Summary
С целью изучения экспрессии генов в ткани куколки крыло Bicyclus anynana, мы представляем оптимизированный протокол на месте гибридизации использованием riboprobes. Мы также предоставляем рекомендации по дальнейшей оптимизации этого протокола для использования в куколки крылья других видов чешуекрылых.
Abstract
Здесь мы представляем, в видео-формат, протокол на месте гибридизации в куколки крылья бабочки Bicyclus anynana использованием riboprobes. В месте гибридизации, основой биологии развития, являются полезными для изучения пространственных и временных паттернов экспрессии генов в развивающихся тканей на уровне транскрипции. Если антитела, направленные белковые продукты транскрипции генов до сих пор не разработаны, и / или Есть несколько копий гена белка в частности генома, которые не могут быть дифференцированы с использованием имеющихся антител, в места нахождения имущества может быть использован вместо. Хотя на месте техника для личинок диски крыла стала доступна для бабочки сообщества в течение нескольких лет, текущий протокол был оптимизирован для более крупных и более хрупкими куколки крылья.
Protocol
ДЕНЬ 1
- Подготовьте следующие решения:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- DDH 2 O
- Добавить DEPC на 0,1% общего объема и встряхните решения энергично.
- Автоклав.
- 4% Параформальдегид Fix - с помощью PBS-DEPC
- Протеиназы К решению - если осадок присутствует, вихревые энергично, прежде чем снимать аликвоту
- Буфер Пищеварение Стоп
- Prehybridization буфера
- 50:50 PBT: Prehybridization буфера
- Гибридизация буфера
- Решения должны быть РНКазы бесплатно. Используйте либо стеклянная посуда, которая была запеченная (4 часа при температуре 250 ° С) или одноразовые пластиковые. Серологические пипетки очень полезны для составления решения
- Рассеките крылья от времени поставил куколки в ФСБ
- Перемещение крыльев непосредственно исправить буфера в скважинах от 24-луночного планшета культуры при комнатной температуре
- Fix диски в течение 2 часов
- Вымойте 5 х 5 минут в PBT
- Инкубируйте крылья в течение 3 минут в растворе протеиназы К
- Промыть 2 х в пищеварении Упорный брус
- Вымойте 5 х 5 минут в PBT
- Вымойте 2 х 5 минут в 50:50 PBT: PHB
- Промыть 1 х 10 минут в PHB
- Инкубируйте в PHB не менее 1 часа при температуре 55 ° C.
- Тепло-денатурации РНК зонд (20-50ng необходимы на лунку) (80 ° С в течение 5 минут) и добавить к гибридизации буфере (100 мкл на лунку необходимо)
- Добавить зонд для скважин и инкубировать 48 часов при температуре 55 ° C
ДЕНЬ 3
- Промыть 4 х 5 минут в 55 ° C PHB
- Инкубируйте ночь в PHB при 55 ° С
ДЕНЬ 4
- Подготовьте следующие решения:
- Буфер антител Блок
- Промыть 1 х 5 минут в 50:50 PBT: PHB
- Промыть 4 х 5 минут в PBT
- Инкубируйте крылья в течение 1 часа Блок буфера при 4 ° С
- Инкубируйте крылья в разведении 1:2000 анти-Dig антител течение ночи при 4 ° C
ДЕНЬ 5
- Подготовка следующие решения:
- Обнаружение буфера
- Разработка решений - светочувствительные (завернуть в фольгу)
- Вымойте 3 х 5 минут в PBT при комнатной температуре
- Вымойте 7 х 5 минут в PBT
- Промыть крыльев в два раза за обнаружения буфера
- Разработка крыла в 1 мл Разработка Solution - время развития необходимо контролировать каждый раз - развитие времена могут измениться даже при использовании этих проб и разработки решения - как правило, проверить через 5-10 минут, а затем увеличить интервалы до ночи. Пластина должна быть обернута в фольгу, чтобы предотвратить воздействие света, когда не проверяет образцы.
