Summary
一个孤立的肠系膜动脉的力测量的自动化myography方法描述。它采用一个Mulvany哈尔彭自动双丝肌动描记510A福林和钙，以确定响应。该方法允许等距反应一致，以激动剂决心在小血管的直径为60 - 300微米，独立。
Abstract
如肠系膜动脉的近端阻力血管，作出重大贡献的外周阻力。这些小血管的功能，主要是在指挥根据到身体的总体要求各个器官的血流量，直径100-400微米之间。大鼠肠系膜动脉的直径大于100微米的。贝文和奥谢尔2所提出的方法的基础上，首先由 1 Mulvay和哈尔彭所描述的，是myography技术。该技术提供等距条件下，大幅缩短的肌肉准备阻止的小型船只的信息。由于力的生产和船只不同受体激动剂的敏感性依赖于伸展的程度，按照积极紧张长度关系，这是必不可少的等距条件下进行收缩的研究，以防止符合安装电线。不锈钢丝是首选，因为后者的氧化，从而影响记录反应3钨丝，该技术允许安装船只激动剂诱导的收缩比较，以获取证据表明血管平滑肌细胞受体的正常功能。
在几项研究中，我们已经表明phenylyephrine承包的，孤立的肠系膜动脉累积浓度的钙（钙2 + E）除了放宽。结果导致我们得出结论，它表达的G蛋白偶联的Ca 2 +敏感受体（CAR），血管周围的感官神经，调解这个血管舒张反应。使用自动线myography方法，我们在这里展示，从只Wistar Dahl盐敏感（DS）和Dahl盐抵抗（DR）的肠系膜动脉的大鼠有不同的反应的Ca 2 + E 。从大鼠组织表现出更高的Ca 2 +敏感性相比，DR和DS。减少从DS大鼠肠系膜动脉车表达与减少的Ca 2 + E -诱导孤立的，承包前动脉松弛。数据表明，汽车是需要放宽增加肾上腺素基调下肠系膜动脉，在高血压发生，并表示在汽车的信号转导通路在达尔动物的固有缺陷，这是更为严重的DS。
肠系膜阻力动脉和类似的小血管和比较不同的受体激动剂和/或拮抗剂在确定血管反应性的体外的方法是有用的，可以很容易地和一贯的评估并排侧6,7,8。
Protocol
1。分离大鼠肠系膜小动脉
- 麻醉与异氟醚在一个封闭的腔的动物，并用酒精擦拭腹部。
- 执行行剖腹探查术中暴露肠系膜床。
- 用剪刀，除去约85厘米的肠道喂养与肠系膜上动脉血管。切割近端肠道部分接近幽门和末端回肠coecal交界附近。部分小肠被隔离的大鼠，深感麻醉与异氟醚和开胸心脏穿刺安乐死。
- 涂层的培养皿含PSS的菜摆在切除部分和肠系膜上动脉，在室温下进行清扫。
- 拖住右侧近端肠道和引脚intestineina反时针方向的其余部分（ieproximal远侧肠腔内的左喂养血管结束）。
- 解剖分支II和III段加上了一块近段。
- 解剖出的静脉和隔离动脉（V形分支点），清洁去除脂肪和结缔组织。用镊子轻轻拉动，并通过膜的结缔组织切割，避免直接接触与动脉。
2。安装的船只
- 切两短段的一个40微米的钨不锈钢丝（≈4厘米），并用细镊子，插入到每个照顾不损伤血管内皮细胞的动脉管腔之一。使用导线尖端打开管腔，如果必要的。血液流的船只是一个好兆头，管腔打开。
- 填写与生理盐溶液（PSS肌动描记室; MM：115氯化钠，碳酸氢钠，1.2 K 2 HPO 4，1.1 1.4 4.7氯化钾，硫酸镁4 .7 H 2 O，5 NA 2 HPO 4，1.0氯化钙 ，20 HEPES 5葡萄糖，pH值7.4与抗坏血酸（100μM））在37 ° C，使用镊子小心从培养皿转移螺纹血管段在室温室和转让切除近端血管段的肌动描记室和拉结束沿导线送入血管。避免伸展船只。
- 安全下连接到微米的右侧下颚附近的固定螺丝逆时针线附近结束。赶上与钳线自由端和安全远在右侧下颚固定螺丝顺时针。确保不作出任何颌骨本身联系的情况下，沿着电线的血管段位于颌骨之间的差距。
- 螺杆颌骨外，船只第二线平行对齐，插入远端管腔。轻轻送入血管段的管腔一个使用已安装的电线为指导的议案的电线。容纳约1厘米的容器，以避免拉伸过程中的回旋线，并避免接触血管内皮细胞。
- 螺杆颌骨和确保第二安装线下的第一个移动的右侧下颚担保。
- 保护下的传感器连接到左侧下颚附近的固定螺丝以顺时针方向第二线的近端。
- 下的左手颌骨上的固定螺丝固定电线的尽头，并拧紧拉伸导线。
- 一旦安装完成后，在“安装菜单”复位电机和船只开始正常化。
3。正常化
的自动双丝肌动描记系统- 510A有一个自动正常化的功能，这是从的“正常化”菜单评估，并允许船只被拉长到一个规范化的内部周长，标准化的程序为30分钟，平衡后根据制造商的协议37 ° C。指数曲线，然后安装到内部的圆周压力数据。该程序定义在体内有动脉时放松透了1 100毫米汞柱压力下，管腔直径（D 100）大鼠肠系膜动脉的正常化参数如下：
- 目标透压力= 13.3千帕（100毫米汞柱）。
- 时间= 60秒;每个正常化的步骤的持续时间。
