유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

Summary

이 문서 유동세포계측법를 사용하여 고정하고 살아있는 세포에서 calpain 활동을 측정하기위한 세부 프로토콜을 것입니다.

Abstract

Calpains는 유비 쿼터스 세포, 칼슘 구분, 중립 시스테인 프로 테아제 아르

Protocol

시약 준비

참고 : 모든 PBS는 칼슘 ^{2 +와} MG ^2가 포함되어 ⁺

1. 탐지 시약
   방 온도를 PBS로 20μM 7 - 아미노 - 4 - chloromethyl coumarin, T - BOC - 류신 - 메티오닌 아미드를 (BOC - LM - CMAC) 추가합니다. 각각의 세포 현탁액은 2mL 탐지 시약을 필요로합니다.
2. 1 % Paraformaldehyde (고정 세포)
   방 온도를 PBS에 4 % paraformaldehyde 주식 솔루션을 희석. 각 외과 튜브로 나누어지는 1mL 1 % paraformaldehyde. 쓰리 외과 튜브 각 실험 조건이 필요합니다 (예 : 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit가 + PD98059 9 외과 튜브가 필요)
3. PD150606 (calpain 억제제)
   100mM의 최종 농도로 DMSO에 PD150606 Reconstitute. 이 시약이 실험 기간 동안 빛으로부터 그것으로 취급 모든 세포를 보호할 수 있습니다.
4. PD98059 (MEK1 억제제)
   50mM의 최종 농도로 DMSO에 Reconstitute PD98059.

셀 준비

1. X 10 Opti - 멤 미디어 ML 당 ^5-1 X 10 ⁶ 세포 5 % 태아 소 혈청, IL - 3의 소스 (또는 IL - 3 등에 대한 다른 소스로 WEHI - 3 뜨는와 보충 5 32Dkit 세포를 성장 재조합 단백질 등), 0.1 % 2 - 메르 캅 토 에탄올 항생제.
2. 세 15mL 팰컨 튜브 (튜브 당 4 X 10 ⁶ 세포)로 12 X 10 ⁶ 32Dkit 세포를 수집합니다.
3. 15 5 분 1,000 RPM에서 펠렛은 세포 ° C.
4. 뜨는을 대기음. 2mL 방 온도 PBS에 세포를 Resuspend.
5. 50μM PD150606 하나의 세포 현탁액을 처리합니다. 샘플이 팰컨 튜브 알루미늄 호일로를 덮고하여 빛으로부터 보호됩니다 확인하십시오. 소용돌이는 간단히 다음 어둠 속에서 실온에서 20~30분위한 부화.
6. 20μM PD98059 두 번째 세포 현탁액을 처리합니다. 플레이트 37에서 2 시간 동안 35mm 조직 문화 요리와 부화에있는 세포가 ° C.

고정 전지 Calpain 분석

1. 샘플 PD150606과 잠복기 있지만, 치료 샘플에 calpain 분석을 시작합니다. 각각의 세포 현탁액에 2mL 검출 시약을 추가하여 시작합니다. 즉시 1 % paraformaldehyde (0 분 시점)로 이전 준비 외과 튜브에 세포 현탁액 / 탐지 시약 혼합물의 1mL를 추가합니다.
2. 상온에서 5 분 탐지 시약과 셀 suspensions을 품어. 다음 1mL 1 % paraformaldehyde와 외과 튜브에 세포 현탁액의 1mL를 추가합니다.
3. 실온에서 추가로 5 분 검출 혼합물로 세포 suspensions을 잠복기 계속합니다. 다음 1mL 1 % paraformaldehyde와 외과 튜브에 세포 현탁액의 1mL를 추가합니다.
4. 억제제로 치료했습니다 32Dkit 세포에 calpain 분석을 반복합니다.
5. 4 어둠 속에서 야간 세포를 수정 ° C.
6. 다음날 펠릿 15 5 분 1,800 RPM에서 세포 ° C.
7. 뜨는을 대기음. 750uL PBS에 세포를 Resuspend. 얼음 세포를 놓고 어둠 속에 보관.

