Summary
Tumeurs de la vessie sont établis dans des souris femelles d'une façon minimalement invasive grâce à un cathétérisme, la cautérisation locale, et l'adhésion subséquente des cellules de carcinome des sites brûler.
Abstract
Dans cette procédure simple, tumeurs de la vessie sont établis en femelles souris C57 grâce à l'utilisation de la cathétérisation, la cautérisation locale, et l'adhésion cellulaire subséquente. Après leurs vessies sont transurethrally cathétérisés et égouttés, les animaux sont à nouveau cathéter pour permettre l'insertion d'un fil de platine dans vessies sans endommager l'urètre ou la vessie. Les cathéters sont en téflon pour servir comme un isolant pour le fil, qui va conduire le courant électrique dans la vessie afin de créer une brûlure. Une unité de l'électrocoagulation est utilisé pour fournir 2,5 W à l'extrémité exposée du fil, brûlant couches extracellulaires et en fournissant des sites de fixation pour les cellules de carcinome qui sont livrés en suspension de la vessie par un cathétérisme ultérieur. Cellules restent dans la vessie pendant 90 minutes, après quoi les cathéters sont retirés et les vessies a permis de drainer naturellement. Le développement de la tumeur est surveillé par échographie. Une attention particulière est accordée à la technique de cathétérisme dans la vidéo qui l'accompagne.
Protocol
1. Animaux
- Femme C57BL/6J souris (Mus musculus) sont vérifiés gratuitement des ectoparasites contagieuse, endoparasites helminthes, et des anticorps à 17 virus murins par le vendeur avant l'expédition. Les souris sont logées dans l'animalerie AAALAC accrédité de l'Université Tulane en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire 1.
- Plus précisément, les souris sont logés en groupe (4-5 souris / cage) en polycarbonate sommets individuellement ventilées microisolation cageswith filtre sur la literie de feuillus. Ils sont fournis ad libitum rongeurs nourriture en granulés et l'eau du robinet.
- Les souris sont acceptés 7 jours pour s'acclimater avant le début de l'étude.
2. Cellules
- La lignée murine transition cellulaire du carcinome MB49 est utilisé pour produire les tumeurs de la vessie.
- Les cellules sont cultivées dans un milieu Eagle modifié par Dulbecco supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, 100 unités / ml de pénicilline et 100 unités / ml de streptomycine.
- Les cultures sont maintenues à 37 ° C et 5% de CO 2 avec des médias change tous les deux à trois jours.
3. Modèle de tumeur orthotopique animaux
L'instillation de la tumeur de la vessie modèle décrit ici est une modification de la procédure décrite par Gunther et al. 2
- L'anesthésie est induite avec 2% d'isoflurane (MWI / VetOne, Meridian, ID, Cat # 501017) dans de l'oxygène et maintenu à 0,75 à 1,25%. (Animaux multiples peuvent être traitées simultanément, ce qui nécessiterait une augmentation des niveaux de l'isoflurane.) Pour éviter le dessèchement de la cornée, les yeux sont lubrifiés avec une pommade ophtalmique larmes artificielles. La chaleur du corps est maintenu avec un coussin chauffé sous un drapé de papier.
- La fourrure du bas du dos est coupé pour favoriser le contact avec la plaque de terre en métal, et la zone rasée est enduite d'un gel electroconduction.
- Chaque souris est alors placés individuellement dans des décubitus dorsal sur une plaque de métal mise à la terre, et la vessie est un cathéter en utilisant un transurethrally lubrifié de calibre 24, 3 / 4 pouce, sur-le-aiguille du cathéter IV avec le stylet retiré.
- La vessie est drainée de l'urine, et un fil de platine est inséré à travers le cathéter dans la vessie laissant fil exposé à chaque extrémité du cathéter - environ 2 mm à l'extrémité du cathéter luminal. Le fil est faite de platine en raison de la résistance du matériau à l'oxydation.
- Un courant de 2,5 W est ensuite appliqué à la vessie pendant environ 0,5 secondes en appuyant sur la partie extérieure du fil avec une unité d'électrocoagulation mis à la coagulation.
- Le fil est ensuite déplacé vers un deuxième emplacement dans la vessie et une autre charge de 2,5 W appliqué.
- Le fil est retiré, et 100 ul de cellules MB49 à une concentration de 1x10 6 cellules / ml est instillée par le cathéter dans la vessie par l'intermédiaire d'une seringue de 1ml.
- Les seringues sont laissés attachés à la cathéters pour empêcher l'efflux des suspensions cellulaires, et les souris sont maintenues cathétérisés sous anesthésie pendant 90 minutes pour permettre aux cellules de s'attacher à des sites brûler.
- 100-200 ul de solution saline normale stérile est administré par injection IP à chaque souris avant la récupération.
- A la fin de la période d'incubation les cathéters sont retirés et les animaux sont autorisés à récupérer sur le pavé chauffé jusqu'à ce que les réflexes de redressement retour, à quel point les souris sont retournés dans leurs cages à domicile.
4. Ultrasons
- Les tumeurs sont autorisés à cultiver pendant 3-5 jours avant les souris subissent une échographie de la vessie pour contrôler la croissance tumorale.
- Pour les examens d'échographie initiale, les animaux sont anesthésiés comme décrit ci-dessus. Les souris sont placées dans décubitus dorsal, et la peau abdominale est préparé par clipsage de la fourrure.
- Un calibre 24 IV cathéter est inséré transurethrally dans la vessie. À ce stade, la vessie peut être drainée et l'urine collectés pour analyse ultérieure.
- 100 ul de solution saline normale stérile est instillée dans la vessie par le cathéter vésical pour améliorer la visibilité à l'échographie.
- Gel de la conduction par ultrasons est appliquée à l'abdomen, et l'échographie est effectuée pour évaluer la paroi de la vessie et de lumière.
5. Les résultats représentatifs:
Le tissu tumoral commencent à apparaître 3-5 jours après l'inoculation. Dans notre expérience, dans un groupe de 12 souris, 50% ou plus couramment ont une masse de tissu détectable dans la vessie (0,5 - 1,0 ul, en utilisant V = π / 6 · L · W · H) par jour cinq. Lorsque vous utilisez MB 49 cellules, les tumeurs va continuer à croître et l'euthanasie sera requis par journée de 24 si les souris sont pas traitées. L'euthanasie est recommandée lorsque les souris deviennent léthargiques ou cachectiques, afficher la fourrure ébouriffée, se courber, et non réactive comportement, ou quand ils perdent 20% de leur poids initial. </ P>
Les tumeurs se développent rapidement et ont des centres nécrotiques après avoir atteint une masse de 200 mg ou plus, 3 ostensiblement parce que les cellules de la tumeur en développement prolifèrent plus vite que ce qui peut être desservi par l'approvisionnement en sang angiogéniques. On peut aussi indirectement de surveiller la progression tumorale par le biais du niveau de hematurea, qui est vraisemblablement liée à l'angiogenèse dans les tumeurs rapide développement. Il a été constamment souligné que l'urine des non traitée souris porteuses de tumeurs contenait du sang par jour 14. La concentration de globules rouges semble augmenter au fil du temps chez ces souris, et les volumes d'urine prélevés diminué. Les tumeurs de plus de 50 mg peut également être palpé avec une relative facilité, généralement de 14 jours après l'inoculation.
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Discussion
Cette méthode peu invasive d'établir des tumeurs de la vessie orthotopique chez des souris femelles peuvent aussi être appliqués à certains types de cellules autres que MB49, bien que des résultats différents doivent être anticipés. Lorsque les cellules tumorales moins agressives sont utilisées, ce qui augmente la puissance légèrement (en utilisant par incréments de 0,5 W pour établir le nouvel optimum) donnera une zone plus favorable à la fixation des cellules tumorales, et plus les temps d'incubation de la vessie pour les cellules inculqué donnera une plus grande quantité de la fixation des cellules sur les sites de brûler (données non publiées). Bien que certains protocoles recommandent livrer 10 W par électrocoagulation, 2 cette quantité de puissance doit être considéré comme une limite supérieure, et peut-être être évitée. L'augmentation de la concentration de cellules livré peut également augmenter les chances de succès lors d'autres types cellulaires sont utilisés.
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Disclosures
Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le Comité des soins institutionnels et l'utilisation de l'Université Tulane.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par l'attribution National Science Foundation CARRIÈRE (EFAC-0846395) et le Département de médecine comparée, Université de Tulane.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-5-wk-old |
| Polycarbonate cages and ventilated rack | Lab Products | Super Mouse 750 | 327mm x 190mm x 143mm |
| Hardwood Bedding | Harlan Laboratories | Laboratory –grade SaniChips | |
| Rodent diet | Harlan Laboratories | Rodent Diet 2019 | |
| IV Catheter | MWI Veterinary Supply | 009231 | 24 G x ¾ in. |
| Electrocautery unit | Bovie Medical Corporation | Aaron 900 | |
| Ultrasound unit | Sonosite | 180 Plus (Vet) | |
| MB49 cell line | Wake Forest University Baptist Medical Center | N.A. | |
| DMEM | Invitrogen | 21063-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100106 500A57B | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-163 |
References
- Institute of Laboratory Animal Resources. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).
- Gunther, J. H., Jurczok, A., Wulf, T., Brandau, S., Deinert, I., Jocham, D. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Zhang, X., Atala, A., Godbey, W. T. Expression-targeted gene therapy for the treatment of transitional cell carcinoma. Cancer Gene Ther. 15, 543-552 (2008).