- 芯片的1 / IC 100 = 0.9（IC 1 =正常化内部围，IC 100 =内部周长对应目标的压力。
- 目镜校正2 *Δ（毫米/眼师）; 2三角洲是编程的原因。
测量使用显微镜的目镜读数时细线远，近两端安装的船只SEGM安装肠系膜动脉的长度ENT。简单地说，安装的血管段的长度测量与校准眼眼片，在解剖镜下的最大放大倍率。阅读过远段结束（1）眼片的发线和眼师（2）段的近端测量和记录。这些值，用千分尺的读数，前后伸缩的船只被记录下来，并进入到程序的菜单来计算拟合曲线和相应的内部直径100毫米汞柱的目标透压力
在我们的研究中，动脉管腔直径D 1 = 0.9 XD 100，其中的积极力量的发展是最大的。大鼠肠系膜动脉≥10分钟的积极力量，在发展被认为是最佳的实验进行。较低的积极力量组织被丢弃。
4。测量的反应
正常化后，船只，机械和功能特性被重新激活，执行“标准开始”，其中包括与反复应用的苯肾上腺素（PE）5微米（一般为2或3）具有挑战性的船只获得重复性收缩。一个典型的“标准开始”在我们的实验室包括了一系列刺激如下冲刷时期：
- 替换肌动描记室盖和95％的空气和5％的CO 2开始曝气。
- 填写室与新鲜PSS的（含100μM的抗坏血酸）
- 合同船只5微米聚乙烯为5分钟，并与PSS的缓冲液洗4次。
- 经过最后一次洗涤，笔芯与PSS室，等待3分钟，然后重复步骤（二）及（iii）。
标准启动后，动脉为实验做好准备。评估累计此外氯化钙浓度的增加（0.5 - 4毫米）收缩血管的松弛。当使用抑制剂的船只前培养与肌动描记20分钟，目前在检测室的化合物。
5。数据分析
“正常化”船只和力量追查，直接转换成文本数据的数据进行了分析与SigmaPlot 11.0绘图程序（SYSTAT软件，点里士满，CA），并绘制成图1所示。浓度反应的数据，从描计算，分析，确定一个在程序药理菜单中的四个参数logistic函数拟合实验数据的EC 50值。组间和组内比较进行了方差分析（ANOVA），P <0.05被认为是显著的差异。
6。代表性的成果：
| 参数 | 只Wistar | Dahl盐敏感 | Dahl盐抗 |
|---|---|---|---|
| L 100（微米） | 83.26 ± 2.33 | 91.52 ± 4.67 | 117.45 ± 8.43 * |
| X 1 | 604.21 ± 41.97 | 752.24 ± 85.25 | 745.84 ± 110.09 |
| R 2 | 0.99 ± 0.003 | 0.97 ± 0.008 | 0.97 ± 0.007 |
* Wistar和DR L 100值之间的差异有统计学意义 。 夏皮罗-威尔克常态测试通过（P = 0.588）;通过平等方差检验（P = 0.237）。
L 100 =安装段对应的目标透压力内部直径。
× 1 =伸展式船只规范化的内部周长（即实验的千分尺读数值）所需的微定位设置。
R 2 =拟合回归系数（X I，Y I）指数曲线。
注：510A肌动描记器系统6手册中所描述的详细过程。
表1样本读出从“正常化菜单”中显示的基本程序只Wistar，DS和DR的肠系膜动脉段正常化参数。价值观是指（± SEM）的5只动物。 * L 100值之间的差异Wistar和DS统计学意义（P <0.05）。
| 只Wistar | 局副局长 | 议员 |
|---|---|---|
| 14.2 ± 0.6 | | 20.9 ± 1.3 * | |
表2。紧张局势（MN）在只Wistar，DS和DR大鼠分离的肠系膜动脉，以下5微米PE每艘船舶的申请。报告的值是指（± SEM）的6-8动物。 *显着不同只Wistar控制（P <0.05）。
图1的Ca 2 + E -诱导放宽承包的PE从Wistar大鼠肠系膜动脉安装在生理盐溶液中含1毫米的Ca 2 +在丝肌动描记。动脉30分钟的平衡，在37 ° C的恒定曝气反应的Ca 2 + E决定。代表队另外5微米PE累计增加钙的跟踪 +所示。
图2的Ca 2 + E -诱导放宽承包一个PE从DS大鼠肠系膜动脉安装在生理盐溶液中含1毫米的Ca 2 +在丝肌动描记。动脉30分钟的平衡，在37 ° C的恒定曝气反应的Ca 2 + E决定。代表队另外5微米PE累计增加钙的跟踪 +所示。的Ca 2 +松弛，严重损害这个组织相比，那些来自Wistar和DR大鼠。
图3的Ca 2 + E -诱导放宽承包的PE从DR大鼠肠系膜动脉安装在生理盐溶液中含1毫米的Ca 2 +在丝肌动描记。动脉平衡30分钟，在37 ° C的恒定曝气反应的Ca 2 + E determined.A代表力量追查另外5微米PE累计增加钙+所示。
图4。 A.的[Ca 2 +] E -响应曲线。条形图显示EC 50放松，通过数据拟合四个参数在DR和DS大鼠分离的肠系膜商场后勤curve.C.CaR表达确定的值。
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Discussion
高血压是心血管，脑和肾脏的发病率/死亡率的首要原因。高血压的发生是在人口高盐敏感性高血压是特别高，在人口老龄化，更多的黑人比白人流行。这被认为是由于对黑人的倾向保留在自己的肾脏 9钠。盐敏感性是肾脏疾病的一个主要因素，并与血管内皮功能障碍有关，但机制尚不完全清楚。在我们实验室最近的研究显示，高盐饮食可减少组织间液的Ca 2 +浓度（[Ca2 2 +]如果），并增加盐敏感大鼠 10,11的收缩压。这些影响可能是由于肠系膜动脉和kidneys.Finding类似减少汽车在盐敏感性高血压患者水平，以减少汽车的表达，可以提供一个新疗法的发展目标。从高血压的动物模型，我们一直在使用的自动线myography研究血管反应性的Ca 2 + E了解汽车在血管信号的机制与孤立的肠系膜动脉。
的[Ca 2 +] E是维持在一个狭窄的范围（1.1 - 1.4毫米）在人类12，因此，汽车必须能够探测到的[Ca 2 +] E受体激活就可以了微小的变化。事实上，汽车已检测到的微小变化，在Ca 2 + E 13，并在小增加的[Ca 2 +]如果在生理范围内 14的原位微透析技术的研究 ，测量的[Ca 2 + ]如果在十二指肠粘膜下和肾皮质，两个组织外周阻力和血压（BP）的监管非常重要，表明作为肠腔的Ca 2 +]功能的动态变化。增加肠道内的[Ca 2 +]从0到6毫米，增加的[Ca 2 +] 如果从1.1到1.9毫米4,5,15，这是在观察到激活血管周围神经的汽车 16的范围，并放宽隔离肠系膜动脉17。我们还表明，汽车检测跌幅的[Ca 2 +] e和增加动作电位时程，通过激活的非选择性阳离子通道，这反过来又削弱了释放的概率在 18个新皮层终端的影响。这表明，该车提供了突触前的反馈来改变大脑的兴奋性反应的Ca 2 + E 。此外，脱敏的PVN车出现反复的，长期的刺激 ，16，表明了解这种受体的调节，将澄清正常和高血压的条件下其作用。 Bukoski和他的同事发现，在小变化的[Ca 2 +]如果激活汽车和在正常条件下3,4.19，血管扩张合成做出贡献。根据这些意见，我们推测，这种反应也会增加血管张力的条件下发生高血压，因此可以被利用来控制血压。激活汽车的研究，以及如何导致磷酸化信号中间体，因此，需要探讨其在正常和高血压的生理作用。汽车是G蛋白偶联受体（GPCR）和其他GPCRs的通过类似的机制，这是常见的治疗靶点的监管。因此，了解血管及其调控机制将提供有用的数据，以确定其潜在的抗高血压治疗的目标。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
描述该项目奖号码R01 HL064761，R25 HL059868 1SC1 HL099139和P20 MD000175形式国立卫生研究院的支持。内容完全是作者的责任，并不一定代表国立卫生研究院的官方意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto Dual Wire Myograph System-510ADMT-USA, Inc. | Atlanta, GA. | 100151 | |
| PowerLab/4SP Data Acquisition System |  ADInstruments |
ML750 | New models with 4-16 input channels are available. |
| Dell Dimension XPS Gen 4 Computer | Dell | ||
| Stemi SV II (Apo) Dissection Microscope with Ocular | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Wistar, Dahl salt-sensitive, Dahl salt-resistant rats | Harlan Laboratories | ||
| Rodent chow | Harlan Laboratories | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Other chemicals | All chemicals used were of the purest grades available commercially. |
References
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