고정 셀에 대한 데이터를 수집

1. LSR II (BD Bioscience)를 사용하여 세포를 분석할 수 있습니다. 필터는 Lightwave Xcyte (UV) 레이저, 여기 라인 355nm 레이저 전력 25mW, 각각 기판 및 제품에 대한 405 및 450 nm의의 방출에 대해 설정됩니다. 기판 및 제품에 대한 밴드 패스 필터 20분의 405과 50분의 450입니다. 기판 및 제품에 대한 긴 패스 필터는 405 450입니다. PMT 전압은 제품의 기판에 대한 350-375과 325-350에 설정되었습니다.
2. ; 사이드 분산, 인도 - 1 블루 (로그), 인도 - 1 바이올렛 (로그) 앞으로 흩어 다음 매개 변수 BD FACSDiva 실험 - 설정합니다. 앞으로 흩어 대 라이브 세포 게이트 (그림 1A), 인도 - 1 블루 히스토그램, 인도 - 1 바이올렛 히스토그램, 인도 - 1 블루 대 인도 - 1 바이올렛과 ​​사이드 분산형 점 줄거리 : 워크시트에 다음과 같은 그래프를 설정 도트 플롯.
3. LSR AlignFlow과 AlignFlow와 II 플러스 형광 구슬 (Invitrogen)를 보정합니다. PMT 전압 전에 모든 실험에 동일한 채널에서 비드 형광 히스토그램의 절정을 배치 조정해야합니다.
4. 0 분 시점에서 32Dkit 세포를 사용하여 데이터를 수집 시작합니다. 필요에 따라 매개 변수 전압을 조정합니다. 수집 및 샘플 10,000 이벤트를 기록합니다.
5. 각 튜브 사이 외과 버퍼와 함께 시스템을 rinsing, 각 샘플에 대한 인수를 반복합니다.
6. 데이터를 내보낼 수 있습니다. 확인 LSR II는 기관의 지침에 따라 청소합니다.

라이브 세포 Calpain 분석

1. 노 PD150606와 위의 세포 suspensions를 준비합니다. LSR II에 샘플을 가지고 이상과 같은 필터와 파라미터를 설정합니다. 위와 같이 워크시트를 설정합니다. 인도 - 1 블루 대 시간을 보여주는 대형 도트 플롯을 포함합니다. 최대 NUM를 얻기위한 프로그램을 설정이벤트 BER (NO 중지 게이트).
2. 32Dkit 세포의 50μM PD150606 하나의 세포 현탁액을 추가합니다. 어둠의 샘플 보관 20-30 명의 분 실온에서 품어.
3. 노 PD150606과 32Dkit 세포 현탁액에 대한 데이터를 수집 시작합니다. 초당 200-300 이벤트의 낮은 유속을 사용합니다. 30 초 일분 후 시스템에서 튜브를 제거합니다. 세포에 20μM BOC - LM - CMAC을 추가합니다. 소용돌이는 간단히 다음 데이터를 획득 계속합니다.
4. 10~20분 또는 calpain 활동 고원까지 데이터를 수집.
5. PD150606 취급 32Dkit 세포와 3 단계와 4 단계를 반복합니다.
6. 데이터를 내보낼 수 있습니다. 확인 LSR II는 기관의 지침에 따라 청소합니다.

콤플렉스 (혼합) 셀 인구의 Calpain 분석

*이 실험은 마우스 비장에서 수확 세포 현탁액에 32Dkit 세포를 식별합니다.

