Summary
肌醇pyrophosphates发挥重要作用，在人类病症如癌症，糖尿病和肥胖，但行动的确切机制是一个有争议的问题。缺乏市售肌醇pyrophosphates呈现详细的研究问题。在这里，我们描述了一个简单的协议，生产和隔离毫克肌醇pyrophosphates。
Abstract
肌醇是目前在任未修改的性质，或在更复杂的磷酸衍生物。最新的，在真核细胞中最丰富的两个pentakisphosphate肌醇（IP 5）和肌醇hexakisphosphate（植酸或IP 6）。知识产权5和IP 6都包含一个或多个焦债券1肌醇焦磷酸分子的前体。磷酸化生成的IP 6 diphoshoinositolpentakisphosphate（IP 7或PP - IP 5）和bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate（IP 8或（PP）2 - 4的IP）。到目前为止，研究所有真核有机体肌醇pyrophosphates已被隔离。此外，负责肌醇焦磷酸合成酶的两个不同的类高度保守的整个进化2-4。
转换的IP 6激酶（知识产权6 KS）具有催化了巨大的灵活性， 知识产权 5 和 6的IP，以PP - IP 4 和 IP 7，随后，通过这些产品为底物，促进更复杂的分子的生成5,6 。近日，焦磷酸酶的第 二类是确定形式的酵母蛋白VIP 1（也称为PP - IP为5 K），它能够转换成IP 6 7到IP和IP 8 7,8 。
肌醇pyrophosphates规范许多不同的细胞过程，如胰岛素的分泌，端粒长度10,11，趋化12，水泡贩运13，磷酸盐动态平衡14和HIV - 1 GAG释放15。两个行动的机制已经被提出了这一类的分子。他们可以通过allosterically与特定的蛋白质，如AKT 的 16相互作用的细胞功能的影响。此外，焦集团捐赠磷酸盐预磷酸化蛋白17。这一研究领域的巨大潜力是阻碍的肌醇pyrophosphates，这是防止许多科学家研究这些分子和这个新的翻译后修饰的商业来源的情况下。目前可用的方法，来隔离肌醇pyrophosphates需要先进的色谱仪器 18,19 。这些程序使用酸性条件下，可能会导致20肌醇焦磷酸降解，从而恢复不好。此外，繁琐的柱后脱盐程序，限制其使用专门的实验室。
在这项研究中，我们描述了一个IP 6激酶和PP - IP 5激酶反应的产品的产生，隔离和净化要求不高的方法。这种方法是可能的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的能力，以解决高度磷酸肌醇磷酸盐20。以下的IP 6 K1和PP - IP 为5 K为底物酶促反应的IP 6，页面用于分离，随后在水洗脱产生肌醇pyrophosphates。
Protocol
1。酶促反应 - 第1天（1小时在下午）
- 第一步是准备10-20独立的酶反应， 其中的IP 6 K1或VIP1 的转换IP 6 pyrophosphorylated亚型。
- 我们使用IP的6 K1和GST - VIP1酶纯化，从E.根据该协议的大肠杆菌以前描述 17,18 。
- 准备50μL的反应，含有1X反应缓冲液（30毫米HEPES pH为6.8，50毫米氯化钠，硫酸镁6毫米，1毫米的数码地面电视），6毫米磷酸（PCR），25 U / mL的CreatinePhosphoKinase（CPK），5毫米（ ATP MG盐），IP6的0.3毫米，0.05〜0.1微克他的IP 6 K1或GST - VIP1。调整音量与MiliQ DDH 2 O
- 简要地旋转在37 ° C过夜旋转的反应和孵化。
2。聚丙烯酰胺凝胶铸造和加载 - 第2天（4个小时，下午）
- 聚丙烯酰胺凝胶是准备用24厘米长，18厘米宽的玻璃板和1.5毫米宽的间隔。通常使用16线或单线制备梳。
- 准备一个组合（50毫升/凝胶）包含以下内容：35.5％（W / V）丙烯酰胺：双丙烯酰胺19:1，1X三/硼酸/ EDTA（TBE），0.05％（W / V）过硫酸铵（APS ），0.05％（W / V）TEMED。倒入混合前播玻璃板之间，插入梳子，让聚合为30-60分钟，在室温下。
- 一旦凝胶聚合，转让设备冷藏室和1X TBE约30-60分钟200-300伏前运行。
- 添加OrangeG染料1X（10毫米的Tris -盐酸pH7.0的，1 mM的EDTA，30％甘油，0.1％OrangeG）到每一个反应。准备样品含有2的IP 6 nmol负载作为一个标准的控制。
- 运行缓冲液使用的注射器和一个21G的针头，以消除任何沉淀的每口井彻底洗净，然后装入凝胶。避免加载上侧井。
- 运行在450-550伏特（7 MAMP /凝胶）过夜的凝胶，凝胶底部在过去的10厘米，直到OrangeG染料带。
3。隔离的IP 7 -第3天（4小时）和第4天（6-7小时SpeedVac干燥过程）
- 拆开凝胶仪器，小心地取出一个玻璃板上留下另一种凝胶。剪切从正上方OrangeG染料带的一小部分的凝胶底部包含的IP标准和一个样本巷， 如图 1所示。
- 溅污几分钟凝胶甲苯胺蓝（0.1％（W / V），20％（W / V）甲醇，甲苯胺蓝2％（W / V）甘油）的削减部分（1-3分钟）或直到肌醇焦带出现。以前删除以防止干燥的未染色的凝胶，凝胶的顶部，把玻璃板。
IP 7段应该是可见的，因为它运行速度略慢 6比IP标准。三磷酸腺苷，运行速度比IP 6，也应可见（ 图1）。传输的凝胶染色部分中去染色溶液（20％（W / V）的甲醇）为几分钟，洗去多余的甲苯胺蓝和重新定位与未染色的凝胶，凝胶。
如果需要更高pyrophosphorylated肌醇亚型（IP和IP 9）可视化，与甲苯胺蓝染色溶液染色凝胶在室温为20分钟。随后，洗去了约15分钟的染色液甲苯胺蓝。
- 用刀片切割未染色的部分作为参考，使用凝胶染色凝胶（ 图1）确定的IP 7迁移位置上的IP 7段。
- 把IP 的7段，从凝胶削减15毫升管，并添加10毫升的MilliQ DDH 2 O为10分钟，在室温下放置在旋转管。丢弃删除超过TBE和微观的丙烯酰胺颗粒的液体。
- 随后，执行两个脱水水化周期。加入5毫升50％（W / V）甲醇管与包含IP 7凝胶，并在室温下2小时旋转。转移到一个新的15 mL的试管中，MilliQ DDH 2 O 5毫升的凝胶片，并在室温下2小时旋转。不要丢弃的甲醇和管MilliQ H 2 O。重新转移在以前使用的15 mL管的聚丙烯酰胺凝胶的脱水水化周期重复一次。洗，可在夜间进行。
- 要集中洗脱IP 7，一起干，10毫升（5毫升MilliQddH 2 O和5毫升50％（W / V）甲醇）在60 ° C的加热一个SpeedVac
- 一旦样品近干，转移剩余的液体（300〜600μL）± 1.5 mL离心管中，2分钟5000转的旋转。
- 收集上清转移到一个新的1.5 mL离心管;离开底部20-30μL，因为它可能含有丙烯酰胺颗粒。
- 如果必要的话，继续使用不加热SpeedVac干燥过程。复苏的IP 7大大减少，如果样品完全干燥，因此终止干燥过程中，当样品达到100-300μL的体积。
4。 IP 7浓度和纯度的测定。
- 使用2-5μL恢复的IP 7示例运行页面上的凝胶，同样第2.2-2.5。载入几个稀释浓度的标准和4 nmol聚磷标记的IP 6（即0.5，1，2，4 nmol）。运行后的凝胶，可视化染色和甲苯胺蓝溶液染色整个凝胶肌醇焦亚型，在3.2节（ 图2A）条所述的程序。
- 苯胺染色后，浓度可通过扫描凝胶，比较之间的IP 6 7和IP强度差异，利用图像处理软件，如图像- J，如图2b所示。
5。代表性的成果：
制备的IP 6 7到IP使用IP 6 K1和VIP1的酶的酶转化，都可以轻松解决使用PAGE分析（ 图 1 ）。 IP作为规模控制的 6甲苯胺蓝凝胶染色装载允许pyrophosphorylated衍生物的识别，因为它们运行速度慢，肌醇环上的磷酸基团的数量而定。上述过程，允许方便的IP 7净化。分析纯化的肌醇焦逐页显示我们的IP 7（ 图2A）的纯度。有趣的是，IP 7 VIP1的产品1/3PP-IP 5异构体的迁移比5PP - IP的IP 7 5异构体，是由IP 6 K1产生慢。使用的IP 6标准允许浓度纯化的IP 7（ 图2B）容易量化。在进一步的实验中使用的 IP 7，其生物活性，可评估
