Summary
Un metodo myography automatizzato per misure di forza in arterie mesenteriche isolato è descritto. Si avvale di un Mulvany-Halpern miografo filo doppio Auto 510A per determinare le risposte a fenilefrina e calcio extracellulare. Il metodo permette la determinazione costante di risposte isometrica per agonisti in piccoli vasi di diametro di 60-300 micron, in modo indipendente.
Abstract
Vasi di resistenza prossimale, come le arterie mesenteriche, contribuiscono in modo sostanziale alla resistenza periferica. Questi piccoli vasi compreso tra 100-400 micron di diametro principalmente in funzione dirigere il flusso del sangue ai vari organi a seconda delle esigenze generali del corpo. L'arteria mesenterica ratto ha un diametro maggiore di 100 micron. La tecnica myography, inizialmente descritto da Mulvay e Halpern 1, si è basata sul metodo proposto da Bevan e Osher 2. La tecnica fornisce informazioni su piccole imbarcazioni in condizioni isometriche, dove è impedito riduzione sostanziale della preparazione muscolare. Dal momento che la produzione di forza e la sensibilità dei vasi di diversi agonisti dipende il grado di allungare, in base alle attivo tensione-lunghezza relazione, è essenziale per condurre studi in condizioni di contrazione isometrica per evitare che la conformità dei fili di montaggio. Fili di acciaio inossidabile sono preferibili ai fili di tungsteno a causa dell'ossidazione di quest'ultima, che colpisce le risposte registrate 3. La tecnica consente il raffronto di agonista-indotto le contrazioni dei vasi montati per ottenere elementi per la normale funzione dei recettori della muscolatura liscia vascolare delle cellule.
Abbiamo dimostrato in diversi studi che isolate le arterie mesenteriche che sono contratte con phenylyephrine rilassarsi dopo l'aggiunta delle concentrazioni cumulative di calcio extracellulare (Ca 2 + e). I risultati ci hanno portato a concludere che i nervi sensoriali perivascolare, che esprimono il G protein-coupled Ca 2 + recettore sensibile (CaR), mediare questa risposta vasodilatazione. Utilizzando un metodo automatizzato myography filo, mostriamo qui che le arterie mesenteriche da Wistar, Dahl sensibili al sale (DS) e Dahl resistenti al sale (DR) ratti rispondono in modo diverso a Ca 2 + e. I tessuti di ratti Wistar hanno mostrato maggiore Ca 2 +-sensibilità rispetto a quelli di DR e DS. Espressione CaR ridotto nelle arterie mesenteriche da ratti DS correla con ridotta Ca 2 + e-indotta di rilassamento isolato, pre-contratto arterie. I dati suggeriscono che l'auto è richiesto per il rilassamento delle arterie mesenteriche sotto tono adrenergico aumentato, come avviene nella ipertensione, e indicano un difetto nella via di segnalazione CaR negli animali Dahl, che è molto più grave nei DS.
Il metodo è utile per determinare la reattività vascolare ex vivo nelle arterie di resistenza mesenteriche e simili piccoli vasi sanguigni e confronti tra agonisti e / o antagonisti possono essere facilmente e costantemente valutati fianco a fianco 6,7,8.
Protocol
1. Isolamento di arteria mesenterica piccolo ratto
- Anestetizzare animali con isoflurano in una camera chiusa e pulire l'addome con l'alcol.
- Eseguire una linea mediana laparotomia per esporre letto mesenterica.
- Utilizzando le forbici, rimuovere circa 85 cm di intestino con l'alimentazione vasi con l'arteria mesenterica superiore. Tagliare l'estremità prossimale della sezione intestinale vicino al piloro e la fine distale vicino alla giunzione ileo-coecal. Segmenti dell'intestino sono isolati da topi che sono profondamente anestetizzati con isoflurano e eutanasia da open-torace puntura cardiaca.
- Situato sezione asportato in un piatto rivestito di Petri contenente PSS ed eseguire la dissezione dell'arteria mesenterica a temperatura ambiente.
- Fissare l'estremità prossimale dell'intestino sul lato destro e pin out il resto del senso antiorario intestineina (fine ieproximal sul sistema vascolare alimentazione sinistra dall'altra parte dell'intestino).
- Sezionare il ramo II e III segmenti insieme con un pezzo del segmento prossimale.
- Sezionare la vena e isolare l'arteria (con a forma di V punto di diramazione) e pulirlo, rimuovendo il tessuto connettivo e adiposo. Evitare il contatto diretto con l'arteria tirando delicatamente con una pinza e taglio attraverso la membrana del tessuto connettivo.