1. 각 마우스의 비장을 수확. 실온에서 10 분 NH ₄ Club 호텔과 적혈구 세포를 Lyse.
2. 2mL PBS의 단세포 suspensions를 준비합니다.
3. 두 각각의 세포 현탁액을 나눕니다. 어둠 속에서 실온에서 20-30분에 대한 50μM PD150606 1 세포 현탁액을 처리합니다.
4. 고정 셀에 Calpain 어세이 (1-6 단계)에 대한 위에서 진행
5. 뜨는을 대기음. 500μL PBS에 세포를 씻으십시오. 뜨는을 대기음.
6. 2 % BSA와 200μL 얼룩 버퍼에있는 세포를 Resuspend. 실온에서 15 분 동안 품어.
7. 기본 항체 (FITC 안티 마우스 CD117)를 준비합니다. 항체는 버퍼를 얼룩의 1:200 희석에 사용해야합니다. 항체가 어둠에 갇혀있다 확인하십시오.
8. 세포에 200μL 기본 항체를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 30 분 알을 품다.
9. 유동세포계측법의 볼륨을 증가 400μL PBS를 추가합니다. 얼음에 세포를 놓고 어둠 속에 보관.
10. 고정 셀에 대한 데이터를 취득에서 설명한대로 진행합니다. 매개 변수 FITC 추가하고 워크시트에서 FITC에 대한 히스토그램을 포함합니다.

분석 및 대표 결과

1. FlowJo (Treestar)를 사용하여 데이터를 분석할 수 있습니다. 순방향 및 측면 산란 프로파일 (그림 1A)에 따라 사는 세포 게이트. 가능한 세포 게이트 (그림 1B)에서 인도 블루에 대한 의미 형광을 확인합니다.
2. 혼합 셀 인구)
   • 32Dkit 인구를 식별 histograms 및 도트 플롯에 FITC 형광을 사용하여
   • 32Dkit 인구의 인도 블루에 대한 의미 형광을 결정
3. 그래프 평균 형광 (그림 2A)을 위해 Microsoft Excel을 사용하십시오. 5 10 분 사이의 라인의 기울기를 계산. 그래프 기울기 (그림 2B) 셀에 calpain 활동을 결정하기 위해 막대 그래프로.

그림 1A. 순방향 및 측면 산란 프로파일을 기반으로 살 세포를 결정.

그림 1B는. 10 분 시간 코스 이상의 형광 변화를 의미합니다.

의미 형광의 그림 2A가. 대표 그래프.

억제제와 32Dkit 세포 그림 2B. Calpain 활동.

Discussion

고정 생활 32Dkit 세포의 calpain 활동이 비디오 프로토콜에서 결정되었습니다. calpain 억제제 PD150606과 세포 라인의 치료는 세포의 calpain 활동의 완전한 억제 결과. 또한, MEK1 억제제 PD98059 치료는 세포의 calpain 활동의 완전한 억제 결과. ERK는 calpain - 2 ^3의 주요 활성입니다. 이러한 결과는 calpain - 2 활동이 32Dkit 세포의 지배는 것이 좋습니다. 우리 연구실에서 현재 작업 증가 calpain 활동의 결과와 백혈병에 calpain - 1 calpain - 2의 기여를 조사하고있다.

이 프로토콜 세부 고정 및 살아있는 세포에서 calpain 활동 수준을 측정하는 최초의 흐름 cytometric 분석을 기반으로하며 calpain 규정하고 그대로 세포를 사용하여 병적인 과정에서 그 역할의 메커니즘을 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 calpain 활동에 억제제 또는 유전자 조작의 영향을 조사하기 위해 수정할 수 있습니다. 또한이 분석은 이러한 코드 혈액 또는 비장에서 분리된 셀 집합에서 calpain 활동을 식별하고 측정과 같은 세포의 복잡한 혼합물에서 calpain 활동을 측정하기 위하여 이용하실 수 있습니다.

이 분석은 calpain 다른 isoforms에 의해 생성된 활동 구분하지 않습니다. 특정 calpains을 노크하거나 억제 유전이나 약리 시약이 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde	Invitrogen		Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C
PD150606	Invitrogen		Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.
PD98059	Cell Signaling Technology
AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth.