Mätning Calpain aktivitet inom fast och levande celler med flödescytometri

Summary

Denna artikel kommer detaljerat protokoll för mätning calpain aktivitet i fasta och levande celler med hjälp av flödescytometri.

Abstract

Calpains finns överallt intracellulära, kalcium-känsliga, neutral cysteinproteaser

Protocol

Förbered Reagenser

Notera: Alla PBS innehåller Ca ^{2 +} och Mg ^{2 +}

1. Upptäckt Reagens
   Lägg till 20 mikroM 7-amino-4-klormetyl kumarin, t-BOC-Leucin-metionin amid (BOC-LM-CMAC) till rumstemperatur PBS. Varje cellsuspension kräver 2ml upptäckt reagens.
2. 1% Paraformaldehyd (fasta celler)
   Späd 4% lösning paraformaldehyd lager i rumstemperatur PBS. Fördela 1 mL 1% paraformaldehyd till varje FACS rör. Tre FACS rör krävs för varje experimentell tillstånd (ex. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 behöver 9 FACS rör)
3. PD150606 (calpain hämmare)
   Bered PD150606 i DMSO till en slutlig koncentration av 100 mm. Skydda denna reagens och alla celler som behandlats med det från ljus under den tid detta experiment.
4. PD98059 (MEK1 hämmare)
   Bered PD98059 i DMSO till en slutlig koncentration av 50 mM.

Förbered Celler

1. Väx 32Dkit celler vid 5 x 10 ⁵ till 1 x 10 ⁶ celler per ml i Opti-MEM media kompletteras med 5% fetalt bovint serum WEHI-3 supernatanten som en källa av IL-3 (eller någon annan källa för IL-3 så som rekombinant protein), 0,1% 2-merkaptoetanol och antibiotika.
2. Samla 12 x 10 ⁶ 32Dkit celler i tre 15ml Falcon rör (4 x 10 ⁶ celler per rör).
3. Pellets cellerna vid 1000 rpm i 5 minuter vid 15 ° C.
4. Aspirera supernatanten. Resuspendera cellerna i 2ml rumstemperatur PBS.
5. Behandla en cellsuspension med 50μM PD150606. Se till att provet skyddas från ljus genom att täcka Falcon röret med aluminiumfolie. Vortex kort därefter inkubera i tjugo till trettio minuter vid rumstemperatur i mörker.
6. Behandla andra cellsuspension med 20 mikroM PD98059. Plate cellerna i en 35mm vävnadsodling skålen och inkubera i 2 timmar vid 37 ° C.

Calpain analys i fasta celler

1. Medan proverna inkubering med PD150606, börja calpain analysen på obehandlade prover. Börja med att tillsätta 2 ml upptäckt reagens till varje cellsuspension. Omedelbart Tillsätt 1 mL av cellsuspensionen / upptäckt blandningen till den tidigare beredda FACS rör med 1% paraformaldehyd (0 minuter senare punkten).
2. Inkubera cellsuspensioner med detektion reagens i 5 minuter i rumstemperatur. Tillsätt sedan 1 mL av cellsuspensionen till en FACS rör med 1 mL 1% paraformaldehyd.
3. Fortsätt inkubering av cellsuspensioner med detektion blandningen i ytterligare 5 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt sedan 1 mL av cellsuspensionen till en FACS rör med 1 mL 1% paraformaldehyd.
4. Upprepa calpain analys på 32Dkit celler som har behandlats med hämmare.
5. Fix celler natten i mörker vid 4 ° C.
6. Nästa dag pellets cellerna vid 1800 rpm under 5 minuter vid 15 ° C.
7. Aspirera supernatanten. Resuspendera cellerna i 750uL PBS. Placera celler på is och hålla i mörkret.

Förvärva Data för fasta celler

1. Analysera cellerna med hjälp av en LSR II (BD Bioscience). Filter är fastställts för Lightwave Xcyte (UV) laser, excitation linje 355nm och laser makt 25mW, utsläpp av 405 och 450 nm för substrat och produkt respektive. Bandpass filter för substrat och produkt är 405/20 och 450/50. Långa pass filter för substrat och produkt är 405 och 450. Den PMT spänningen sattes på 350-375 för substrat och 325-350 för produkten.
2. Set-up en BD FACSDiva experimentera med följande parametrar: Forward Scatter; Side Scatter, indo-1 Blå (logg), indo-1 Violet (log). I kalkylbladet konfigurera följande diagram: Forward Scatter vs Side Scatter dot plot med en grind på levande celler (Figur 1a), indo-1 Blå histogram, indo-1 Violet histogram, indo-1 Blå vs indo-1 Violet dot plot.
3. Kalibrera LSR II med AlignFlow och AlignFlow plus fluorescerande pärlor (Invitrogen). Den PMT Spänningen bör justeras för att placera toppen av pärla fluorescens histogram i samma kanal inför varje experiment.
4. Börja skaffa data med 32Dkit celler vid 0 minuter tidpunkt. Ställ parameter spänningar som behövs. Samla in och registrera 10.000 evenemang per prov.
5. Upprepa förvärv för varje prov, skölja maskinen med FACS buffert mellan varje rör.
6. Exportera data. Se till att LSR II rengöras enligt institutets riktlinjer.

Calpain analys i levande celler

1. Förbered cellsuspensioner som ovan, utan PD150606. Ta proverna till LSR II och ställa in filter och parametrar som ovan. Ställ in i kalkylbladet enligt ovan. Inkluderar en stor prick plot visar indo-1 Blå vs tid. Ställ in programmet att förvärva maximalt NUMBER av händelser (inget stopp gate).
2. Lägg 50μM PD150606 till en cellsuspension av 32Dkit celler. Förvara provet i mörker och inkubera vid rumstemperatur i 20-30 minuter.
3. Börja skaffa data om 32Dkit cellsuspension utan PD150606. Använd ett lågt flöde på 200-300 händelser per sekund. Efter 30 sekunder till 1 minut bort slangen från maskinen. Lägg till 20 mikroM BOC-LM-CMAC till cellerna. Vortex kort sedan fortsätta förvärva data.
4. Förvärva uppgifter i 10-20 minuter eller tills calpain aktiviteten platåer.
5. Upprepa steg 3 och 4 med 32Dkit celler som behandlats med PD150606.
6. Exportera data. Se till att LSR II rengöras enligt institutets riktlinjer.

Calpain analys i komplexa (blandat) cellpopulationer

* Detta experiment kommer att identifiera 32Dkit celler i en cellsuspension skördas från en mus mjälte.

1. Harvest mjälten från varje mus. Lysera de röda blodkroppar med NH ₄ Cl i 10 minuter vid rumstemperatur.
2. Förbered enda cellsuspensioner i 2 ml PBS.
3. Dela varje cell suspension i två. Behandla en cellsuspension med 50μM PD150606 i 20-30 minuter vid rumstemperatur i mörker.
4. Fortsätt enligt ovan för Calpain-analys i fasta celler (steg 1-6)
5. Aspirera supernatanten. Tvätta cellerna i 500μL PBS. Aspirera supernatanten.
6. Resuspendera cellerna i 200μL färgning buffert med 2% BSA. Inkubera i 15 minuter i rumstemperatur.
7. Förbered den primära antikroppen (FITC anti-mus-CD117). Antikroppen bör användas vid en 1:200 utspädning i färgning buffert. Se till att antikroppen hålls i mörker.
8. Lägg 200μL primära antikroppen till cellerna. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur i mörker.
9. Lägg 400μL PBS för att höja volymen för flödescytometri. Placera cellerna på is och hålla i mörkret.
10. Fortsätt enligt beskrivningen i Skaffa Data för fasta celler. Lägg FITC de parametrar och inkluderar ett histogram för FITC i kalkylbladet.

Analys och resultat representant

1. Analysera data med hjälp av FlowJo (Treestar). Gate på levande celler baserat på framåt och sidospridning profil (figur 1a). Bestäm medelvärdet fluorescens för indo-Blue från den livskraftiga celler porten (Figur 1b).
2. a) För den blandade cellpopulation
   • Använd FITC fluorescens på histogram och prick tomter för att identifiera 32Dkit befolkningen
   • Bestäm medelvärdet fluorescens för indo-blå 32Dkit befolkningen
3. Använd Microsoft Excel för att rita medelvärdet fluorescens (figur 2a). Beräkna lutningen på linjen mellan 5 och 10 minuter. Diagram lutningen som ett stapeldiagram för att avgöra calpain aktiviteten i cellerna (figur 2b).

Figur 1a. Bestämma levande celler baserade på framåt och Side Scatter profil.

Figur 1b. Mean fluorescens förändras över 10 minuters tid förstås.

Figur 2a. Representant graf av betyder fluorescens.

Figur 2b. Calpain aktivitet i 32Dkit celler med hämmare.

Discussion

Den calpain aktiviteten i fasta och levande 32Dkit celler har fastställts i denna video protokoll. Behandling av cellen linje med calpain hämmare PD150606 resulterade i fullständig hämning av calpain aktiviteten i cellerna. Dessutom resulterade behandling med MEK1 hämmaren PD98059 i fullständig hämning av calpain aktiviteten i cellerna. ERK är en viktig aktivator av calpain-2 ^3. Dessa resultat tyder på att calpain-2 aktivitet är dominerande i 32Dkit cellerna. Pågående arbete i vårt laboratorium undersöker konsekvenserna av en ökad calpain aktivitet och bidrag calpain-1 och calpain-2 i leukemi.

Detta protokoll detaljer första flödescytometrisk baserad analys för att mäta calpain aktivitet inom fast och levande celler och kan användas för att förstå mekanismen för calpain reglering och dess roll i patologiska processer med intakta celler.

Detta protokoll kan ändras för att undersöka effekterna av inhibitorer eller manipulationer genen på calpain aktivitet. Dessutom kan denna analys utnyttjas för att mäta calpain aktivitet i en komplex blandning av celler, såsom blod från navelsträngen eller att identifiera och mäta calpain aktivitet i cellen delmängder isolerade från mjälten.

Denna analysmetod skiljer inte mellan aktivitet som olika isoformer av calpain. Genetisk eller farmakologisk reagenser som riva eller hämmar specifika calpains kan användas för att lösa detta problem.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde	Invitrogen		Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C
PD150606	Invitrogen		Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.
PD98059	Cell Signaling Technology
AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth.