फिक्स्ड और जीवित कोशिकाओं में प्रवाह cytometry द्वारा Calpain गतिविधि को मापने

Summary

यह आलेख तय की और जीवित कोशिकाओं में प्रवाह cytometry का उपयोग calpain गतिविधि को मापने के लिए प्रोटोकॉल विस्तार होगा.

Abstract

Calpains सर्वव्यापी intracellular कैल्शियम के प्रति संवेदनशील, तटस्थ सिस्टीन proteases

Protocol

अभिकर्मकों की तैयारी

नोट: पीबीएस सभी ^{2 +} Ca और ² मिलीग्राम शामिल ^हैं +

1. जांच अभिकर्मक
   कमरे के तापमान पीबीएस 7-एमिनो 4-chloromethyl 20μM coumarin, टी बीओसी Leucine - methionine एमाइड (बीओसी LM-CMAC) जोड़ें. प्रत्येक कक्ष निलंबन 2ml पता लगाने अभिकर्मक की आवश्यकता होगी.
2. 1% Paraformaldehyde (फिक्स्ड कक्ष)
   कमरे के तापमान पीबीएस में 4% paraformaldehyde शेयर समाधान पतला. विभाज्य 1ml 1% प्रत्येक FACS ट्यूब paraformaldehyde. तीन FACS ट्यूब प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए आवश्यक हैं (उदा. 32Dkit + PD150606 32Dkit, 32Dkit PD98059 + 9 FACS ट्यूबों की जरूरत है)
3. PD150606 (calpain अवरोध करनेवाला)
   DMSO में PD150606 100mm के एक अंतिम एकाग्रता के लिए reconstitute. इस अभिकर्मक और सभी प्रकाश से इसके साथ इस प्रयोग की अवधि के लिए इलाज किया कोशिकाओं को सुरक्षित रखें.
4. PD98059 (MEK1 अवरोध करनेवाला)
   DMSO में PD98059 50mm के एक अंतिम एकाग्रता के लिए reconstitute.

कक्ष तैयार

1. 5 में 32Dkit कोशिकाओं को विकसित x 10 ⁵ से 1 x 10 Opti-सदस्य मीडिया में ⁶ एमएल प्रति कोशिकाओं 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, आईएल-3 की एक स्रोत (या आईएल-3 इस तरह के लिए किसी अन्य स्रोत के रूप में सतह पर तैरनेवाला WEHI-3 के साथ पूरक पुनः संयोजक प्रोटीन के रूप में), 0.1% 2-mercaptoethanol और एंटीबायोटिक दवाओं.
2. तीन 15ml फाल्कन ट्यूबों (4 x 10 ट्यूब प्रति ⁶ कोशिकाओं) में x 12 10 ⁶ 32Dkit कोशिकाओं लीजिए.
3. गोली 5 मिनट के लिए 1000 आरपीएम पर 15 ° कोशिकाओं सी.
4. सतह पर तैरनेवाला Aspirate. 2ml कमरे के तापमान पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend.
5. PD150606 50μM के साथ एक सेल निलंबन समझो. सुनिश्चित करें कि नमूना प्रकाश से फाल्कन ट्यूब एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर के द्वारा संरक्षित है. भंवर संक्षिप्त तब अंधेरे में कमरे के तापमान पर बीस से तीस मिनट के लिए सेते हैं.
6. 20μM PD98059 के साथ दूसरे सेल निलंबन समझो. प्लेट 37 में एक 35 मिमी टिशू कल्चर और 2 घंटे के लिए पकवान सेते में कोशिकाओं ° सी.

निश्चित कक्ष में Calpain परख

1. जबकि नमूने PD150606 साथ incubating हैं, अनुपचारित नमूने पर calpain परख शुरू करते हैं. प्रत्येक कक्ष निलंबन 2ml पता लगाने अभिकर्मक जोड़ने के द्वारा शुरू करो. तुरंत 1% paraformaldehyde (0 मिनट समय बिंदु) के साथ पहले से तैयार FACS ट्यूबों सेल / निलंबन का पता लगाने अभिकर्मक मिश्रण के 1ml जोड़ने.
2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पता लगाने अभिकर्मक के साथ सेल निलंबन सेते हैं. फिर 1ml 1% paraformaldehyde के साथ एक FACS ट्यूब के लिए सेल निलंबन के 1ml जोड़ने.
3. कमरे के तापमान पर एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए पता लगाने के मिश्रण के साथ सेल निलंबन incubating जारी रखें. फिर 1ml 1% paraformaldehyde के साथ एक FACS ट्यूब के लिए सेल निलंबन के 1ml जोड़ने.
4. 32Dkit कोशिकाओं है कि inhibitors के साथ इलाज किया गया है पर calpain परख दोहराएँ.
5. 4 में रात भर अंधेरे में कोशिकाओं को ठीक डिग्री सेल्सियस
6. अगले दिन 15 पर 5 मिनट के लिए 1800 RPM में कोशिकाओं गोली ° सी.
7. सतह पर तैरनेवाला Aspirate. 750uL पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend. बर्फ पर कोशिकाओं प्लेस और अंधेरे में रहते हैं.

फिक्स्ड कक्ष के लिए डेटा मोल

1. एक LSR II (बायोसाइंस बी) का उपयोग कोशिकाओं का विश्लेषण. फ़िल्टर अंकों Xcyte (यूवी) लेजर, उत्तेजना लाइन 355nm और लेजर बिजली 25mW, सब्सट्रेट और उत्पाद के लिए क्रमशः 405 और 450 एनएम के उत्सर्जन के लिए सेट कर रहे हैं. सब्सट्रेट और उत्पाद के लिए बैंड पास फिल्टर 405/20 और 450/50 हैं. सब्सट्रेट और उत्पाद के लिए लंबे समय से गुजारें फिल्टर 405 और 450 हैं. PMT वोल्टेज सब्सट्रेट के लिए 350-375 और 325-350 पर उत्पाद के लिए स्थापित किया गया था.
2. ओर तितर बितर; भारत - 1 ब्लू (लॉग), भारत - 1 वायलेट (लॉग) आगे तितर बितर: निम्नलिखित मानकों के साथ एक बी.डी. FACSDiva प्रयोग अप सेट. आगे तितर बितर पक्ष बनाम जीवित कोशिकाओं पर एक गेट (चित्रा 1 क), भारत - 1 ब्लू हिस्टोग्राम, भारत, भारत - 1 वायलेट हिस्टोग्राम-1 ब्लू बनाम भारत-1 वायलेट के साथ स्कैटर डॉट साजिश: कार्यपत्रक में निम्नलिखित रेखांकन सेट डॉट साजिश.
3. जांचना AlignFlow और AlignFlow साथ LSR द्वितीय प्लस फ्लोरोसेंट मोती (Invitrogen). PMT वोल्टेज मनका प्रतिदीप्ति हिस्टोग्राम के शिखर हर प्रयोग से पहले एक ही चैनल में जगह के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.
4. 0 मिनट समय बिंदु पर 32Dkit कोशिकाओं का उपयोग कर डेटा प्राप्त करने शुरू करो. आवश्यक के रूप में पैरामीटर voltages को समायोजित करें. अधिग्रहण और नमूना प्रति 10,000 घटनाओं रिकॉर्ड.
5. प्रत्येक नमूना के लिए अधिग्रहण दोहराएँ, प्रत्येक ट्यूब के बीच FACS बफर मशीन के साथ rinsing.
6. डेटा निर्यात. सुनिश्चित LSR द्वितीय संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार साफ किया जाता है.

लाइव कक्ष में Calpain परख

1. सेल निलंबन के रूप में ऊपर PD150606 कोई के साथ तैयार है. एलएसआर द्वितीय के लिए नमूने ले आओ और फिल्टर और इसके बाद के संस्करण के रूप में मानकों सेट. इसके बाद के संस्करण के रूप में कार्यपत्रक सेट करें. एक बड़े डॉट भारत - 1 ब्लू बनाम समय दिखा साजिश शामिल करें. कार्यक्रम के लिए अधिकतम संख्या प्राप्त सेटघटनाओं की बेर (कोई रोक गेट).
2. 50μM PD150606 एक 32Dkit कोशिकाओं के सेल निलंबन जोड़ें. अंधेरे में नमूना रखें और कमरे के तापमान पर 20-30 मिनट के लिए सेते हैं.
3. कोई PD150606 के साथ 32Dkit सेल निलंबन पर डेटा प्राप्त शुरू करो. प्रति सेकंड 200-300 घटनाओं की एक कम प्रवाह की दर का उपयोग करें. 30 सेकंड 1 मिनट के बाद मशीन से ट्यूब को हटा दें. कोशिकाओं को बीओसी LM-CMAC 20μM जोड़ें. भंवर संक्षिप्त तब डेटा प्राप्त जारी रखने के.
4. 10-20 मिनट के लिए या calpain गतिविधि पठारों जब तक डेटा का मोल.
5. 32Dkit PD150606 के साथ इलाज किया कोशिकाओं के साथ चरण 3 और 4 दोहराएँ.
6. डेटा निर्यात. सुनिश्चित LSR द्वितीय संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार साफ किया जाता है.

परिसर (मिश्रित) सेल आबादी में Calpain परख

* यह प्रयोग एक सेल एक माउस तिल्ली से काटा निलंबन में 32Dkit कोशिकाओं की पहचान करेगा.