2. Montaggio della nave
- Tagliate due segmenti brevi (≈ 4 cm) di 40 micron di tungsteno senza filo di acciaio inossidabile e, con una pinza sottile, inserire uno nel lume di ogni arteria facendo attenzione a non danneggiare l'endotelio. Utilizzare la punta del filo per aprire il lume, se necessario. Grondante di sangue fuori dal vaso è un buon segno il lume è aperto.
- Riempire la camera miografo con soluzione salina fisiologica (PSS; mM: 115 NaCl, 4.7 KCl, 1,4 MgSO 4 0,7 H 2 O, 5 NaHCO 3, 1,2 K 2 HPO 4, 1,1 Na 2 HPO 4, 1,0 CaCl 2, 20 e HEPES 5 glucosio, pH 7,4) con l'acido ascorbico (100 mM) a 37 ° C e con pinze trasferire accuratamente l'segmento filettato nave dalla capsula di Petri nella camera a temperatura ambiente e trasferire il segmento asportato nave prossimale alla camera miografo e tirare la finale lungo il cavo di alimentazione in vaso. Evitare allungamento della nave.
- Fissare la fine vicina del filo in senso antiorario con la vite di fissaggio vicino sulla destra mascella collegato al micrometro. Prendere l'estremità libera del filo con una pinza e sicuro in senso orario sotto la vite di fissaggio molto sulla destra della mandibola. Assicurarsi che il segmento nave lungo il filo si trova nello spazio tra le fauci senza alcun contatto con la stessa mascella.
- Avvitare le mascelle a parte, e allineare la seconda parallela filo con la nave e inserirlo nel fondo del lume. Delicatamente il filo di alimentazione attraverso il lume del segmento di vaso in un unico movimento con il filo già montato come una guida. Tenere il filo di circa 1 cm dalla nave per evitare che si estende durante la manovra, ed evitare di toccare l'endotelio.
- Avvitare le mascelle insieme e garantire che si muove secondo filo di montaggio sotto il primo fissato sulla destra della mandibola.
- Fissare la fine vicina del secondo filo in senso orario, sotto la vite di fissaggio vicino di sinistra mascella collegato al trasduttore.
- Fissare l'estremità del filo sotto la vite di fissaggio sulla mascella a sinistra e stringere per allungare il filo.
- Una volta che il montaggio è completo, ripristinare il motore nel "Menù di montaggio" e avviare la normalizzazione della nave.
3. Normalizzazione
Il Dual miografo Wire Auto System-510A ha una funzione automatica di normalizzazione, che è valutato dal menu "normalizzazione" e permette alla barca di essere allungato per una circonferenza normalizzato interno da una procedura standardizzata secondo il protocollo del produttore dopo equilibrazione per 30 minuti a 37 ° C. Una curva esponenziale è poi sistemare i dati di pressione interna circonferenza. La procedura definisce il diametro del lume (d 100) che l'arteria avrebbe avuto in vivo quando rilassato e sotto una pressione transmurale di 100 mmHg 1 La normalizzazione dei parametri per l'arteria mesenterica topo sono come segue.
- Pressione transmurale obiettivo = 13,3 kPa (100 mm Hg).
- Tempo = 60 sec; Durata di ciascuna delle fasi normalizzazione.
- IC 1 / IC 100 = 0.9 (IC 1 = circonferenza interna normalizzato, IC 100 = circonferenza interna corrispondente alla pressione di destinazione.
- Calibrazione oculare 2 * Δ (mm / oculare divisione), 2 delta è per ragioni di programmazione.
Misurare la lunghezza dell'arteria mesenterica montata usando l'oculare letture microscopio quando i filetti sono oltre le estremità vicine e lontane del segm nave montataent. In breve, la lunghezza del segmento di vaso montato è misurata al massimo ingrandimento di un oculare calibrato oculare del microscopio dissezione. L'oculare di lettura con i capelli-line sul fondo del segmento (a 1) e la fine vicina del segmento (a 2) nelle divisioni oculari sono misurati e registrati. Questi valori, con le letture micrometro, prima e dopo l'allungamento della nave vengono registrati e inseriti nel menu del programma per calcolare la curva arredata e il diametro interno corrispondente alla pressione transmurale obiettivo di 100 mm Hg
Nei nostri studi, le arterie sono stati fissati per il diametro del lume di d 1 = 0,9 xd 100, dove lo sviluppo forza attiva è massima. Sviluppo della forza attiva di ≥ 10 mN nelle arterie mesenteriche ratto è considerato ottimale per gli esperimenti di procedere. Tessuti con minore forza attiva sono stati scartati.
4. Misurazione di risposte
Dopo la normalizzazione, le proprietà meccaniche e funzionali dei vasi sono riattivate eseguendo un "avvio standard", che coinvolge vasi impegnativo con ripetute applicazioni (in genere 2 o 3) su 5 fenilefrina mM (PE) per ottenere contrazioni riproducibile. Un tipico "start standard" nel nostro laboratorio è costituito da una serie di stimoli e di periodi di washout come segue:
- Sostituire camera miografo coperchio e iniziare aerazione con il 95% di aria e il 5% di CO 2.
- Riempire da camera con PSS fresca (contenente 100 mM acido ascorbico)
- Nave contratto con mM PE 5 per 5 minuti e lavare 4 volte con tampone PSS.
- Dopo l'ultimo lavaggio, camera ricarica con PSS ed attendere 3 minuti prima di ripetere passi (ii) e (iii).
Dopo l'avvio standard, l'arteria è pronto per l'esperimento. Rilassamento dei vasi contratto sono valutati da oltre cumulativo di concentrazioni crescenti di CaCl 2 (0,5 - 4 mm). Navi quando inibitori sono utilizzati sono pre-incubate con i composti nella camera miografo per 20 minuti e presente durante il test.
5. Analisi dei dati
La "normalizzazione" dei dati per le navi e tracciati forza, direttamente convertiti in dati di testo, sono stati analizzati con il 11,0 SigmaPlot grafico del programma (SYSTAT Software, Point Richmond, CA) e tracciati, come mostrato nella Figura 1. Dati concentrazione-risposta, calcolato dal tracciato, sono state analizzate determinando CE 50 valori da dati sperimentali montato su un quattro parametro della funzione logistica nel menu di Farmacologia del programma. I confronti tra i gruppi e all'interno dei gruppi sono stati eseguiti da una analisi della varianza (ANOVA) e le differenze con p 0.05 <sono considerati significativi.
6. Rappresentante dei risultati:
| Parametri | Wistar | Dahl sensibili al sale | Dahl resistenti al sale |
|---|---|---|---|
| L 100 (micron) | 83,26 ± 2,33 | 91,52 ± 4,67 | 117,45 ± 8,43 * |
| X 1 | 604,21 ± 41,97 | 752,24 ± 85,25 | 745,84 ± 110,09 |
| r 2 | 0,99 ± 0,003 | 0,97 ± 0,008 | 0,97 ± 0,007 |
* La differenza tra i valori di L 100 del Wistar e DR sono statisticamente significative. Shapiro-Wilk Test di normalità passato (p = 0,588); test varianza pari passato (p = 0,237).
L 100 = diametro interno del segmento montato corrispondente alla pressione transmurale bersaglio.
X 1 = L'impostazione posizionatore micro necessari per allungare la nave montati al suo interno circonferenza normalizzato (ovvero il valore della lettura micrometro al quale sono stati eseguiti esperimenti).
r 2 = coefficiente di regressione per eccesso di (X i, Y i) una curva esponenziale.
NB: La procedura dettagliata è descritta nel manuale per il sistema 510A miografo 6.
Tabella 1. Esempio di lettura dei parametri di normalizzazione per i segmenti di arteria mesenterica da Wistar, DS e DR da programma base indicato nel "Menù normalizzazione". I valori sono medie (± SEM) di 5 animali. * Le differenze tra i valori di L 100 del Wistar e DS sono statisticamente significativi (p <0,05).
| Wistar | DS | DR |
|---|---|---|
| 14,2 ± 0,6 | | 20,9 ± 1,3 * | |
Tabella 2. Tensioni sviluppati (MN), in arterie mesenteriche isolato dal Wistar, DS e ratti DR, in seguito alle domande su 5 mM PE per ogni nave. Valori riportati sono mezzi (± SEM) di 6-8 animali. * Significativamente diversi dai controlli Wistar (p <0,05).
Figura 1. Ca 2 + e-indotta relax di un PE-contratto dell'arteria mesenterica da un ratto Wistar montato in una miografo filo in soluzione salina fisiologica contenente 1 mM Ca 2 +. L'arteria è stata equilibrata per 30 minuti a 37 ° C con aerazione costante e risposte a Ca 2 + e determinato. Una forza rappresentativa tracciamento con l'aggiunta di 5 micron PE seguita da aggiunte cumulativo di Ca 2 + è mostrato.
Figura 2. Ca 2 + e-indotta relax di un PE-contratto dell'arteria mesenterica da un topo DS montato in una miografo filo in soluzione salina fisiologica contenente 1 mM Ca 2 +. L'arteria è stata equilibrata per 30 minuti a 37 ° C con aerazione costante e risposte a Ca 2 + e determinato. Una forza rappresentativa tracciamento con l'aggiunta di 5 micron PE seguita da aggiunte cumulativo di Ca 2 + è mostrato. Ca 2 + il relax è stata gravemente compromessa in questo tessuto rispetto a quelli di ratti Wistar e DR.
Figura 3. Ca 2 + e-indotta relax di un PE-contratto dell'arteria mesenterica da un topo DR montato in una miografo filo in soluzione salina fisiologica contenente 1 mM Ca 2 +. L'arteria è stata equilibrata per 30 minuti a 37 ° C con aerazione costante e risposte a Ca 2 + e determined.A forza di riferimento analisi su aggiunta di 5 mM PE seguita da aggiunte cumulativo di Ca 2 + è mostrato.
Figura 4. A. [Ca 2 +] e curve di risposta. Grafico a barre che mostra B. CE 50 valori per il relax determinata inserendo i dati di un'espressione quattro curve.C.CaR parametri logistici nelle sale giochi mesenterica isolati da topi DR e DS.
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Discussion
L'ipertensione è una delle principali cause di morbilità cardiovascolare, cerebrale e renale / mortalità. L'incidenza di ipertensione è alta nella popolazione e sensibili al sale ipertensione è particolarmente elevato nella popolazione, e più frequente nei neri rispetto ai bianchi. Questo si ritiene sia dovuta alla tendenza dei neri a trattenere sodio nei reni 9. Sale-sensibilità è un fattore importante che contribuisce alla malattia renale ed è associata a disfunzione endoteliale, ma il meccanismo non è completamente nota. Recenti studi nel nostro laboratorio hanno rivelato che le diete di sale ridurre liquido interstiziale Ca 2 + concentrazione ([Ca 2 +] SE), e aumento della pressione sistolica di sale-sensibile ratti 10,11. Questi effetti possono essere attribuiti a ridotta espressione di automobili in arterie mesenteriche e kidneys.Finding riduzioni simili nei livelli di auto in pazienti ipertesi sensibili al sale potrebbe fornire un bersaglio per lo sviluppo di nuove terapie. Abbiamo utilizzato il myography automatizzati filo con isolati arterie mesenteriche da una serie di modelli animali di ipertensione per studiare la reattività vascolare a Ca 2 + e di capire il meccanismo di CaR segnalazione nel sistema vascolare.
[Ca 2 +] e viene mantenuta in un intervallo ristretto (1,1 - 1,4 mm) negli esseri umani 12, quindi la vettura deve essere in grado di rilevare piccole variazioni [Ca 2 +] e per l'attivazione dei recettori sia possibile. Infatti, la vettura ha dimostrato di poter individuare piccoli cambiamenti di Ca 2 + e 13, e piccoli aumenti di [Ca 2 +] SE che sono all'interno del range fisiologico 14. Negli studi di microdialisi in situ di misura [Ca 2 +] SE nel sottomucosa duodenale e reni corteccia, due tessuti che sono essenziali per la regolazione della resistenza periferica e della pressione sanguigna (BP), ha mostrato cambiamenti dinamici in funzione del lume intestinale [Ca 2 +]. Aumentando nell'intestino [Ca 2 +] da 0 a 6 mm, ha aumentato la [Ca 2 +] SE 1,1-1,9 mM 4,5,15, che si trova nel range osservato per attivare il CaR nervose perivascolari 16, e rilassarsi mesenterica isolata arterie 17. Abbiamo anche dimostrato che la vettura rileva diminuzioni [Ca 2 +] e e aumentare la durata del potenziale d'azione attraverso l'attivazione del canale non selettivo zione, che a sua volta attenua l'impatto sulla probabilità di distacco presso i terminali neocorticale 18. Questo suggerisce che la vettura offre pre-sinaptica feedback per alterare l'eccitabilità del cervello in risposta a Ca 2 + e. Inoltre, desensibilizzazione del CaR PVN si verifica con ripetuti, la stimolazione prolungata 16, suggerendo che la comprensione del regolamento di questo recettore chiarirà il suo ruolo sia in condizioni normali e ipertesi. Bukoski e colleghi hanno dimostrato che piccole variazioni [Ca 2 +] SE sono sufficienti per attivare il CaR e contribuire alla sintesi vasodilatatore in condizioni normali 3,4.19,. Sulla base di queste osservazioni, abbiamo postulato che questa risposta si verifica anche in condizioni di aumentato tono vascolare come si vede nella ipertensione e può quindi essere sfruttato per controllare la pressione sanguigna. Lo studio di attivazione CaR e come questo porta alla fosforilazione di intermedi di segnalazione è, quindi, necessaria per sondare il suo ruolo nella fisiologia normale e ipertesi. L'auto è G protein-coupled recettore (GPCR) ed è regolata attraverso meccanismi simili a quelli di altri GPCR, che sono comuni bersagli terapeutici. Pertanto, la comprensione dei meccanismi della sua regolazione nei vasi sanguigni fornirà dati utili per determinare il suo potenziale come bersaglio per la terapia anti-ipertensiva.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il progetto descritto è stato sostenuto da numeri Premio HL064761 R01, R25 HL059868, 1SC1 HL099139 e P20 MD000175 forma National Institutes of Health. I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto Dual Wire Myograph System-510ADMT-USA, Inc. | Atlanta, GA. | 100151 | |
| PowerLab/4SP Data Acquisition System |  ADInstruments |
ML750 | New models with 4-16 input channels are available. |
| Dell Dimension XPS Gen 4 Computer | Dell | ||
| Stemi SV II (Apo) Dissection Microscope with Ocular | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Wistar, Dahl salt-sensitive, Dahl salt-resistant rats | Harlan Laboratories | ||
| Rodent chow | Harlan Laboratories | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Other chemicals | All chemicals used were of the purest grades available commercially. |
References
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
- Mulvany, M. J. Procedures for investigating of small vessels using small vessel myograph. DMT Danish Myo Technology. , (2004).
- Angus, J. A., Wright, C. E. Techniques to study the pharmacodynamics of isolated large and small blood vessels. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 44, 395-407 (2000).
- Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels. J. Physiol. 275, 85-101 (1978).
- Lindhorst, J., Alexander, N., Blignaut, J., Rayner, B. Differences in hypertension between blacks and whites: an overview. Cardiovasc. J. Afr. 18, 241-247 (2007).
- Eley, S. L., Allen, C. M., Williams, C. L., Bukosi, R. D., Pointer, M. A. Action of thiazide on renal interstitial calcium. Am. J. Hypertens. 21, 814-819 (2008).
- Palmer, C. E., Rudd, M. A., Bujoski, R. D. Renal interstitial Ca2+ during sodium loading of normotensive and Dal-salt hypertensive rats. Am. J. Hypertens. 16, 771-776 (2003).
- Hurwitz, S. Homeostatic control of plasma calcium concentration. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 31, 41-100 (1996).
- Brown, E. M., MacLeod, R. J. Extracellular sensing and extracellular calcium signaling. Physiol. Rev. 81, 239-297 (2001).
- Breitwieser, G. E. Extracellular calcium as an integrator of tissue function. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40, 1467-1480 (2008).
- Mupanomunda, M. M., Wang, Y., Bukoski, R. D. Effect of chronic sensory denervation on Ca2+-induced relaxation of isolated mesenteric resistance arteries. Am. J. Physiol. 274, 1655-1661 (1998).
- Mupanomunda, M. M., Ishioka, N., Bukoski, R. D. Interstitial Ca2+ undergoes dynamic changes sufficient to stimulate nerve-dependent Ca2+-induced relaxation. Am. J. Physiol. 276, 1035-1042 (1999).
- Mupanomunda, M. M., Tian, B., Ishioka, N., Bukoski, R. D.
- Awumey, E. M., Hill, S. K., Diz, D. I., Bukoski, R. D. Cytochrome P-450 metabolites of 2-arachidonoylglycerol play a role in Ca2+-induced relaxation of rat mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2363-2370 (2008).
- Chen, W., Bergsman, J. B., Wang, X., Gilkey, G., Pierpoint, C. R., Daniel, E. A., Awumey, E. M., Dauban, P., Dodd, R. H., Ruat, M., Smith, S. M. Presynaptic external calcium signaling involves the calcium-sensing receptor in neocortical nerve terminals. PloS One. 5, e8563-e8563 (2010).
- Bukoski, R. D. The perivascular sensory nerve Ca2+ receptor and blood pressure regulation: a hypothesis. Am. J. Hypertens. 11, 1117-1123 (1998).
- Bukoski, R. D. Dietary Ca2+ and blood pressure: evidence that Ca2+-sensing receptor activated sensory nerve dilator activity couples changes in interstitial Ca2+ with vascular. 16, 218-221 (2001).