（ 图3）。 5PP - IP 5孵育VIP1的IP 7磷酸DDP1（diphosphoinositol多聚磷酸酯phosphohydrolase）。常规纯化的IP地址转换为IP VIP1 8 DDP1 6到IP（ 图3） 。
图1：页面和隔离的IP 7波段苯胺染色包含标准（IP）的凝胶部分被削减和使用甲苯胺蓝溶液染色。三个频段（从上到下）6 IP 7，IP和ATP。然后对准剩余的凝胶的凝胶染色部分。这使得凝胶含有部分IP 7，这样就可以削减和纯化（虚线框）的本地化。
图2：IP 6 K1和VIP1的反应产物进行分析 。 a）分析甲苯胺蓝染色的IP 6（4，2，1，0.5 nmol）使用，以确定两个IP 6 K1（5PP - IP 5）和VIP1（1/3PP-IP纯化的IP 7浓度5）反应，B）散点图分析，以确定浓度纯化的IP 7。浓度进行了测定，根据带的强度，使用imageJ软件计算，比预先确定的金额的IP 6 。 X轴代表强度，Y轴代表在nmol表示的浓度。
图3：IP 7生物活性的分析，以确定纯化的IP 7的质量，我们培养与VIP1 或与IP 7磷酸DDP1 5PP - IP（IP 6 K1 生成的IP 7）页上的反应，然后解决。 DAPI染色和甲苯胺染色显示8的IP由VIP1预期的生产和转换的IP 7 DDP1的IP 6 。
Discussion
在生物化学肌醇焦的使用受到严格限制商业得不到这种化合物与现有的检测方法的敏感性差。的页面，从而使拥有不同数量的磷酸基团，和甲苯胺蓝（ 图1），异结合磷酸基团的染料，分子分离的结合，使肌醇pyrophoshate开放研究的新途径20亚型容易检测。
页面技术的使用，净化肌醇焦磷酸酶反应产品进行outby无论是知识产权的6 K1或VIP1是一个简单，经济和可靠的方法，可以生产大量高质量的 IP 7。上面介绍的方法是不局限于简单的纯化的IP 7，但稍作修改所描述的协议可能允许不同范围的肌醇pyrophosphates净化。高等磷酸肌醇焦亚型，含有超过8个磷酸基团，可以检测到20,6作为基材使用的 IP或不同数量的 IP 6。这些肌醇pyrophosphates可以检测增加的染色过程中的长度，随后纯化（3.2节）。此外，5知识产权作为酶反应的底物的使用， 将使 PP - IP 5净化和其他含有肌醇肌醇环上的羟基pyrophosphates。
总之，这个要求不高的方法允许可靠的净化毫克量的肌醇pyrophosphates广泛使用的仪器，从而揭开了这一激动人心的研究领域的新途径。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢有益的意见A.列奇和念稿子。这项工作是支持的医学研究理事会（MRC）的拨款，细胞生物学组和一个人类前沿科学计划资助（RGP0048/2009-C）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 | |
| Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 | |
| ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 | |
| PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab | |
| Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 | |
| Temed | VWR | 43083G | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| SpeedVac | Christ | 100218 | |
| Gel apparatus | Hoeffer Scientific Instruments | SE600 | |
| Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 | |
| Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
References
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