Summary
이노시톨 pyrophosphates 인간 pathologies에 중요한 역할 등 암, 당뇨병과 비만을 재생할 수 있지만, 행동의 정확한 메커니즘은 분쟁의 문제입니다. 상용 이노시톨 pyrophosphates의 부족 상세한 연구는 렌더링 문제. 여기 이노시톨 pyrophosphates의 밀리그램을 생산하고 격리하는 간단한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
묘 - 이노시톨도 수정되지 않은 자연의 이상의 복잡한 phosphorylated derivates에 속해 있습니다. 최신, 진핵 세포에서 가장 풍부한 두 사람은 이노시톨 pentakisphosphate IP (5)과 이노시톨 hexakisphosphate (phytic 산성 또는 IP 6)입니다. IP 5 IP 6 하나 이상의 나트륨 채권 하나를 포함 이노시톨 나트륨 분자의 엽 성의 전구 물질입니다. IP 6 인산화은 diphoshoinositolpentakisphosphate IP (7 PP - IP 5) 및 bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 (PP) 2 - IP 4) 생성합니다. 이노시톨 pyrophosphates는 지금까지 공부를 모든 진핵 생물에서 고립되어있다. 또한, 이노시톨 나트륨 합성에 대한 책임 효소의 두 개의 클래스는 매우 진화 2-4 걸쳐 보존되어 있습니다.
IP 6 kinases (IP 6 KS) posses 거대한 촉매 유연성, 5 IP와 PP - IP 4 각각 IP 7 IP 6 이후, 기판 이러한 제품을 사용하여 더 복잡한 분자의 생성 5,6을 촉진 변환 . 최근 나트륨 생성 효소의 두 번째 클래스는 IP 7 8 7,8 IP에 IP 6 변환할 수있는 효모 단백질 VIP 1의 양식 (도 PP - IP 5 K로 함)에서 확인되었다.
이노시톨 pyrophosphates는 인슐린 분비 9, telomere의 길이 10,11, chemotaxis 12 소낭성의 인신 매매 13, 인산 항상성 14 HIV - 1 개그 출시 15 여러 이질적인 세포 과정을 조절. 동작의 두 가지 메커니즘이 분자의 클래스에 대한 제안되었습니다. 그들은 allosterically AKT 16과 같은 특정 단백질과 상호 작용하여 세포 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 또는 나트륨 그룹은 사전 phosphorylated 단백질 17 인산염을 기부하실 수 있습니다. 이 연구 분야의 무한한 잠재력은 이러한 분자이 새 게시물 - translational 수정을 공부하고 많은 과학자를 방해 이노시톨 pyrophosphates의 상용 소스의 부재에 의해 방해합니다. 이노시톨 pyrophosphates을 분리하기 위해 현재 사용할 수있는 방법은 복잡한 색층 장치 18,19 필요합니다. 이러한 절차는 이노시톨 나트륨 저하 20 그러므로 가난한 회복으로 이어질 수 산성 조건을 사용합니다. 또한, 성가신 포스트 컬럼 탈염 절차는 전문 실험실 그들의 사용을 제한할 수 있습니다.
본 연구에서는 우리는 IP 6 키나제와 PP - IP 5 kinases 반응의 제품의 생성, 절연 및 정화를위한 undemanding 방법을 설명합니다. 이 방법은 매우 phosphorylated 이노시톨 polyphosphates 20를 해결하기 위해 polyacrylamide 젤 전기 영동 (PAGE)의 능력에 의해 가능했다. IP 6 K1과 기판과 같은 IP 6을 사용 PP - IP 5 K 효소 반응에 따라, 페이지는 이후 물에 eluted 있던 생성 이노시톨 pyrophosphates를 구분하는 데 사용되었다.
Protocol
1. 효소 반응 - 1 일 (오후에 1 시간)
- 첫 번째 단계는 IP 6 K1이나 VIP1이 pyrophosphorylated isoforms에 IP 6으로 변환하는 효소 반응을 독립 10-20를 준비하는 것입니다.
- 우리는 E.에서 정화 그의 - IP 6 K1과 GST - Vip1 효소를 사용하여 프로토콜에 따라 대장균 이전 17,18 설명했다.
- 1X 반응 완충액 (30 MM의 Hepes 산도 6.8, 50 MM NaCl, 6 MM MgSO 4, 1 ㎜ DTT), 6 당연 PhosphoCreatine (PCR), 25 U / ML CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 MM ATP (MG가 포함된 50 μL 반응 준비 소금), 0.3 MM IP6, 0.05-0.1 μg 그의 - IP 6 K1이나 GST - Vip1. MiliQ ddH 2 O.과 볼륨을 조정
- 간단히 37 반응과 부화 ° C 하루 회전을 스핀.
2. Polyacrylamide 젤 주조 및 로딩 - 2 일 (오후 4 시간)
- polyacrylamide 젤은 24cm 길이 18cm 폭 유리 접시와 1.5 mm 폭 스페이서를 사용하여 준비가되어 있습니다. 보통 16 차선 또는 예비 하나의 레인 빗이 사용됩니다.
- 35.5 % (W / V) 아크릴 아미드 : 비스 - 아크릴 아미드 19시 1분, 1X 트리스 / Borate / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (TBE), 0.05 % (W / V) 암모늄 persulfate (APS는 다음을 포함하는 혼합 (50 ML / 겔) 준비 ), 0.05 % (W / V)가 Temed. , 사전 casted 유리 플레이트 사이의 믹스를 부어 빗를 넣고 RT에서 30~60분을위한 중합 보자.
- 젤 polymerized되면 추위 방기구를 전송하고 200-300 볼트에서 30-60 분 동안 1X TBE에 미리 실행합니다.
- 각 반응 OrangeG 염료의 1X (10 MM 트리스 - HCL pH7.0, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 30 % 글리세롤, 0.1 % OrangeG) 추가합니다. 표준 컨트롤로 로드할 수 IP 6 2 nmol을 포함하는 샘플을 준비합니다.
- 주사기 및 침전물을 제거하는 21G 바늘을 사용하여 버퍼를 실행하는 각 잘 철저히 세척 후 젤을로드합니다. 측면 우물에 로딩하지 마십시오.
- OrangeG 염료 밴드가 젤 하단에서 마지막 10cm 이내가 될 때까지, 450-550 볼트 (7 mAmp / 겔)에서 하룻밤 젤을 실행합니다.
3. IP 7 절연 - 3 일 (4 시간)과 일 4 (6-7시간의 SpeedVac 건조 과정)
- 겔 기기를 분해 조심스럽게 다른 하나 젤 떠나는 한 유리 플레이트를 제거합니다. 그림 1에 표시된 IP 6 표준 하나의 샘플 레인이있는 바닥에 그냥 OrangeG 염료 대역 이상에서 젤의 일부를 잘라.
- 컷 몇 분 동안 Toluidine 블루 (0.1 % (W / V) toluidine 파란색, 20 % (W / V) 메탄올, 2 % (W / V) 글리세롤)로 젤의 부분 (1-3 분) 또는 스테인 이노시톨 나트륨 밴드가 나타날 때까지. 이전에 건조에서 흠없는 젤을 방지하기 위해 젤 위에 다시 제거 유리 접시 놔.
그것은 IP 6 표준보다 약간 느리게 동작하기 때문에 IP 7 밴드가 표시됩니다. IP 6보다 빠르게 실행 ATP는 또한 (그림 1) 표시되어야합니다. 몇 분 동안 데 - 얼룩 솔루션 (20 % (W / V) 메탄올)에 젤의 스테인드 부분을 전송, Toluidine 블루의 초과 멀리 세척하고 흠없는 젤로 젤을 조정.
높은 pyrophosphorylated 이노시톨 isoforms (IP 8 IP 9)의 시각화가 필요한 경우, 상온에서 20 분 Toluidine 블루 얼룩 솔루션 젤 얼룩. 그 후, 약 15 분 드 얼룩 솔루션 Toluidine의 블루 멀리 씻으십시오.
- 면도날은 참조로 스테인드 젤 (그림 1)로 결정 IP 7 마이 그 레이션하는 위치를 사용하여 젤의 흠없는 부분에 IP 7 밴드를 잘라 함께.
- 15 ML 튜브의 겔에서 절단했던 IP 7 밴드 넣고 MilliQ ddH 2 O. 10 ML을 추가 실온에서 10 분 순환에 튜브를 넣어. TBE와 미세한 입자의 아크릴 아미드 초과 제거하는 액체를 폐기하십시오.
- 그 후, 두 탈수 - 수화 사이클을 수행합니다. IP에 7을 포함하는 젤로 튜브의 50 % (W / V) 메탄올 5 ML을 추가하고 2 시간 동안 실온에서 회전. MilliQ ddH 2 O 5 ML를 포함하는 새로운 15 ML 튜브로 겔 슬라이스를 전송하고 2 시간 동안 실온에서 회전. 튜브에서 메탄올과 MilliQ H 2 O을 삭제하지 마십시오. 이전에 사용한 15 ML 튜브에 다시 전송 polyacrylamide 젤로 한 번 더 탈수 - 수화주기를 반복합니다. 세척 중 하나는 밤을 통해 수행할 수 있습니다.
- eluted IP 7을 집중, 60 온수 SpeedVac ° C.를 사용하여 (5 ML MilliQddH 2 O 5 ML 50 % (W / V) 메탄올) 함께 10 ML을 건조
- 샘플이 거의 건조되면 a1.5 ML의 원심 분리기 튜브 및 5000 rpm으로 2 분 동안 회전하는 나머지 액체 (300-600 μl)를 전송합니다.
- 새로운 1.5 ML의 원심 관에 뜨는 및 전송 수집, 휴가이 아크릴 아미드 입자를 포함할 수 있으므로 하단 20-30 μL.
- 필요한 경우하면 unheated SpeedVac를 사용하여 건조 과정을 계속합니다. 샘플 100-300 μL의 볼륨에 도달하면 샘플이 완전히 건조하는 경우 IP 7 복구가 급격하게 감소, 따라서 건조 과정을 종료할 수 있습니다.
4. IP 7 농도 및 순도의 결정.
- 마찬가지로 제 2.2-2.5로, 페이지 젤에서 실행 회수 IP 7 샘플 2-5 μL를 사용하십시오. 농도 표준 및 폴리 - P 마커 4 nmol으로 IP 6 여러 dilutions (예 : 0.5, 1, 2, 4 nmol)을로드합니다. 젤을 실행 후, 섹션 3.2 (그림 2A)에 설명된 절차에 따라 얼룩 및 Toluidine 블루 솔루션 드 얼룩 전체 젤로 이노시톨 나트륨의 isoforms을 시각화.
- Toluidine의 얼룩 후, 농도는 그림의 2B에 나타난 젤 검사 및 IP 6 IP 7 일 사이 강도의 차이를 비교, 같은 이미지 - J와 같은 이미징 소프트웨어를 사용하여 결정하실 수 있습니다.
5. 대표 결과 :
IP 6 K1과 VIP1 효소를 사용하여 IP 7 IP 6 예비 효소 변환은 쉽게 페이지 분석 (그림 1)를 사용하여 해결될 수 있습니다. 그들은 이노시톨 고리에 존재하는 인산염 그룹의 수에 따라 느리게 실행 이후 Toluidine 블루 겔 얼룩과 함께 크기 조절과 같은 IP 6 로딩은 pyrophosphorylated derivates의 확인하실 수 있습니다. 위에서 설명한 절차는 IP 7 쉽게 정화 수 있습니다. 페이지에서 정화 이노시톨 나트륨의 분석은 우리의 IP 7 (그림 2A)의 순결을 공개했다. 흥미롭게도, VIP1의 IP 7 제품의 1/3PP-IP 5 이성질체는 IP 6 K1에 의해 생성되는 IP 7 5PP - IP 5 이성질체보다 약간 느린 마이 그 레이션합니다. 정화 IP 7 (그림 2B)의 농도 쉽게 부량을 허용 IP 6 기준 중 하나를 사용하십시오. 자세한 실험 IP 7을 사용하기 전에, 그 생물 학적 활동은 평가 수
(그림 3). 5PP - IP 5 VIP1과 IP 7 인산 가수 분해 효소 DDP1 (diphosphoinositol의 polyphosphate의 phosphohydrolase)와 incubated입니다. 정기적으로, 정화 IP 7 DDP1 (그림 3)에 의해 VIP1하여 IP 8과 IP 6으로 변환됩니다.
그림 1 :. IP 7 밴드의 페이지와 고립의 Toluidine 얼룩은 표준 IP (6)이있는 젤의 부분은 절단 및 Toluidine 블루 솔루션을 사용하여 얼룩되었습니다. 세 밴드가 (위에서 아래로) IP 7, IP 6 ATP를 나타냅니다. 젤의 스테인드 부분은 다음 젤의 나머지에 부합했다. 이것은 다음 (점선 상자) 잘라 정화 수있는 IP의 7을 포함하는 젤 부분의 현지화 수 있습니다.
그림 2 : IP 6 K1과 VIP1 반응 제품의 페이지 분석. A) Toluidine 블루 염색법에 의해 IP 6 분석 (4, 2, 1, 0.5 nmol)는 IP 6 K1 (5PP - IP 5) 및 VIP1 (1/3PP-IP 모두에서 정화 IP 7 농도를 결정하기 위해 사용되었습니다 5) 반응. B) 스캐터 플롯 분석 정화 IP 7의 농도를 결정합니다. 농도는 IP 6 미리 정해진 금액에 비해 imageJ 소프트웨어를 사용하여 계산 밴드 강도,에 따라 결정됩니다. X - 축은 농도를 나타내고 y 축은 nmol 표현 농도를 나타냅니다.
그림 3 :. IP 7 생물 학적 활동의 분석 정화 IP 7의 품질을 확인하려면 우리는 DDP1 VIP1 또는 IP 7 인산 가수 분해 효소와 5PP - IP 5 (IP 6 K1 생성된 IP 7) incubated 다음 페이지에 대한 반응을 해결. DAPI와 Toluidine 얼룩이 VIP1의 IP 8 예상 생산과 DDP1하여 IP 6 IP 7의 변환을 공개했다.
Discussion
생화학에서 이노시톨 나트륨의 사용은 심각하게 이러한 화합물의 상업 unavailability와 기존의 검색 방법의 가난한 감도에 의해 제한됩니다. 다른 인산염 그룹의 번호, Toluidine 블루 (그림 1), 인산염 그룹에 바인딩 metachromatic 염료를 가진 분자의 분리를 가능하게 페이지의 결합 연구 20 새로운 길을 여는 이노시톨 pyrophoshate의 isoforms의 쉬운 검색이 가능합니다.
효소 반응의 이노시톨 나트륨 제품을 정화 페이지 기술의 설명 사용 IP 6 K1이나 VIP1 하나 고품질의 IP 7 다량의 생산을 허용 간단, 경제적 안정 방법입니다 outby 실시. 위에서 설명한 방법은 7 IP의 간단한 정화에 국한되지 않습니다하지만 설명 프로토콜의 사소한 수정 이노시톨 pyrophosphates의 다른 범위의 정화를 허용할 수 있습니다. 이상의 여덟 인산염 그룹을 포함하는 높은 phosphorylated 이노시톨 나트륨의 isoforms은 기판 20,6로 IP 7 IP 6 다른 양의를 사용하여 검색하실 수 있습니다. 이러한 이노시톨 pyrophosphates은 얼룩 절차의 길이를 증가하고 이후 (3.2) 정화에 의해 감지하실 수 있습니다. 또한, 효소 반응을위한 기판으로 IP 5 사용 PP - IP 5 정화 및 이노시톨 고리에 수산기 그룹을 포함하는 다른 이노시톨 pyrophosphates을 허용합니다.
결론적으로,이 undemanding 방법은 이처럼 흥미로운 연구 분야에 대한 새로운 길을 열어, 널리 사용 악기 이노시톨 pyrophosphates의 밀리그램 수량의 안정적인 정화를 위해 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 도움이 덧글에 대한 A. 이럴 감사하고 원고를 읽을 수 있습니다. 이 작품은 셀 단위로 생물 의학 연구위원회 (MRC) 기금에 의해 그리고 인간 프론티어 과학 프로그램 그랜트 (RGP0048/2009-C)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 | |
| Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 | |
| ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 | |
| PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab | |
| Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 | |
| Temed | VWR | 43083G | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| SpeedVac | Christ | 100218 | |
| Gel apparatus | Hoeffer Scientific Instruments | SE600 | |
| Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 | |
| Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
References
- Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling. Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).
- Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. Are inositol pyrophosphates signalling molecules? J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).
- Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function. Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).
- Shears, S. B.
- Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases. Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).
- Draskovic, P. Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups. Chem Biol. 15, 274-286 (2008).
- Mulugu, S. A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate. Science. 316, 106-109 (2007).
- Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases. J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).
- Illies, C. Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells. Science. 318, 1299-1302 (2007).
- Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).
- York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. Inositol diphosphate signaling regulates telomere length. J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).
- Luo, H. R. Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions. Cell. 114, 559-572 (2003).
- Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).
- Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).
- Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).
- Bhandari, R. Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).
- Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1). Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).
- Otto, J. C. Biochemical analysis of inositol phosphate kinases. Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).
- Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).