1. प्रत्येक माउस से तिल्ली हार्वेस्ट. राष्ट्रीय राजमार्ग 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ₄ सीएल के साथ लाल रक्त कोशिका lyse .
2. 2ml पीबीएस में एकल कक्ष निलंबन तैयार करें.
3. प्रत्येक कक्ष में दो निलंबन फूट डालो. PD150606 50μM के साथ अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20-30 मिनट के लिए एक सेल निलंबन समझो.
4. फिक्स्ड कक्ष में Calpain परख (06/01 चरण) के लिए के रूप में ऊपर से आगे बढ़ें
5. सतह पर तैरनेवाला Aspirate. 500μL पीबीएस में कोशिकाओं को धो लें. सतह पर तैरनेवाला Aspirate.
6. 200μL धुंधला बफर में 2% BSA के साथ कोशिकाओं Resuspend. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
7. प्राथमिक एंटीबॉडी (FITC CD117 विरोधी माउस) तैयार करें. एंटीबॉडी बफर धुंधला में 1:200 कमजोर पड़ने पर इस्तेमाल किया जाना चाहिए. एंटीबॉडी अंधेरे में रखा जाता है सुनिश्चित करें.
8. कोशिकाओं को 200μL प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
9. 400μL पीबीएस जोड़ें प्रवाह cytometry के लिए मात्रा में वृद्धि. बर्फ पर कोशिकाओं प्लेस और अंधेरे में रहते हैं.
10. आगे बढ़ो के रूप में फिक्स्ड कक्ष के लिए डेटा मोल में वर्णित है. मापदंडों को FITC जोड़ें और कार्यपत्रक पर FITC के लिए एक हिस्टोग्राम शामिल है.

विश्लेषण और प्रतिनिधि परिणाम

1. FlowJo (Treestar) का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण. जीना आगे और पक्ष स्कैटर प्रोफ़ाइल (चित्रा 1a) के आधार पर कोशिकाओं पर गेट. भारत - ब्लू के लिए व्यवहार्य सेल फाटक (चित्रा 1b) से मतलब प्रतिदीप्ति का निर्धारण करते हैं.
2. मिश्रित सेल जनसंख्या के लिए एक)
   • उपयोग histograms और डॉट भूखंडों पर FITC प्रतिदीप्ति 32Dkit आबादी की पहचान
   • 32Dkit आबादी के लिए भारत - ब्लू मतलब प्रतिदीप्ति निर्धारित
3. मतलब प्रतिदीप्ति (2a चित्रा) ग्राफ के लिए Microsoft Excel का उपयोग करें. 5 और 10 मिनट के बीच की रेखा की ढलान की गणना. ग्राफ़ ढलान एक बार ग्राफ के रूप में कक्षों में calpain गतिविधि का निर्धारण (चित्रा 2b).

चित्रा 1a आगे और पक्ष स्कैटर प्रोफ़ाइल पर आधारित रहते कोशिकाओं का निर्धारण .

चित्रा 1b 10 मिनट के समय के पाठ्यक्रम पर प्रतिदीप्ति परिवर्तन मतलब .

चित्रा 2a मतलब प्रतिदीप्ति के प्रतिनिधि. ग्राफ.

चित्रा 2b inhibitors के साथ 32Dkit कोशिकाओं में. Calpain गतिविधि.

Discussion

इस वीडियो प्रोटोकॉल में तय की और रहने वाले 32Dkit कोशिकाओं में calpain गतिविधि निर्धारित किया गया है. Calpain PD150606 अवरोध करनेवाला के साथ सेल लाइन का उपचार कोशिकाओं में calpain गतिविधि के पूर्ण निषेध के परिणामस्वरूप. इसके अलावा, MEK1 PD98059 अवरोध करनेवाला के साथ इलाज कोशिकाओं में calpain गतिविधि के पूर्ण निषेध के परिणामस्वरूप. ERK ³ calpain-2 के एक प्रमुख उत्प्रेरक है. इन परिणामों का सुझाव है कि calpain-2 32Dkit कोशिकाओं में प्रमुख गतिविधि है. हमारी प्रयोगशाला में वर्तमान काम बढ़ calpain गतिविधि और calpain-1 और लेकिमिया में calpain-2 के योगदान के परिणामों की जांच कर रही है.

इस प्रोटोकॉल पहली प्रवाह cytometric आधारित परख करने के लिए तय की और जीवित कोशिकाओं में calpain गतिविधि के स्तर को मापने के विवरण और calpain विनियमन और रोग प्रक्रियाओं का उपयोग कोशिकाओं बरकरार में अपनी भूमिका के तंत्र को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल calpain गतिविधि पर या inhibitors जीन जोड़तोड़ के प्रभाव की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. इसके अलावा, इस परख गर्भनाल रक्त या पहचान और तिल्ली से अलग सेल सबसेट में calpain गतिविधि को मापने के रूप में कोशिकाओं की एक जटिल मिश्रण में calpain गतिविधि को मापने के लिए उपयोग किया जा सकता है.

इस परख calpain के विभिन्न isoforms द्वारा उत्पन्न गतिविधि के बीच भेद नहीं करता. जेनेटिक या औषधीय अभिकर्मकों कि नीचे दस्तक या विशिष्ट calpains बाधित इस मुद्दे के समाधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde	Invitrogen		Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C
PD150606	Invitrogen		Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.
PD98059	Cell Signaling Technology
AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth.