Summary
גידולים בשלפוחית השתן הן הוקמה בשנת נקבות העכברים בצורה פולשנית דרך צנתור, צריבה המקומי, בעקבות הידבקות של תאים קרצינומה לאתרים לשרוף.
Abstract
בהליך זה פשוט, גידולים בשלפוחית השתן הן הוקמה בשנת C57 נקבות עכברים באמצעות צנתור, צריבה המקומי, הידבקות התא הבאים. לאחר שלפוחיות השתן שלהם הם צינתור transurethrally והריק, בעלי חיים צינתור שוב כדי לאפשר החדרת חוט פלטינה לתוך שלפוחיות מבלי לפגוע השופכה או בשלפוחית השתן. צנתרים עשויים טפלון לשמש כמבודד על חוט, אשר תנהל זרם חשמלי לתוך השלפוחית כדי ליצור פגיעה לשרוף. יחידת electrocautery משמש כדי לספק 2.5W עד סוף חשוף של הכבל, שתשרוף את שכבות תאי ומתן אתרי מצורף קרצינומה של תאים, אשר נשלחו על ההשעיה לשלפוחית השתן דרך צנתור מאוחר יותר. תאים נשארים בשלפוחית במשך 90 דקות, שלאחריו צנתרים יוסרו שלפוחיות המותר כדי לנקז באופן טבעי. הפיתוח של הגידול מנוטר באמצעות אולטרסאונד. תשומת לב ספציפית משולמת טכניקת צנתור בסרטון הנלווה.
Protocol
1. בעלי חיים
- נקבה C57BL/6J עכברים (Mus שריר) מאומתים ללא ectoparasites מדבקת, endoparasites helminth, ונוגדנים ל 17 וירוסים Murine על ידי הספק לפני המשלוח. עכברים הם שוכנו במתקן AAALAC-מוכר את החיה של אוניברסיטת טוליין בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. 1
- באופן ספציפי, עכברים הם הקבוצה שוכנו (4-5 עכברים / לכלוב) צמרות פוליקרבונט מאוורר בנפרד cageswith microisolation לסנן על מצע עץ. הם סיפקו את המודעה מכרסם pelleted כרצונך מזון ומים מהברז.
- עכברים מותר 7 ימים להסתגל לפני תחילת המחקר.
2. תאים
- קרצינומה של תא תא Murine מעבר לקו MB49 משמש לייצור גידולים בשלפוחית השתן.
- הם תאים בתרבית בינוני שונה Dulbecco של הנשר בתוספת סרום 10% שור עוברית, 100 יחידות / מ"ל פניצילין, ו 100 יחידות / מ"ל סטרפטומיצין.
- תרבויות מתוחזקים על 37 ° C ו 5% CO 2 עם התקשורת משתנה כל יומיים שלושה.
3. גידול בעלי חיים דגם orthotopic
החדרה של המודל שלפוחית השתן הגידול המתואר כאן הוא שינוי של ההליך שתואר על ידי גינטר ואח' 2.
- הרדמה מושרה עם 2% isoflurane (MWI / VetOne, מרידיאן, מזהה, חתול # 501017) חמצן ומתוחזק על 0.75-1.25%. (חיות מרובות ניתן לטפל בו זמנית, אשר יחייב עלייה ברמות isoflurane.) כדי למנוע התייבשות הקרנית, העיניים משומנים במשחה דמעות מלאכותיות עיניים. חום הגוף נשמר עם כרית מחוממת תחת לעטוף נייר.
- הפרווה של הגב התחתון נחתך כדי לקדם את הקשר עם לוחית מתכת הארקה, ואזור מגולח מצופה בג'ל electroconduction.
- עכבר כל כך להציב בנפרד על צלחת הארקה מתכת recumbancy הגב, ואת שלפוחית השתן היא באמצעות צינתור transurethrally משומנים 24-מד, 3 / 4 אינץ', Over-the-מחט קטטר IV עם stylet הסיר.
- בשלפוחית השתן מנוקז של שתן, חוט פלטינה מוחדר דרך קטטר לתוך שלפוחית השתן משאיר חוט חשוף בכל צד של הקטטר כ - 2 מ"מ על קצה lumenal של הקטטר. חוט עשוי פלטינה בגלל ההתנגדות של החומר חמצון.
- הנוכחי 2.5 W מוחל אז שלפוחית השתן לרגע כ 0.5 ידי נגיעה את החלק החיצוני של חוט עם יחידת electrocautery מוגדר קרישה.
- חוט לאחר מכן מועבר למיקום השני שלפוחית השתן ועוד תשלום 2.5 W מיושם.
- החוט מוסר, ו 100 μl של תאים MB49 בריכוז של 1x10 6 תאים / מ"ל היא החדירו דרך קטטר לתוך שלפוחית השתן באמצעות מזרק 1ml.
- מזרקים הם שמאל המחוברים צנתרים כדי למנוע בזרימת של המתלים התא העכברים צינתור נשמרות תחת הרדמה במשך 90 דקות כדי לאפשר לתאים לצרף את האתרים לשרוף.
- 100-200 μl של תמיסת מלח סטרילית נורמלי הוא בזריקה IP עכבר אחד לפני התאוששות.
