Summary
Om genexpressie te onderzoeken in het popstadium vleugel weefsel van Bicyclus anynana, presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor in-situ hybridisaties met behulp van riboprobes. We bieden ook richtlijnen voor de verdere optimalisatie van dit protocol voor het gebruik in popstadium vleugels van andere lepidoptera soorten.
Abstract
Hier presenteren wij, in video-formaat, een protocol voor het in situ hybridisaties in popstadium vleugels van de vlinder Bicyclus anynana met behulp van riboprobes. In situ hybridisaties, een steunpilaar van de ontwikkelingsbiologie, zijn nuttig om de ruimtelijke en temporele patronen van genexpressie studie in de ontwikkeling van weefsels op het niveau van transcriptie. Als antilichamen die het eiwit producten van gentranscriptie doelgroep zijn nog niet ontwikkeld en / of er meerdere genen exemplaren van een bepaald eiwit in het genoom die niet kan worden gedifferentieerd gebruik van beschikbare antilichamen, kan in situs plaats daarvan worden gebruikt. Terwijl de een in-situ techniek voor de larven vleugel disks beschikbaar is geweest voor de vlinder community voor meerdere jaren, heeft het huidige protocol is geoptimaliseerd voor de grotere en meer kwetsbare popstadium vleugels.
Protocol
DAG 1
- Bereid de volgende oplossingen:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- DDH 2 O
- Voeg DEPC voor 0,1% van het totaal volume en krachtig schudden oplossingen.
- Autoclaaf.
- 4% Paraformaldehyde Fix - met behulp van PBS-DEPC
- Proteinase K oplossing - als neerslag aanwezig is, vortex krachtig voordat u aliquot
- Spijsvertering Stop Buffer
- Prehybridisatie Buffer
- 50:50 PBT: prehybridisatie Buffer
- Hybridisatiebuffer
- Oplossingen moeten worden gehouden RNase-vrij. Gebruik een glas-ware dat is gebakken (4 uur bij 250 ° C) of wegwerp plastic. Serologisch pipetten zijn zeer nuttig voor het maken van up oplossingen
- Ontleden vleugels van tijd-geënsceneerd poppen in PBS
- Direct naar vleugels Buffer Fix in putjes van 24 en cultuur plaat bij kamertemperatuur
- Fix schijven voor 2 uur
- Was 5 x 5 minuten in PBT
- Incubeer vleugels gedurende 3 minuten in proteïnase K-oplossing
- Spoel 2 x in spijsvertering Stop Buffer
- Was 5 x 5 minuten in PBT
- Was 2 x 5 minuten in 50:50 PBT: PHB
- Was 1 x 10 minuten in de PHB
- Incubeer in PHB minstens 1 uur bij 55 ° C.
- Warmte-denatureren RNA probe (20-50ng nodig per well) (80 ° C gedurende 5 minuten) en toe te voegen aan hybridisatiebuffer (100 ul nodig per well)
- Voeg sonde naar putten en incubeer 48 uur bij 55 ° C
DAG 3
- Was 4 x 5 minuten in 55 ° C PHB
- Incubeer overnacht in PHB bij 55 ° C
DAG 4
- Bereid de volgende oplossingen:
- Antilichaam Block Buffer
- Was een x 5 minuten in 50:50 PBT: PHB
- Was 4 x 5 minuten in PBT
- Incubeer vleugels voor een uur in Block buffer bij 4 ° C
- Incubeer vleugels in een 1:2000 verdunning van anti-Dig antilichaam overnacht bij 4 ° C
DAG 5
- Bereid volgende oplossingen:
- Detectie Buffer
- Het ontwikkelen van Solution - gevoelig voor licht (wikkel in folie)
- Was 3 x 5 minuten in PBT bij kamertemperatuur
- Was 7 x 5 minuten in PBT
- Spoel vleugels twee keer in Detection Buffer
- De ontwikkeling van vleugels in 1 ml van de ontwikkelingslanden Oplossing - tijd van ontwikkeling moet worden gecontroleerd iedere keer - het ontwikkelen van tijden kan veranderen, zelfs bij gebruik van dezelfde sondes en het ontwikkelen van oplossingen - over het algemeen check na 5-10 minuten en vervolgens te verhogen intervallen tot 's nachts. Plaat moet worden verpakt in folie aan het licht blootstelling te voorkomen wanneer het niet controleren van monsters.
- Spoel vijf keer in ontwikkelingslanden Stop Buffer
- Mount vleugels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optimalisatie van bestaande protocollen
In situ hybridizaties op larvale vleugel schijven zijn met succes uitgevoerd met behulp van schijven van Precis coenia vlinders (Carroll et al., 1994;. Keys et al. 1999;. Weatherbee et al. 1999.). Het huidige protocol is een aangepaste versie van een schriftelijk en gedetailleerd protocol beschikbaar op verzoek van de Carroll Lab de larven vleugel kleuringen. De veranderingen die we dienen om de verschillen tussen larvale en popstadium vleugel weefsels tegemoet te komen. Tijdens pupal hindwing dissecties, moet de peripodial membraan worden verwijderd en niet in de putten. De initiële fix tijd is veel langer in ons protocol, maar de post-fix stap is verwijderd. Wij vonden dat een 10-voudige verdunning van het proteïnase K-oplossing noodzakelijk was voor de fragiele popstadium vleugel weefsel, terwijl nog het toestaan voor een succesvolle penetratie probe. We vonden ook dat het blokkeren van de vleugels voor de antilichaam kleuring sterk achtergrond verminderd, terwijl het verhogen van de antilichaam incubatie een nacht bij 4 ° C gestegen signaalsterkte.
Toepassingen
De toepassingen van dit protocol zijn talrijk. In staat zijn om lokaliseren de expressie van een kandidaat-gen op het ontwikkelen van een popstadium vleugel is de eerste stap in wat impliceert dit gen in een aantal functionele rol tijdens de vleugel of vleugel patroon ontwikkeling (Marcus et al., 2004;. Ramos et al. 2006.). Als er meerdere genen waarvan bekend is dat interactie in andere systemen zijn samen mede-uiting op de vleugels kan dit impliceren de coöptatie van meer uitgebreide gen-netwerken in het specificeren van nieuwe vleugel patronen (Monteiro et al.. 2006). Vlinder vleugel patroon evo-devo biedt een rijk systeem waarbij relevante evo-devo vragen met betrekking tot de processen van gen en gen-netwerk co-optie, de evolutie van de nieuwigheden, de evolutie van de convergente en parallel trekken, de evolutie van de seriële homologie, en van gen duplicatie en sub-functionalisering kunnen allemaal worden onderzocht in een geïntegreerde wijze. Bovendien, vlinders weer een verbijsterende verscheidenheid van vleugel patronen die een rol spelen in soorten herkenning, seksuele selectie, mimiek, thermoregulatie en roofdier vermijden spelen. Inzicht in zowel de genetische en ontwikkelingsstoornissen basis achter het genereren van deze patronen, maar ook de ecologische factoren die bepaalde patronen gunst kan brengen ons naar een holistisch begrip van het evolutionaire proces en van de vooroordelen en de beperkingen die worden opgelegd aan dit proces door ontwikkelings-systemen.
Optimalisatie richtlijnen voor de aanpassing aan verschillende soorten
Bij de aanpassing van dit protocol om vleugels van verschillende soorten, zal de belangrijkste zorg zijn het maken van het weefsel doorlaatbaar voor de sonde met behoud van de integriteit van het weefsel. Daarom zal de fixatie en permeablization stappen moeten worden geoptimaliseerd. Voor Bicyclus pupal vleugels, hebben we ontdekt dat een twee uur vast te stellen op kamertemperatuur in verse PFA buffer en een zachte proteïnase K vertering voldoende is. Weefsels worden vastgesteld tot 12 uur bij 4 ° C, indien nodig, maar het is mogelijk om over-fix weefsel, die zal verminderen signaal zijn zo kortere fixatie tijden de voorkeur. Zowel het enzym concentratie en de lengte en de temperatuur van de spijsvertering moet empirisch worden bepaald voor elk weefsel. De leeftijd van de vleugels kan een belangrijke factor zijn in de vertering als oudere vleugels hebben meer uitgebreide cuticulair structuren en neen vereisen een langere spijsvertering. Het is belangrijk te onthouden dat proteïnase K-preparaten die commercieel verkrijgbaar zijn niet gestandaardiseerd voor een specifieke activiteit en kan daardoor de spijsvertering voorwaarden moeten ook worden aangepast bij het wisselen van percelen. De permeabiliteit van weefsel kan ook worden verhoogd door incubatie in detergent oplossingen, bijvoorbeeld een 1% Triton-X-oplossing. Dit kan voorafgaand aan de prehybridisatie-stap worden toegevoegd.
Een andere zorg zal zijn om probe grootte te optimaliseren, vuistregel dat groter is beter. Bob Reed, die heeft late popstadium vleugel uitgevoerd in situs in Heliconius, 300 bp voorgesteld als een beoogde omvang (persoonlijke communicatie). Grotere sondes, die de specificiteit van het signaal te verhogen, kunnen worden gehydrolyseerd tot hun opneming steun in de cellen. In andere systemen, echter, onderzoekers routinematig gebruik van een kb sondes zonder hydrolyse van hen. Hier gebruikten we sondes rond 300bp en die werkte prima.
Werken met riboprobes kan intimiderend zijn voor laboratoria niet worden gebruikt voor het hanteren van RNA. Wij hebben gevonden deze techniek redelijk robuust en verschillende stappen die het verlies van sonde te wijten aan RNase activiteit te minimaliseren bevatten. Het proteïnase K spijsvertering zal verwijderen RNase vervuiling en de 50% formamide van de prehybridisatie-/ hybridisatie buffers RNase activiteit remmen (Chomczynski 1992). Daarom moedigen we mensen aan riboprobes die de specificiteit van het signaal te verhogen gebruik en zijn niet zo intimiderend als sommigen denken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche technische ondersteuning voor hulp bij het oplossen van dit protocol. We danken ook William Piel voor advies over het bewerken van de film.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Mounting Medium |
References
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