- Промыть пять раз в развивающихся Стоп буфера
- Горы крылья.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Оптимизация существующих протоколов
В месте гибридизации на личиночной диски крыла были успешно выполнены, используя диски с Precis бабочек coenia (Carroll и др., 1994;. Ключи и др., 1999;. Уэтерби и др., 1999.). Текущий протокол был адаптирован с подробного письменного протокола по запросу из Кэрролла Лаборатории для личинок окрашивания крыла. Изменения, которые мы сделали служат для учета различий между личинок и куколки ткани крыла. Во время куколки hindwing вскрытия, peripodial мембраны должны быть удалены и не включены в скважинах. Начальный момент времени исправить намного больше в нашем протокол, но после исправления шаг был удален. Мы обнаружили, что 10-кратного разбавления раствора протеиназы К было необходимо для хрупкой куколки ткани крыла то же время позволяя для успешного проникновения зонда. Мы также обнаружили, что блокирование крылья перед окрашиванием антител значительно снижается фон, в то время как увеличение антител инкубации в течение ночи при 4 ° С увеличилась сигнала.
Применения
Применения этого протокола, весьма разнообразны. Возможность локализации выражение генов-кандидатов на развивающихся куколки крыло будет первым шагом в причастности этого гена в некоторых функциональной роли в процессе разработки модель крыла или крыла (Marcus и др. 2004;. Рамос и др. 2006).. Если несколько генов, которые, как известно, взаимодействуют в другие системы совместного выразил вместе на крыльях это может быть связано с кооптации более сложных генных сетей в определении новых моделей крыла (Монтейро и соавт. 2006). Крыло бабочки узор Evo-Devo обеспечивает богатый система, в которой соответствующие Evo-Devo вопросы, связанные с процессами генов и генных сетей кооптации, эволюция новинки, эволюция сходящихся и параллельных черт, эволюция серийные гомологии и генной дублирования и суб-функционализации все это может быть изучено в комплексе. Кроме того, бабочки дисплей огромное разнообразие крыла модели, которые играют важную роль в признании видов, половой отбор, мимика, терморегуляции, и хищник избегания. Понимание как генетические и развития за основу поколения этих моделей, а также экологические факторы, которые способствуют некоторые модели может привести нас к целостное понимание эволюционного процесса и предвзятости и ограничения, накладываемые на этот процесс, развития системы.
Оптимизация руководящие принципы для адаптации к разным видам
При адаптации этот протокол для крыльев разных видов, главной заботой будет делать ткани проницаемой для зонда при сохранении целостности ткани. Таким образом, фиксация и permeablization шаги должны быть оптимизированы. Для Bicyclus куколки крылья, мы обнаружили, что 2 часа исправить при комнатной температуре в свежем буфере PFA и нежный пищеварения К протеиназ является достаточным. Ткани могут быть установлены до 12 часов при температуре 4 ° С, если необходимо, но можно за-фиксировать ткани, которые позволят сократить сигнал, поэтому более короткое время фиксации являются предпочтительными. Обе концентрации фермента и длины и температуру пищеварения должны быть определены эмпирически для каждой ткани. Возраст крылья могут быть важным фактором в пищеварения как пожилые крылья будут иметь более сложную кутикулярные структуры и даже требуют больше пищеварения. Важно помнить, что протеиназы К препараты, которые имеются в продаже не стандартизированы на выполнение конкретной деятельности, и, следовательно, пищеварение условия могут также должны быть скорректированы при изменении лотов. Проницаемость тканей также может быть увеличен путем инкубации в моющих растворов, например, 1% Triton-X решение. Это может быть добавлено до prehybridization шаг.
Еще одной проблемой будет оптимизировать размер зонда, общее правило быть больше, тем лучше. Боб Рид, которая выступала конце куколки крыла в места нахождения имущества в Heliconius, предложил 300 б.п., как размер цели (личное сообщение). Большие зонды, которые могут повысить специфичность сигнала, может быть гидролизуется в помощь их вступления в клетках. В других системах, однако, исследователи обычно используют 1 кб зондов без гидролиза их. Здесь мы использовали зонды вокруг 300bp, а также которые прекрасно работали.
Работа с riboprobes может быть пугающим для лабораторий, не используется для обработки РНК. Мы нашли эту технику, чтобы быть достаточно надежным и содержать несколько шагов, которые минимизируют потери зонда из-за активности РНКазы. Пищеварения протеиназы К удалит загрязнения и РНКазы 50% формамида из prehybridization / гибридизации буфер будет препятствовать РНКазы деятельности (Chomczynski 1992). Поэтому мы призываем людей использовать riboprobes которые увеличивают специфичность сигнала и не столь сложная, как некоторые могут подумать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Джейн Selegue, Маргарет Холлингсворт, Джин Берри, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Александр Popadic, Боб Рид, Рош технической поддержки за помощью в устранении этого протокола. Мы также благодарим Уильям Piel за консультацией по редактированию фильма.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Mounting Medium |
References
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