- בתום תקופת הדגירה צנתרים מוסרים את בעלי החיים מותר להתאושש על משטח מחומם עד רפלקסים ליישר לחזור, ובנקודה העכברים מוחזרים כלובים לביתם.
4. אולטראסאונד
- גידולים מותר לגדול במשך 3-5 ימים לפני העכברים לעבור בדיקת אולטרסאונד של שלפוחית השתן כדי לפקח על הגידול.
- עבור בדיקות אולטרסאונד ראשוני, בעלי חיים מורדמים כמתואר לעיל. עכברים ממוקמים recumbancy הגב, הבטן והעור הוא הוכן על ידי גזירת הפרוות.
- קטטר 24 IV מד מוכנס לתוך transurethrally בשלפוחית השתן. בשלב זה, שלפוחית השתן ניתן לנקז שתן שנאספו לניתוח נוסף.
- 100 μl של תמיסת מלח סטרילית נורמלי הוא החדירו לתוך שלפוחית השתן באמצעות קטטר כדי לשפר את הנראות שלפוחית השתן באולטראסאונד.
- הולכה ג'ל אולטראסאונד מוחל על הבטן, אולטרסאונד מבוצע על מנת להעריך את קיר שלפוחית השתן לומן.
5. נציג תוצאות:
רקמת הגידול יתחילו להופיע 3-5 ימים לאחר innoculation. מניסיוננו, קבוצה של 12 עכברים, 50% או יותר שגרתי יש מסת רקמת לזיהוי בתוך השלפוחית (0.5-1.0 μl, באמצעות V = π / 6 ° L ° W · H) על ידי חמישה ימים. בעת שימוש MB 49 תאים, גידולים ימשיכו לגדול המתת חסד יידרש על ידי 24 יום אם ללכת העכברים שלא טופלו. המתת חסד מומלץ כאשר העכברים להיות רדום או cachectic, להציג פרווה פרועות, מכנס, שאינם מגיבים התנהגות, או כאשר הם מאבדים 20% ממשקל הגוף הראשוני שלהן. </ P>
הגידולים לגדול במהירות יהיה מרכזי נמקי לאחר שהם מגיעים המוני של 200 מ"ג או יותר, 3 לכאורה כי התאים בגידול בפיתוח מתרבים מהר יותר מאשר מה שניתן לתיקון על ידי אספקת הדם angiogenic. אפשר גם לעקוב אחר התקדמות הגידול בעקיפין דרך רמת hematurea, אשר קשורה כנראה אנגיוגנזה מהירה בתוך גידולים מתפתחות. צוין באופן עקבי כי שתן של נושאות גידולים עכברים שלא טופלו בחומר הכלול דם ביום 14. ריכוז כדוריות הדם האדומות הופיעו להגדיל לאורך זמן אצל עכברים אלו, הכרכים של שתן שנאספו פחתה. גידולים עודף של 50 מ"ג יכול להיות גם מישש בקלות יחסית, בדרך כלל על ידי innoculation 14 ימים הודעה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו פולשנית של הקמת גידולים בשלפוחית השתן בעכברים orthotopic הנשי יכול להיות מיושם גם על סוגי תאים אחרים מאשר MB49, למרות תוצאות שונות צריך להיות צפוי. כאשר פחות אגרסיבי תאים סרטניים נמצאים בשימוש, הגדלת חלשות במקצת (באמצעות במרווחים של 0.5 W להקים את אופטימלית חדש) תניב אזור נוח יותר מצורף תאים סרטניים, עוד הדגירה שלפוחית השתן פעמים עבור התאים החדירו יניבו כמות גדולה יותר של תא מצורף באתרי לצרוב (נתונים שלא פורסמו). אף על פי פרוטוקולים מסוימים ממליצים על מתן 10 W דרך electrocautery, 2 כמות זו של הכוח צריך להיחשב גבול עליון, ואולי יש להימנע לחלוטין. הגדלת הריכוז של התאים מועברים גם יכול להגדיל את סיכויי ההצלחה כאשר סוגי תאים אחרים משמשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול המוסדי ועדת שימוש אוניברסיטת טוליין.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי בפרס קרן המדע הלאומית הקריירה (CBET-0846395) ואת המחלקה לרפואה השוואתי, אוניברסיטת טוליין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-5-wk-old |
| Polycarbonate cages and ventilated rack | Lab Products | Super Mouse 750 | 327mm x 190mm x 143mm |
| Hardwood Bedding | Harlan Laboratories | Laboratory –grade SaniChips | |
| Rodent diet | Harlan Laboratories | Rodent Diet 2019 | |
| IV Catheter | MWI Veterinary Supply | 009231 | 24 G x ¾ in. |
| Electrocautery unit | Bovie Medical Corporation | Aaron 900 | |
| Ultrasound unit | Sonosite | 180 Plus (Vet) | |
| MB49 cell line | Wake Forest University Baptist Medical Center | N.A. | |
| DMEM | Invitrogen | 21063-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100106 500A57B | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-163 |
References
- Institute of Laboratory Animal Resources. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).
- Gunther, J. H., Jurczok, A., Wulf, T., Brandau, S., Deinert, I., Jocham, D. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Zhang, X., Atala, A., Godbey, W. T. Expression-targeted gene therapy for the treatment of transitional cell carcinoma. Cancer Gene Ther. 15, 543-552 (2008).
