.
2. Preparar suspensiones de células individuales en 2 ml de PBS.
3. Dividir cada suspensión de células en dos. El tratamiento de una suspensión celular con 50 micras PD150606 durante 20-30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
4. Siga el procedimiento anterior para el ensayo de calpaína en células fijas (pasos 1-6)
5. Aspirar el sobrenadante. Lavar las células en 500μL de PBS. Aspirar el sobrenadante.
6. Resuspender las células en un tampón de tinción de 200μL con 2% de BSA. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
7. Prepare el anticuerpo primario (FITC anti-ratón CD117). El anticuerpo se utilizó en una dilución 1:200 en buffer de tinción. Asegúrese de que el anticuerpo se mantiene en la oscuridad.
8. Añadir el anticuerpo primario 200μL a las células. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
9. Añadir 400μL de PBS para aumentar el volumen de citometría de flujo. Lugar de las células en hielo y mantener en la oscuridad.
10. Proceda como se describe en obtener datos para las células fijas. Añadir FITC a los parámetros e incluyen un histograma para FITC en la hoja.

Análisis y Resultados Representante

1. Analizar los datos utilizando FlowJo (Treestar). Puerta de las células en vivo basado en el perfil de dispersión frontal y lateral (Figura 1a). Determinar la media de fluorescencia para Indo-azul de la puerta de células viables (Figura 1b).
2. a) Para la población de células mixtas
   • el uso de fluorescencia FITC en las parcelas de histogramas y un punto para identificar la población 32Dkit
   • Determinar la media de fluorescencia para Indo-Blue de la población 32Dkit
3. Utilice Microsoft Excel para representar gráficamente la media de fluorescencia (Figura 2a). Calcular la pendiente de la línea entre el 5 y 10 minutos. Gráfico de la pendiente en forma de gráfico de barras para determinar la actividad de la calpaína en las células (Figura 2b).

Figura 1a. Determinación de células en vivo basado en el perfil de dispersión frontal y lateral.

Figura 1b. El cambio promedio de fluorescencia más de 10 minutos de tiempo por supuesto.

Figura 2a. Representante gráfico de la media de fluorescencia.

Figura 2b. Calpaína actividad en las células con inhibidores de la 32Dkit.

Discussion

La actividad de la calpaína en células 32Dkit fijos y la vida se ha determinado en este protocolo de vídeo. El tratamiento de la línea de células con el inhibidor de la calpaína PD150606 dio lugar a una inhibición completa de la actividad de la calpaína en las células. Además, el tratamiento con el inhibidor de MEK1 PD98059 dado lugar a una inhibición completa de la actividad de la calpaína en las células. ERK es un importante activador de la calpaína-2 ^3. Estos resultados sugieren que la calpaína-2 la actividad es predominante en las células 32Dkit. El trabajo actual en nuestro laboratorio está investigando las consecuencias de la actividad de la calpaína aumento y los aportes de la calpaína-1 y 2-calpaína en la leucemia.

Este protocolo detalles de la citometría de flujo de primera ensayo basado en medir los niveles de calpaína actividad en las células fijas y de vida y se puede utilizar para comprender el mecanismo de regulación de la calpaína y su papel en procesos patológicos utilizando células intactas.

Este protocolo puede ser modificado para examinar los efectos de los inhibidores de la manipulación genética o la actividad de la calpaína. Además, este ensayo puede ser utilizado para medir la actividad de la calpaína en una mezcla compleja de células, tales como sangre del cordón umbilical o para identificar y medir la actividad de la calpaína en subconjuntos de células aisladas del bazo.

Este ensayo no distingue entre la actividad generada por las diferentes isoformas de calpaína. Reactivos genética o farmacológica que derribar o inhibir calpaínas específicos pueden ser utilizados para tratar esta cuestión.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde	Invitrogen		Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C
PD150606	Invitrogen		Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.
PD98059	Cell Signaling Technology
AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth.