Summary
分離された腸間膜動脈における力測定のための自動化された筋運動記録法の方法が記載されている。それは、フェニレフリンと細胞外カルシウムに対する応答を決定するために510A Mulvany -ハルパーンオートデュアルワイヤーミオグラフを採用しています。 300μmの、独立して - 法は、60の直径の小さな血管のアゴニストに対する等尺性応答の一貫性のある決定を可能にする。
Abstract
このような腸間膜動脈などの近位抵抗血管は、末梢血管抵抗に大きく貢献する。主に身体の全体的な要件に応じて様々な臓器への血流を導くの直径の関数で100から400μmの間のこれらの小さな船。ラット腸間膜動脈は、100μmよりも大きい直径を有している。第一Mulvayとハルパーン1で説明した筋運動記録法の技術は、、ベヴァンとOsher 2で提案した方法に基づいていた。テクニックは、筋肉の準備の大幅な短縮が防止される等尺性条件下では小型船舶、に関する情報を提供します。別のアゴニストに対する血管の力の生産と感度はストレッチの程度に依存しているため、アクティブなテンションの長さの関係によれば、取付ワイヤーのコンプライアンスを防ぐために、等尺性条件下での収縮の研究を実施することが不可欠である。ステンレス鋼線があるため3。手法は血管平滑筋細胞の受容体の正常な機能のための証拠を得るためにマウントされている船のアゴニスト誘発性収縮の比較を可能にする記録された応答に影響を与える後者、の酸化タングステンワイヤに好まれます。
我々はphenylyephrineと契約している孤立した腸間膜動脈は外カルシウム（Ca 2 + E）の累積濃度を添加すると緩和するいくつかの研究で示されている。調査結果は、私たちは、Gタンパク質共役型のCa 2 +感知受容体（CAR）を発現しその血管周囲の感覚神経を、結論を導いた、この血管弛緩反応を媒介する。自動ワイヤマイオグラフィー法を用いて、我々は、ウィスター、ダール食塩感受性（DS）とDahl食塩抵抗性（DR）から腸間膜動脈は、ラットは、Ca 2 + eに異なる反応をすることここに示す。 Wistarラットから採取した組織は、DRとDSからのものに比べて高いのCa 2 + -感受性を示した。 DSラットから腸間膜動脈における減少CARの発現が減少するのCa 2隔離された、事前に契約動脈の+ 電子誘起緩和と相関する。データは、CARが増加アドレナリントーン下腸間膜動脈の弛緩のために必要とされることを示唆しているように高血圧に発生し、はるかに深刻なDSのであるダール動物におけるCARシグナル伝達経路に内在する欠陥を、示している。
方法は、腸間膜抵抗動脈の血管反応性のex vivoでの決定に有用であり、異なるアゴニストおよび/ またはアンタゴニストの間に同様の小血管との比較が容易にかつ一貫して横に並べて6,7,8を評価することができます。
Protocol
1。ラット腸間膜小動脈の分離
- 密閉チャンバーでイソフルランで動物を麻酔し、アルコールと腹部を拭いてください。
- 腸間膜床を公開するミッドライン開腹術を行います。
- はさみを使用して、上腸間膜動脈に血管系に供給すると腸の約85センチメートルを削除します。近い幽門に腸のセクションと回腸coecal接合部付近の遠位端の近位端をカット。腸のセグメントは、開胸心臓穿刺によるイソフルランと安楽死で深く麻酔したラットから分離されています。
- PSSを含むコーティングされたペトリ皿で摘出したセクションを配置し、室温で腸間膜動脈の解剖を行います。
- 右側の腸の近位端を突き止めるとintestineina反時計回りの方向（腸の遠い側の左送り血管系でieproximalエンド）の残りの部分をピン。
- 近位部の一部と一緒にブランチIIとIIIのセグメントをばらばらにする。
- 静脈を摘出し、動脈を分離（V字型の分岐点を持つ）と脂肪と結合組織を除去することによってそれをきれいに。鉗子で穏やかに引っ張ると結合組織の膜を介してカットすることで動脈との直接接触を避ける。
2。容器の取付け
- 細かい鉗子で、40μmのタングステン - フリーステンレス鋼線の二つの短いセグメント（≈4cm）をカットし、内皮を損傷しないように注意しながらそれぞれの動脈の内腔に1つを挿入。必要に応じて内腔を開くためにワイヤーの先端を使用してください。容器からのストリーミング血は良い兆候内腔が開いたときです。
- 115のNaCl、4.7 KClを、1.4のMgSO 4 · 7H 2 O、5のNaHCO 3、1.2 K 2 HPO 4、1.1のNa 2 HPO 4、1.0のCaCl 2、20 HEPESと：mMの、生理学的塩溶液（PSSでミオグラフ室を埋める37アスコルビン酸で5グルコース、pH7.4）中（100μM）° Cおよび鉗子を使用しては、慎重に、室温でチャンバにペトリ皿からスレッド血管のセグメントを転送し、ミオグラフ室に切除された近位血管のセグメントを転送し、プル容器にそれを供給する線に沿って終わり。容器をストレッチすることは避けてください。
- マイクロメーターに接続されている右側の顎に近い固定ネジの下に反時計回り線の近端を固定します。鉗子でワイヤの自由端をキャッチし、それが右の顎の遠固定ネジの下に時計回りに固定します。ワイヤーに沿って血管のセグメントは顎そのものとの接触を加えることなく、顎の間のギャップに位置していることを確認してください。
- 離れて顎をねじ込み、および容器2番目の線に平行に整列し、内腔の遠端に挿入します。優しくガイドとしてすでにマウントされているワイヤーを使用して1つのモーションで血管のセグメントの内腔を介してワイヤを養う。操作中にそれをストレッチ避けるために容器から約1cmワイヤーを保持しており、内皮細胞には触れないでください。
- 一緒に顎をねじ込み、最初の下に2つめの固定ワイヤの動きが右顎に固定していることを確認してください。
- トランスデューサーに接続されている左側の顎の近くに固定ネジ下時計回り方向の第2ワイヤの近端を固定します。
- 左側の顎に固定するネジの下に線の遠端を固定し、ワイヤーを伸ばして締めます。
- 取り付けが完了したら、"取り付けメニュー"のモーターをリセットし、血管の正常化を開始します。
3。正規化
オートデュアルワイヤーミオグラフシステム- 510Aは、"正規化"メニューから評価される自動化された正規化機能を備えていますし、容器が少なくとも30分間平衡後、製造元のプロトコールに従って標準化された手順によって正規化された内周に拡大することができます37℃指数曲線は、内周の圧力データに適合されます。手順は、動脈が100 mmHgの1の経壁圧の下でリラックスするときに生体内で持っていたとしているという血管径（D 100）を定義してラットの腸間膜動脈の正規化パラメータは次のとおりです。
- ターゲット経壁圧は= 13.3 kPa（100ミリメートルHg）。
- 時間= 60秒、正規化の各ステップの所要時間。
- IC 1 / IC 100 = 0.9（IC 1 =正規化された内周、IC100は目標圧力に対応する=内部円周。
- 接眼レンズのキャリブレーション2 *Δ（MM /眼部門）、2デルタは、プログラミング上の理由からです。
ヘアラインがマウントされている容器のSEGMの相手側とこちら側の端を超えている顕微鏡アイピースの測定値を使用してマウントされている腸間膜動脈の長さを測定ENT。簡単に言えば、マウントされている血管のセグメントの長さは、解剖顕微鏡でキャリブレーション眼アイピースと最大倍率で測定されます。セグメントの遠端（1）上の毛ラインとアイピースの読書と眼の部門のセグメントの近端は、（2）測定し、記録されています。これらの値は、マイクロメータの測定値と、前と容器を延伸後は記録され、近似曲線、100 mm Hgの目標経壁圧に対応する内径を計算するプログラムのためのメニューを締結
我々の研究では、動脈はアクティブ力の開発が最大となるD 1 = 0.9 XD 100の内腔直径に設定されていました。ラット腸間膜動脈における≥10分のアクティブな力の開発は続行する実験に最適と考えられている。下のアクティブな力を持つ組織は廃棄した。
4。応答の測定
正規化した後、容器の機械的および機能的特性は再現性の収縮を得るために5μMのフェニレフリン（PE）の反復塗布（通常は2または3）で挑戦的な船舶を含む"標準的なスタートを"、実行することによって再活性化される。次のように我々の研究室における典型的な"標準的なスタートは、"刺激とウォッシュアウト期間のシリーズで構成されています。
- ミオグラフ室カバーを交換し、95％空気および5％CO 2で通気を開始します。
- 新鮮なPSS（100μMのアスコルビン酸を含む）でチャンバーを埋める
- 5分間5μMのPEとの契約の容器とPSS緩衝液で4回洗浄する。
- 最後の洗浄後に、PSSとリフィルチャンバーとステップ（ii）及び（iii）を繰り返す前に3分を待ちます。
標準のスタート後、動脈は実験の準備ができています。契約船の緩和は、CaCl 2の濃度を増加させ（ - 4mMの0.5）の累積加算することによって評価されています。阻害薬が使用されている船舶はアッセイ中に20分と現在のためのミオグラフチャンバー内の化合物とプレインキュベートされています。
5。データ解析
船と力のトレーシング、直接テキストデータに変換するための"正規"のデータは、SigmaPlotの11.0グラフプログラム（SYSTATソフトウェア、ポイントリッチモンド、カリフォルニア州）で分析し、図1に示すようにプロットした。トレーシングから計算された濃度-応答データは、プログラムの薬理メニューの4つのパラメーターロジスティック関数にフィット実験データから、EC 50値を決定することにより分析した。グループ間およびグループ内の比較は、片道の分散分析（ANOVA）および p <0.05有意と考えているとの相違により実施した。
6。代表的な結果：
| パラメータ | ウィスター | ダール食塩感受性 | Dahl食塩抵抗性 |
|---|---|---|---|
| L 100（ミクロン） | 83.26 ± 2.33 | 91.52 ± 4.67 | 117.45 ± 8.43 * |
| X 1 | 604.21 ± 41.97 | 752.24 ± 85.25 | 745.84 ± 110.09 |
| R 2 | 0.99 ± 0.003 | 0.97 ± 0.008 | 0.97 ± 0.007 |
*ウィスターとDRのためのL 100の値の差は統計的に有意である。シャピロ-ウィルクの正規性検定は、（P = 0.588）に渡さ、等分散のテストは、（P = 0.237）に合格。
L 100ターゲット経壁圧に対応するマウントされているセグメントの=内径。
X 1 =その正規化された内周（実験が行われたときのマイクロメータの読み値のすなわち値）にマウントされている容器を伸ばすために必要なマイクロポジショナーの設定。
R 2指数曲線への適合のための=回帰係数（X I、Y i）の。
注意：手順の詳細は510Aミオグラフシステム6のマニュアルに記載されています。
表1サンプルリードアウト"正規のメニュー"に示すように基本的なプログラムからウィスター、DSとDRから腸間膜動脈セグメントのための正規化パラメータの。値は5匹の動物（± SEM）を意味しています。ウィスターとDS用L 100個の値の間に*の違いは（p <0.05）に統計的に有意である。
| ウィスター | DS | DR |
|---|---|---|
| 14.2 ± 0.6 | | 20.9 ± 1.3 * | |
それぞれの容器に5μMのPEのアプリケーションは、次のウィスター、DSとDRラットから分離された腸間膜動脈、 表2。開発緊張（MN）。報告された値は6-8匹の動物から（± SEM）を意味しています。 *ウィスターのコントロール（P <0.05）と有意に異なる。
1mMのCa 2 +を含む生理食塩水でワイヤーミオグラフにマウントされているのWistarラットからPE -契約腸間膜動脈の図1のCa 2 + の電子弛緩。動脈は、37℃で30分間平衡化したのCa 2に一定の通気と応答を持つ° C + Eに決定。 PEは、Ca 2の累積加算に続いて5μM+のほかにトレース代表的な力が示されています。
1mMのCa 2 +を含む生理食塩水でワイヤーミオグラフにマウントされているDSのラットからPE -契約腸間膜動脈の図2。Ca 2 +の 電子弛緩。動脈は、37℃で30分間平衡化したのCa 2に一定の通気と応答を持つ° C + Eに決定。 PEは、Ca 2の累積加算に続いて5μM+のほかにトレース代表的な力が示されています。 のCa 2 +緩和を厳しくウィスターとDRラットからのものと比べて、この組織に侵入された。
1mMのCa 2 +を含む生理食塩水でワイヤーミオグラフにマウントされているDRのラットからPE -契約腸間膜動脈の図3のCa 2 + の電子弛緩。動脈は、37℃で30分間平衡化した° C一定の通気とCa 2への応答と+ PEは、Ca 2の累積加算に続いて5μMを添加してトレースの電子 determined.A代表の力+が表示されます。
図4。 A. [Ca 2 +]の電子応答曲線。DRとDSラットから分離された腸間膜アーケードの4つのパラメータロジスティックcurve.C.CaR式にデータをフィッティングすることにより決定したリラクゼーションのためのEC 50値を示すB.バーチャート。
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Discussion
高血圧は、心血管脳、腎罹病率/死亡率の主要な原因です。高血圧症の発生は、人口が高く、食塩感受性高血圧は、人口の高齢化で特に高く、そして白人よりも黒人でより一般的です。これは、彼らの腎臓9にナトリウムを保持する黒人の傾向によると考えられる。塩感受性は腎臓病の主な要因であると内皮機能障害に関連付けられていますが、メカニズムは完全には理解されていない。我々の研究室における最近の研究では高塩食は、Ca 2 +濃度（[Ca 2 +]の場合 ）間質液を削減し、食塩感受性ラット10,11における収縮期圧を高めることが明らかになっている。これらの効果は、新たな治療法の開発のためのターゲットを提供することができる腸間膜動脈と食塩感受性高血圧患者におけるCARのレベルで同様の削減をkidneys.Findingの車の発現低下に起因することがあります。我々は自動車が血管系のシグナル伝達のメカニズムを理解するためのCa 2 + の電子を血管反応性を研究するために高血圧症の動物モデルの数から分離された腸間膜動脈で自動化された線の筋運動記録法を使用している。
の[Ca 2 +] 電子狭い範囲（1.1〜1.4 mm）以内に維持されるため、ヒトの12で、CARの[Ca 2 +] 電子受容体の活性化のために可能になるの小さな変化を検出できなければなりません。実際には、CARはCa 2 + E 13、とのわずかな増加の小さな変化を検出することが示されているの[Ca 2 +]生理的範囲14内であることをIF。測定現場マイクロダイアリシス研究での[Ca 2 +] IFの末梢血管抵抗と血圧（BP）の調節に欠かせない十二指腸粘膜下組織と腎皮質、二つの組織は、腸内腔の[Ca 2 +]の関数として動的な変化を示した。増加腸の[Ca 2 +] 0から6 mMに、増加の[Ca 2 +] 1.1から1.9血管周囲神経の車16をアクティブにするために観察される範囲内にあるmMの4,5,15、、へと分離された腸間膜をリラックスIF動脈17。我々はまた、車が[Ca 2 +] eの減少を検出し、順番に新皮質の端子18での放出確率に影響を減衰させる非選択的陽イオンチャネルの活性化を介して活動電位持続時間を増加させることが示されている。これは、CARは、Ca 2 + Eに反応して脳の興奮性を変更するシナプス前フィードバックを提供することを示唆している。また、PVNのCARの脱感作は、この受容体の調節の理解が正常と高血圧の両方の条件下でその役割を明確にすることを示唆し、繰り返し、長期刺激16で発生します。 Bukoskiと同僚が示されているその小さな変化の[Ca 2 +] CARを有効にして通常の状態3,4.19、下の血管拡張薬の合成に寄与するのに十分である場合 。これらの観察結果に基づき、我々は、高血圧で見られ、therefore血圧をコントロールするために悪用されることができるよう、この応答は増加も血管緊張の条件下で発生することを仮定する。 CARの活性化とどのようにこのリードシグナリング中間体のリン酸化への研究は、したがって、正常と高血圧生理における役割を調べるために必要です。 CARは、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）であり、一般的な治療標的である他のGPCRと同様のメカニズムを介して調節されている。したがって、血管にその調節機構を理解することが抗高血圧治療の標的としての可能性を判断するために有用なデータを提供します。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
説明されているプロジェクトは、アワード番号R01 HL064761、R25 HL059868、1SC1 HL099139と健康のP20 MD000175形国立研究所によってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto Dual Wire Myograph System-510ADMT-USA, Inc. | Atlanta, GA. | 100151 | |
| PowerLab/4SP Data Acquisition System |  ADInstruments |
ML750 | New models with 4-16 input channels are available. |
| Dell Dimension XPS Gen 4 Computer | Dell | ||
| Stemi SV II (Apo) Dissection Microscope with Ocular | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Wistar, Dahl salt-sensitive, Dahl salt-resistant rats | Harlan Laboratories | ||
| Rodent chow | Harlan Laboratories | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Other chemicals | All chemicals used were of the purest grades available commercially. |
References
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