Summary
Um método automatizado para medições Miografia vigor em artérias mesentéricas isoladas é descrito. Ele emprega um Mulvany-Halpern Auto Myograph fio duplo 510A para determinar as respostas à fenilefrina e cálcio extracelular. O método permite a determinação consistente de respostas isométrica aos agonistas em pequenos vasos de diâmetros de 60 - 300 mm, de forma independente.
Abstract
Vasos de resistência proximal, tais como as artérias mesentéricas, contribuem substancialmente para a resistência periférica. Esses pequenos vasos entre 100-400 mM em função de diâmetro principalmente no direcionamento do fluxo de sangue para vários órgãos de acordo com os requisitos gerais do corpo. A artéria mesentérica de ratos tem um diâmetro superior a 100 mm. A técnica Miografia, primeiramente descrita por Mulvay e Halpern 1, foi baseada no método proposto por Bevan e Osher 2. A técnica fornece informações sobre navios de pequeno porte em condições isométricas, onde o encurtamento substancial da preparação muscular é impedida. Desde produção de força e sensibilidade de navios para diferentes agonistas é dependente da extensão do trecho, de acordo com a relação tensão-comprimento ativo, é essencial a realização de estudos de contração isométrica em condições para impedir o cumprimento dos fios de montagem. Fios de aço inoxidável são preferíveis aos fios de tungstênio por causa da oxidação deste último, que afeta as respostas registradas 3. A técnica permite a comparação de agonista-induzida contrações dos vasos montados para obter provas para a função normal de receptores vascular das células musculares lisas.
Temos demonstrado em vários estudos que artérias mesentéricas isoladas que são contratados com phenylyephrine relaxar com a adição de concentrações cumulativas de cálcio extracelular (Ca 2 + e). As descobertas levaram-nos a concluir que os nervos sensoriais perivascular, que expressam a proteína G acoplada Ca 2 + receptor-sensing (CaR), mediar esta resposta vasorelaxamento. Utilizando um método automatizado Miografia fio, mostramos aqui que artérias mesentéricas de Wistar, Dahl sensíveis ao sal (DS) e Dahl sal-resistentes (DR) ratos respondem diferentemente ao Ca 2 + e. Tecidos de ratos Wistar mostrou Ca 2 + maior sensibilidade em comparação com os de DR e DS. CaR expressão reduzida em artérias mesentéricas de ratos DS correlaciona-se com Ca 2 + reduzida de relaxamento e-induzida de isoladas, pré-contraídos artérias. Os dados sugerem que o carro é necessário para o relaxamento das artérias mesentérica sob tônus adrenérgico aumentado, como ocorre na hipertensão, e indicar um defeito inerente na via de sinalização CaR em animais Dahl, que é muito mais grave no DS.
O método é útil para determinar a reatividade vascular ex vivo nas artérias mesentéricas de resistência e similares pequenos vasos sanguíneos e comparações entre diferentes agonistas e / ou antagonistas podem ser facilmente e constantemente avaliada lado a lado 6,7,8.
Protocol
1. Isolamento da artéria mesentérica de ratos pequenos
- Anestesiar animais com isoflurano em uma câmara fechada e limpe o abdômen com álcool.
- Realizar uma laparotomia na linha média para expor cama mesentérica.
- Com uma tesoura, retire cerca de 85 cm de intestino com a alimentação vasculatura com a artéria mesentérica superior. Corte a extremidade proximal da seção intestinal perto do piloro e da extremidade distal perto da junção íleo-coecal. Segmentos do intestino são isolados de ratos que estão profundamente anestesiados com isoflurano e submetidos à eutanásia por open-peito punção cardíaca.
- Colocado seção extirpado numa placa de Petri revestidas contendo PSS e realizar a dissecção da artéria mesentérica em temperatura ambiente.
- Pino para baixo a extremidade proximal do intestino no lado direito e pinos para fora o restante da direção intestineina sentido anti-horário (final ieproximal sobre a vasculatura alimentação deixou do outro lado do intestino).
- Dissecar o ramo II e III segmentos juntos com um pedaço do segmento proximal.
- Dissecar a veia e isolar a artéria (com V-shaped ponto de ramificação) e limpá-la através da remoção do tecido adiposo e conjuntivo. Evitar o contato direto com a artéria puxando delicadamente com uma pinça e corte através da membrana do tecido conjuntivo.
2. Montagem do navio
- Corte dois pequenos segmentos (≈ 4 cm) de um 40 mM de tungstênio sem fio de aço inoxidável e, com uma pinça fina, insira um para o lúmen de cada artéria tomando cuidado para não danificar o endotélio. Use a ponta do fio para abrir a luz, se necessário. Sangue escorrendo para fora da embarcação é um bom sinal o lúmen é aberto.
- Encha a câmara myograph com solução salina fisiológica (PSS; mM: 115 NaCl, 4,7 KCl, 1,4 MgSO 4 .7 H 2 O, 5 NaHCO 3, 1,2 K 2 HPO 4, 1,1 Na 2 HPO 4, 1,0 CaCl 2, 20 e HEPES 5 de glicose, pH 7,4) com ácido ascórbico (100 mM) a 37 ° C e usando fórceps transferir cuidadosamente o segmento de rosca navio da placa de Petri na câmara à temperatura ambiente e transferir o segmento navio excisadas proximal para a câmara de myograph e puxe a final ao longo do fio para alimentá-lo dentro do vaso. Evitar esticar o navio.
- Garantir o fim próximo do fio de sentido anti-horário sob o parafuso de fixação perto na mandíbula do lado direito ligado ao micrômetro. Pegar a extremidade livre do fio com uma pinça e prenda-o no sentido horário sob o parafuso de fixação muito na mandíbula do lado direito. Certifique-se que o segmento de navios ao longo do fio está situado no intervalo entre as mandíbulas sem fazer qualquer contato com a própria mandíbula.
- Parafuso as mandíbulas separadas, e alinhar o segundo fio paralelo com o navio e inseri-lo na extremidade da luz. Suavemente alimentar o fio através do lúmen do segmento de navio em um movimento usando o fio já está montado como um guia. Segure o fio cerca de 1 cm do navio para evitar esticar-la durante a manobra e evite tocar o endotélio.
- Parafuso as mandíbulas juntas e garantir que o segundo move fio debaixo de montagem o primeiro garantido na mandíbula do lado direito.
- Garantir o fim próximo do segundo fio no sentido horário sob o parafuso de fixação perto da mandíbula do lado esquerdo ligado ao transdutor.
- Assegurar a extremidade do fio sob o parafuso de fixação na mandíbula do lado esquerdo e aperte para esticar o fio.
- Uma vez que a montagem está completa, reinicie o motor no "Menu de montagem" e começar a normalização do navio.
3. Normalização
O Auto Myograph fio duplo System-510A tem uma função de normalização automatizado, que é avaliada a partir da "normalização" no menu e permite que o navio a ser esticado a uma circunferência normalizado interna por um procedimento padronizado de acordo com o protocolo do fabricante, após equilíbrio por 30 min a 37 ° C. Uma curva exponencial é então ajustada aos dados de pressão interna circunferência. O procedimento define o diâmetro do lúmen (d 100) que a artéria teria in vivo quando relaxado e sob uma pressão transmural de 100 mmHg 1 Os parâmetros de normalização para artéria mesentérica de ratos são as seguintes.:
- Pressão transmural alvo = 13,3 kPa (100 mm Hg).
- Tempo = 60 seg; Duração de cada uma das etapas de normalização.
- IC 1 / IC 100 = 0,9 (IC 1 = circunferência normalizado interna, IC 100 = circunferência interna correspondente à pressão alvo.
- Calibração ocular 2 * Δ (mm / ocular divisão); 2 delta é por razões de programação.
Meça o comprimento da artéria mesentérica montado usando o microscópio de olho peça leituras quando os fios são mais as extremidades longe e de perto do navio montado segment. Resumidamente, o comprimento do segmento de navio montada é medida a ampliação máxima com uma ocular calibrada olho peças no microscópio de dissecação. A leitura do olho peças com cabelo-line sobre a extremidade do segmento (a 1) e perto do final do segmento (a 2) nas divisões ocular são medidos e registados. Estes valores, com as leituras micrômetro, antes e após o alongamento da embarcação são registrados e entrou em menus para o programa para calcular a curva ajustada eo diâmetro interno correspondente à uma meta de pressão transmural de 100 mm Hg
Em nossos estudos, as artérias foram criados para o diâmetro do lúmen do d 1 = 0,9 xd 100, onde o desenvolvimento força ativa é máxima. Desenvolvimento da força ativa de ≥ 10 mN em artérias mesentéricas de ratos é considerada ideal para experimentos para prosseguir. Tecidos com menor força ativa foram descartados.
4. Medição de respostas
Após a normalização, as propriedades mecânicas e funcionais dos vasos são re-ativado por realizar uma "start-padrão", que envolve vasos desafiador, com aplicações repetidas (normalmente 2 ou 3) de 5 mM de fenilefrina (PE) para obter contrações reprodutível. A "start padrão" típico em nosso laboratório consiste de uma série de estímulos e os períodos de washout da seguinte forma:
- Substituir câmara myograph cobrir e começar a aeração com ar de 95% e 5% CO 2.
- Encher a câmara com PSS fresco (ácido ascórbico, contendo 100 mM)
- Navio contrato com 5 mM PE por 5 min e lavar 4 vezes com tampão de PSS.
- Após a última lavagem, recarga com câmara de PSS e esperar 3 min antes de repetir os passos (ii) e (iii).
Após o início padrão, a artéria está pronto para o experimento. Relaxamento dos vasos contratados são avaliados pela adição cumulativa de concentrações crescentes de CaCl 2 (0,5-4 mM). Embarcações, quando os inibidores são usados são pré-incubadas com os compostos na câmara myograph por 20 min e presente durante os ensaios.
5. Análise de Dados
A "normalização" dos dados para os navios e os traçados força, diretamente convertido em dados de texto, foram analisadas com o programa de 11,0 SigmaPlot gráficos (Systat Software, Point Richmond, CA) e plotados como mostrado na Figura 1. Concentração-resposta de dados, calculados a partir dos traçados, foram analisados através da determinação EC 50 valores a partir de dados experimentais instalados em uma função logística quatro parâmetros no menu de Farmacologia do programa. Comparações entre grupos e dentro dos grupos foram realizadas por uma análise de variância (ANOVA) e as diferenças com 0,05 p <são considerados significativos.
6. Resultados representativos:
| Parâmetros | Wistar | Dahl sensíveis ao sal | Dahl sal-resistente |
|---|---|---|---|
| L 100 (mm) | 83,26 ± 2,33 | 91,52 ± 4,67 | 117,45 ± 8,43 * |
| X 1 | 604,21 ± 41,97 | 752,24 ± 85,25 | 745,84 ± 110,09 |
| r 2 | 0,99 ± 0,003 | 0,97 ± 0,008 | 0,97 ± 0,007 |
* A diferença entre os valores para L 100 Wistar e DR são estatisticamente significativas. Shapiro-Wilk teste de normalidade passado (p = 0,588), Teste de Igualdade de Variância passado (p = 0,237).
L 100 = diâmetro interno do segmento montado correspondente à pressão transmural alvo.
X 1 = A configuração do posicionador micro necessário para esticar o navio montado em sua circunferência interna normalizado (ou seja, o valor da leitura micrômetro em que os experimentos foram realizados).
r 2 = coeficiente de regressão para ajuste de (X i, Y i) para uma curva exponencial.
NB: O procedimento detalhado está descrito no manual para o Sistema Myograph 510A 6.
Tabela 1. Sample Leia-Out dos parâmetros de normalização para os segmentos de artéria mesentérica Wistar, DS e DR de programa básico mostrado no "Menu normalização". Os valores são médias (± SEM) de 5 animais. * As diferenças entre os valores para L 100 Wistar e DS são estatisticamente significativas (p <0,05).
| Wistar | DS | DR |
|---|---|---|
| 14,2 ± 0,6 | | 20,9 ± 1,3 * | |
Tabela 2. Tensões Desenvolvidos (mN) em artérias mesentéricas isoladas de Wistar, DS e ratos DR, na sequência de pedidos de 5 mM PE para cada navio. Valores reportados são meios (± SEM) de 6-8 animais. * Significativamente diferente do Wistar controles (p <0,05).
Figura 1. Ca 2 + e relaxamento induzido de uma artéria mesentérica PE-contratados a partir de um rato Wistar montado em um myograph fio em solução salina fisiológica contendo 1 mM Ca 2 +. A artéria foi equilibrada por 30 min a 37 ° C com aeração constante e respostas para Ca 2 + e determinado. Uma força representativa de rastreamento em adição de 5 mM PE seguido por adições acumulada de Ca 2 + é mostrada.
Figura 2. Ca 2 + e relaxamento induzido de uma artéria mesentérica PE-contratados a partir de um rato DS montado em um myograph fio em solução salina fisiológica contendo 1 mM Ca 2 +. A artéria foi equilibrada por 30 min a 37 ° C com aeração constante e respostas para Ca 2 + e determinado. Uma força representativa de rastreamento em adição de 5 mM PE seguido por adições acumulada de Ca 2 + é mostrada. Ca 2 + relaxamento foi severamente comprometida neste tecido em comparação com aqueles de ratos Wistar e DR.
Figura 3. Ca 2 + e relaxamento induzido de uma artéria mesentérica PE-contratados a partir de um rato DR montado em um myograph fio em solução salina fisiológica contendo 1 mM Ca 2 +. A artéria foi equilibrada por 30 min a 37 ° C com aeração constante e respostas para Ca 2 + e determined.A força representativa de rastreamento em adição de 5 mM PE seguido por adições acumulada de Ca 2 + é mostrada.
Figura 4. A. [Ca 2 +] e-resposta curvas. B. O gráfico de barras mostrando EC 50 valores para o relaxamento determinado pelo ajuste dos dados para um quatro expressão curve.C.CaR parâmetro logística em arcadas mesentéricas isoladas de ratos DR e DS.
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Discussion
A hipertensão é uma das principais causas de morbidade cardiovascular, renal e cerebral / mortalidade. A ocorrência de hipertensão é alta na população e hipertensão sal-sensível é particularmente elevada na população idosa, e mais prevalente em negros do que brancos. Este é acreditado para ser devido à tendência dos negros para reter sódio em seus rins 9. Sal-sensibilidade é um fator importante que contribui para a doença renal e está associada à disfunção endotelial, mas o mecanismo não é totalmente compreendido. Estudos recentes em nosso laboratório revelaram que as dietas de sal elevado reduzir líquido intersticial Ca 2 + concentração ([Ca 2 +] IF), e aumentar a pressão sistólica em sal-sensíveis ratos 10,11. Estes efeitos podem ser atribuídos à redução da expressão de carros em artérias mesentéricas e kidneys.Finding idêntica redução dos níveis CaR em sal-sensíveis pacientes hipertensos poderia fornecer um alvo para o desenvolvimento de novas terapias. Temos vindo a utilizar o fio Miografia automatizado com artérias mesentéricas isoladas a partir de uma série de modelos animais de hipertensão para estudar a reatividade vascular de Ca 2 + e para entender o mecanismo de sinalização CaR na vasculatura.
[Ca 2 +] e é mantido dentro de uma faixa estreita (1,1-1,4 mM) em humanos 12, portanto, o CaR deve ser capaz de detectar pequenas alterações na [Ca 2 +] e para a ativação do receptor a ser possível. Na verdade, o carro foi mostrado para detectar pequenas mudanças no Ca 2 + e 13, e pequenos aumentos na [Ca 2 +] IF que estão dentro da faixa fisiológica 14. Em estudos de microdiálise in situ de medição [Ca 2 +] IF no submucosa duodenal e rim córtex, dois tecidos que são essenciais para a regulação da resistência periférica e da pressão arterial (PA), mostraram alterações dinâmicas em função do intestino do lúmen [Ca 2 +]. Gut aumentar [Ca 2 +] 0-6 mM, aumentou a [Ca 2 +] IF 1,1-1,9 mM 4,5,15, que está na faixa observada para ativar o CaR nervosas perivascular 16, e relaxar mesentérica isolada artérias 17. Também mostramos que o carro detecta diminui em [Ca 2 +] e e aumentar a duração do potencial de ação através da ativação do canal de cátions não-seletivos, que por sua vez atenua o impacto na probabilidade de liberação nos terminais neocortical 18. Isto sugere que o carro oferece pré-sináptica comentários para alterar a excitabilidade cerebral em resposta ao Ca 2 + e. Além disso, a dessensibilização do CaR PVN ocorre com a estimulação repetida prolongada 16, sugerindo que a compreensão da regulação deste receptor irá clarificar o seu papel tanto em condições normais e hipertensos. Bukoski e colegas mostraram que pequenas mudanças na [Ca 2 +] IF são suficientes para ativar o CaR e contribuir para a síntese de vasodilatador em condições normais 3,4.19,. Com base nessas observações, postulamos que esta resposta também vai ocorrer nas condições do tônus vascular aumentado, como visto na hipertensão e pode, portanto, ser exploradas para controlar a pressão arterial. O estudo da ativação do carro e como isso leva à fosforilação de intermediários sinalização é, portanto, obrigados a sonda o seu papel na fisiologia normal e hipertensos. O carro é G receptor acoplado à proteína (GPCR) e é regulada através de mecanismos semelhantes aos GPCRs outros, que são comuns alvos terapêuticos. Portanto, compreender os mecanismos de sua regulação nos vasos sanguíneos irá fornecer dados úteis para determinar o seu potencial como um alvo para terapia anti-hipertensiva.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O projeto descrito foi apoiada por números Award HL064761 R01, R25 HL059868, 1SC1 HL099139 e P20 MD000175 forma National Institutes of Health. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto Dual Wire Myograph System-510ADMT-USA, Inc. | Atlanta, GA. | 100151 | |
| PowerLab/4SP Data Acquisition System |  ADInstruments |
ML750 | New models with 4-16 input channels are available. |
| Dell Dimension XPS Gen 4 Computer | Dell | ||
| Stemi SV II (Apo) Dissection Microscope with Ocular | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Wistar, Dahl salt-sensitive, Dahl salt-resistant rats | Harlan Laboratories | ||
| Rodent chow | Harlan Laboratories | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Other chemicals | All chemicals used were of the purest grades available commercially. |
References
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
- Mulvany, M. J. Procedures for investigating of small vessels using small vessel myograph. DMT Danish Myo Technology. , (2004).
- Angus, J. A., Wright, C. E. Techniques to study the pharmacodynamics of isolated large and small blood vessels. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 44, 395-407 (2000).
- Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels. J. Physiol. 275, 85-101 (1978).
- Lindhorst, J., Alexander, N., Blignaut, J., Rayner, B. Differences in hypertension between blacks and whites: an overview. Cardiovasc. J. Afr. 18, 241-247 (2007).
- Eley, S. L., Allen, C. M., Williams, C. L., Bukosi, R. D., Pointer, M. A. Action of thiazide on renal interstitial calcium. Am. J. Hypertens. 21, 814-819 (2008).
- Palmer, C. E., Rudd, M. A., Bujoski, R. D. Renal interstitial Ca2+ during sodium loading of normotensive and Dal-salt hypertensive rats. Am. J. Hypertens. 16, 771-776 (2003).
- Hurwitz, S. Homeostatic control of plasma calcium concentration. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 31, 41-100 (1996).
- Brown, E. M., MacLeod, R. J. Extracellular sensing and extracellular calcium signaling. Physiol. Rev. 81, 239-297 (2001).
- Breitwieser, G. E. Extracellular calcium as an integrator of tissue function. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40, 1467-1480 (2008).
- Mupanomunda, M. M., Wang, Y., Bukoski, R. D. Effect of chronic sensory denervation on Ca2+-induced relaxation of isolated mesenteric resistance arteries. Am. J. Physiol. 274, 1655-1661 (1998).
- Mupanomunda, M. M., Ishioka, N., Bukoski, R. D. Interstitial Ca2+ undergoes dynamic changes sufficient to stimulate nerve-dependent Ca2+-induced relaxation. Am. J. Physiol. 276, 1035-1042 (1999).
- Mupanomunda, M. M., Tian, B., Ishioka, N., Bukoski, R. D.
- Awumey, E. M., Hill, S. K., Diz, D. I., Bukoski, R. D. Cytochrome P-450 metabolites of 2-arachidonoylglycerol play a role in Ca2+-induced relaxation of rat mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2363-2370 (2008).
- Chen, W., Bergsman, J. B., Wang, X., Gilkey, G., Pierpoint, C. R., Daniel, E. A., Awumey, E. M., Dauban, P., Dodd, R. H., Ruat, M., Smith, S. M. Presynaptic external calcium signaling involves the calcium-sensing receptor in neocortical nerve terminals. PloS One. 5, e8563-e8563 (2010).
- Bukoski, R. D. The perivascular sensory nerve Ca2+ receptor and blood pressure regulation: a hypothesis. Am. J. Hypertens. 11, 1117-1123 (1998).
- Bukoski, R. D. Dietary Ca2+ and blood pressure: evidence that Ca2+-sensing receptor activated sensory nerve dilator activity couples changes in interstitial Ca2+ with vascular. 16, 218-221 (2001).
