Summary
Pirofosfatos inositol desempenhar um papel importante em patologias humanas como câncer, diabetes e obesidade, no entanto, o mecanismo exato de ação é uma questão de disputa. A falta de disponível comercialmente pirofosfatos inositol estudos detalhados torna problemática. Aqui nós descrevemos um protocolo simples para produzir e isolar miligramas de pirofosfatos inositol.
Abstract
Myo-inositol está presente na natureza ou não modificado ou mais complexos derivados fosforilados. Do último, os dois mais abundantes nas células eucarióticas são pentakisphosphate inositol (IP 5) e hexakisphosphate inositol (ácido fítico ou IP 6). IP 5 e IP 6 são os precursores de moléculas de pirofosfato inositol que contêm uma ou mais ligações pirofosfato 1. Fosforilação de IP 6 gera diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 ou PP-PI 5) e bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 ou (PP) 2 IP-4). Pirofosfatos inositol foram isolados de todos os organismos eucarióticos, até agora estudados. Além disso, as duas classes distintas de enzimas responsáveis pela síntese de pirofosfato inositol são altamente conservadas ao longo da evolução 2-4.
O IP 6 quinases (IP 6 Ks) possuem uma enorme flexibilidade catalítico, convertendo IP 5 e IP 6 a PP-IP 4 e IP 7, respectivamente e, posteriormente, usando estes produtos como substratos, promover a geração de moléculas mais complexas 5,6 . Recentemente, uma segunda classe de enzimas gerando pirofosfato foi identificada na forma da proteína de levedura VIP 1 (também conhecido como PP-PI 5 K), que é capaz de converter IP 6 e IP 7 e 8 IP 7,8.
Pirofosfatos inositol regular muitas diferentes processos celulares, tais como a secreção de insulina, 9 de telômeros de comprimento 10,11, quimiotaxia, 12 de tráfico vesicular 13, 14 e homeostase do fosfato HIV-1 gag release 15. Dois mecanismos de ação têm sido propostos para esta classe de moléculas. Eles podem afetar a função celular por alostericamente interagir com proteínas específicas como a AKT 16. Alternativamente, o grupo pirofosfato pode doar um fosfato de pré-fosforilada proteínas 17. O enorme potencial deste campo de pesquisa é dificultada pela ausência de uma fonte comercial de pirofosfatos inositol, que está impedindo que muitos cientistas de estudar essas moléculas e esta modificação pós-translacional novo. Os métodos actualmente disponíveis para isolar pirofosfatos inositol exigem aparato cromatográfico sofisticado 18,19. Estes procedimentos utilizam condições ácidas que podem levar à degradação pirofosfato inositol 20 e, assim, para a recuperação pobres. Além disso, o incômodo procedimentos pós-coluna dessalinização restringir seu uso aos laboratórios especializados.
Neste estudo, descrevemos um método pouco exigente para a geração de isolamento e purificação dos produtos do IP 6-quinase e PP-IP 5-quinases reações. Este método foi possível pela capacidade de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para resolver altamente fosforilada polifosfatos inositol 20. Após IP 6 K1 e PP-IP 5 reações enzimáticas K usando 6 IP como substrato, PAGE foi usada para separar o pirofosfatos gerada inositol, que foram posteriormente eluídos em água.
Protocol
1. Reação enzimática - 1 º dia (1 hora da tarde)
- O primeiro passo é preparar 20/10 independentes reações enzimáticas em que IP 6 K1 ou VIP1 converter IP 6 e as isoformas pyrophosphorylated.
- Usamos His-IP 6 K1 e GST-Vip1 enzimas purificada de E. coli acordo com o protocolo descrito anteriormente 17,18.
- Prepare 50 mL reações contendo 1X tampão de reação (30 mM Hepes pH 6,8, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM fosfocreatina (PCr), 25 U / mL CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg sal), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 mg His-IP 6 K1 ou GST-Vip1. Ajustar o volume com MiliQ DDH 2 O.
- Brevemente girar a reação e incubar a 37 ° C durante a noite com rotação.
2. Fundição em gel de poliacrilamida e carregamento - dia 2 (4 horas da tarde)
- O gel de poliacrilamida é preparada usando 24 cm de comprimento, 18 cm de largura e placas de vidro 1,5 milímetros espaçadores de largura. Geralmente uma faixa de 16 ou um preparativo comb única pista é usada.
- Prepare uma mistura (50 mL / gel) contendo o seguinte: 35,5% (w / v) acrilamida: bis-acrilamida 19:1, persulfato de amônio 1X Tris / Borato / EDTA (TBE), 0,05% (w / v) (APS ), 0,05% (w / v) Temed. Despeje a mistura entre o pré-fundido placas de vidro, coloque o pente e deixar polimerizar por 30-60 minutos em temperatura ambiente.
- Uma vez que o gel tem polimerizado, a transferência do aparelho para a sala fria e pré-executado em TBE 1X por cerca de 30-60 minutos a 200-300 Volts.
- Adicionar 1X de OrangeG corante (10 mM Tris-HCl pH 7,0, EDTA 1 mM, glicerol 30%, 0,1 OrangeG%) para cada reação. Preparar uma amostra contendo 2 nmol de IP 6 para carregar como um controle padrão.
- Lavar cada cavidade completamente com tampão de corrida usando uma seringa e uma agulha 21G para remover qualquer precipitado, em seguida, carregar o gel. Evitar carregar nos poços de lado.
- Executar o gel durante a noite a 450-550 volts (7 mAmp / gel), até que a banda corante OrangeG é nos últimos 10 cm da parte inferior do gel.
3. Isolamento do IP 7 - dia 3 (4 horas) e dia 4 (6-7 processo SpeedVac hora de secagem)
- Desmontar o aparelho gel e remova cuidadosamente uma placa de vidro deixando o gel sobre o outro. Corte uma pequena porção do gel a partir de apenas acima da banda corante OrangeG para o fundo que contém o padrão de 6 IP e uma pista de amostra, conforme mostrado na Figura 1.
- Mancha a parte cortada do gel com Azul de Toluidina (0,1% (w / v) azul de toluidina, 20% (w / v) metanol, 2% (w / v) de glicerol) por alguns minutos (1-3 min) ou até que a banda pirofosfato inositol aparece. Coloque a placa de vidro previamente removido de volta ao topo do gel para evitar o gel imaculada de secagem.
A banda 7 IP devem ser visíveis, uma vez que é executado um pouco mais lento do que o padrão de 6 IP. ATP, que corre mais rápido do que 6 IP, também deve ser visível (Figura 1). Transferir a parte manchada do gel em uma solução de coloração (20% (w / v) metanol) por alguns minutos, lave o excesso de azul de toluidina e reposicionar o gel com o gel imaculada.
Se a visualização de maior pyrophosphorylated isoformas inositol (IP 8 e IP 9) é exigido, a mancha do gel com azul de toluidina solução corante por 20 minutos em temperatura ambiente. Posteriormente, lavar o azul de toluidina com a solução de coloração para cerca de 15 minutos.
- Com uma lâmina de corte da banda 7 IP na parte imaculada do gel utilizando como referência a posição migração IP 7 determinada com o gel corado (Figura 1).
- Colocar a banda 7 IP que foi cortada do gel em um tubo de 15 mL e adicionar 10 mL de MilliQ DDH 2 O. Coloque os tubos em rotação por 10 minutos em temperatura ambiente. Descartar o líquido para remover o excesso de partículas de acrilamida TBE e microscópicas.
- Posteriormente, realizar duas desidratação-hidratação ciclos. Adicionar 5 mL de 50% (w / v) metanol para o tubo com o gel contendo 7 IP e rodar em temperatura ambiente por 2 horas. Transferência do gel para um tubo de 15 mL novo contendo 5 mL de MilliQ DDH 2 O e gire em temperatura ambiente por 2 horas. Não descarte o metanol e MilliQ H 2 O a partir dos tubos. Repita o ciclo de desidratação-hidratação, uma vez mais por re-transferência de gel de poliacrilamida a nos 15 tubos mL usado anteriormente. Uma das lavagens podem ser realizadas durante a noite.
- Para concentrar o IP eluída 7, secar a 10 mL em conjunto (5 mL MilliQddH 2 O e 5 mL de metanol 50% (w / v)), utilizando um SpeedVac aquecida a 60 ° C.
- Uma vez que as amostras são quase seco, transferir o líquido restante (300-600 mL) para A1.5 tubo de centrifugação mL e girar durante 2 minutos a 5000 rpm.
- Recolher o sobrenadante e transferir para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL; deixara 20-30 mL de fundo, pois pode conter partículas de acrilamida.
- Se necessário continuar o processo de secagem usando um SpeedVac sem aquecimento. A recuperação do IP 7 é drasticamente reduzido se as amostras secar completamente, portanto, finalizar o processo de secagem quando as amostras atingir o volume de 100-300 mL.
4. Determinação da concentração de 7 IP e pureza.
- Use 2-5 mL da amostra recuperada IP 7 para executar em um gel de PAGE, à semelhança do Seções 2.2-2.5. Carregar várias diluições de IP 6 (ie 0,5, 1, 2, 4 nmol) como padrão de concentração e 4 nmol de Poly-P marcador. Depois de executar o gel, visualize as isoformas pirofosfato inositol por coloração e coloração de-gel com toda a solução de toluidina azul, seguindo o procedimento descrito na Seção 3.2 (Figura 2A).
- Após a coloração toluidina, as concentrações podem ser determinadas por varredura do gel e comparar as diferenças de intensidade entre 6 IP e IP 7, utilizando o software de imagem, como J-Imagem, como mostrado na Figura 2B.
5. Resultados representativos:
A conversão enzimática de preparativa IP 6 e IP 7 usando enzimas IP 6 K1 e VIP1 pode ser facilmente resolvida através da análise PAGE (Figura 1). O carregamento de seis IP como um controle de tamanho juntamente com Toluidina coloração azul gel permite a identificação dos derivados pyrophosphorylated, uma vez que ficar mais lento, dependendo do número de grupos fosfatos presentes no anel de inositol. O procedimento descrito acima permite a purificação fácil de 7 de IP. A análise do pirofosfato purificada inositol por PAGE revelou a pureza do nosso IP 7 (Figura 2A). Curiosamente, a 1/3PP-IP 5 isômero do produto 7 de IP VIP1 migra ligeiramente mais lento do que o IP 5 5pp-isômero de 7 de IP que é gerado pelo IP 6 K1. Uso de IP 6 padrões permitem uma quantificação mais fácil da concentração do IP purificada 7 (Figura 2B). Antes de usar sete IP para novas experiências, sua atividade biológica pode ser avaliada
(Figura 3). 5pp-IP 5 é incubada com VIP1 e com a fosfatase 7 IP DDP1 (diphosphoinositol phosphohydrolase polifosfato). Rotineiramente, o IP purificada sete é convertido para IP 8 por VIP1 e IP 6 por DDP1 (Figura 3).
Figura 1:. Coloração Toluidina de PAGE e isolamento da banda 7 IP A porção do gel contendo o padrão (IP 6) foi cortado e corado usando uma solução de azul de toluidina. As três bandas representam (de cima para baixo) IP 7, IP 6 e ATP. A parte manchada do gel foi, então, alinhado com o restante do gel. Isso permite que a localização da parte do gel contendo 7 IP, que pode então ser cortada e purificada (caixa tracejada).
Figura 2: Análise PAGE dos produtos de reacção IP 6 K1 e VIP1. A) Análise de IP 6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) pela coloração azul de toluidina foi utilizado para determinar a concentração de 7 IP purificadas de ambas 6 K1 IP (IP-5pp 5) e VIP1 (1/3PP-IP 5) reações. B) Dispersão análise para determinar a concentração do IP purificada 7. As concentrações foram determinadas de acordo com a intensidade da banda, calculado utilizando o software ImageJ, em comparação com quantidades pré-determinadas de 6 de IP. O eixo X representa intensidades, o eixo Y representa a concentração expressa em nmol.
Figura 3:. Análise da atividade 7 IP biológica Para determinar a qualidade do IP purificada sete nós incubadas 5pp-IP 5 (IP 6 IP K1 gerados 7) com VIP1 ou com a fosfatase 7 IP DDP1 e então resolvida a reação na página. A coloração DAPI e toluidina revelou a produção esperada de 8 por IP VIP1 ea conversão do IP 7 a 6 por IP DDP1.
Discussion
O uso de pirofosfato de inositol em bioquímica é severamente limitada pela indisponibilidade comercial de tais compostos ea pouca sensibilidade dos métodos de detecção existentes. A combinação de PAGE, que permite a separação de moléculas que possuem número diferente de grupos fosfato e Azul de Toluidina (Figura 1), um corante metacromática que se liga aos grupos fosfato, permite a fácil detecção de isoformas pyrophoshate inositol abrindo novos caminhos de pesquisa 20.
O uso da tecnologia descrita PAGE para purificar produtos pirofosfato inositol da reação enzimática realizada outby ou 6 IP K1 ou VIP1 é um método simples, econômico e confiável, que permite a produção de grandes quantidades de IP de alta qualidade 7. O método descrito acima não se limita à simples purificação do IP 7, mas pequenas modificações do protocolo descrito podem permitir a purificação de uma gama diferente de pirofosfatos inositol. Maior fosforilada isoformas pirofosfato inositol, contendo mais de oito grupos de fosfato pode ser detectada usando IP 7 ou diferentes quantidades de 6 IP como substrato 20,6. Estes pirofosfatos inositol pode ser detectado através do aumento da duração do processo de coloração e posteriormente purificada (seção 3.2). Além disso, o uso de 5 IP como substrato para a reação enzimática permitiria a purificação do PP-IP 5 e outras pirofosfatos inositol contendo um grupo hidroxila no anel inositol.
Em conclusão, este método permite pouco exigente para a purificação de confiança de quantidades miligrama de pirofosfatos inositol com instrumentos amplamente disponível, abrindo novos caminhos para esse campo de pesquisa emocionante.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a A. Riccio pelos comentários úteis e de ler o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa Médica de financiamento (MRC) para a Unidade de Biologia Celular e por um Human Frontier Ciência Grant Program (RGP0048/2009-C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 | |
| Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 | |
| ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 | |
| PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab | |
| Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 | |
| Temed | VWR | 43083G | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| SpeedVac | Christ | 100218 | |
| Gel apparatus | Hoeffer Scientific Instruments | SE600 | |
| Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 | |
| Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
References
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