Summary
وقد مكنت التطورات الحديثة في 2-الفوتون المجهري في الوقت الحقيقي
Abstract
الغدد الليمفاوية (LNS) هي الأجهزة اللمفاوية الثانوية، والتي تحتل موقعا استراتيجيا في جميع أنحاء الجسم للسماح لمحاصرة وعرض المستضدات الأجنبية من الأنسجة الطرفية لرئيس الوزراء واستجابة جهاز المناعة على التكيف. جنبا إلى جنب بين الاستجابات المناعية الفطرية وقابلة للتكيف، وLN هو موقع مثالي لدراسة التفاعلات المناعية 1،2 الخلية. الخلايا الليمفاوية (خلايا T والخلايا B والخلايا القاتلة الطبيعية)، والخلايا الجذعية (DCS)، والضامة تشكل الجزء الأكبر من نخاع العظام المستمدة من العناصر الخلوية من LN. ويحتل موقعا استراتيجيا هذه الخلايا في LN للسماح للمراقبة الفعالة للمستضدات الذات ومستضدات الأجانب المحتملين 3-5. وهذه العملية التي واجهت بنجاح مستضدات الخلايا الليمفاوية وما شابه ذلك هو موضوع تحقيق مكثف في السنوات الأخيرة، وينطوي على تكامل الاتصالات الجزيئي بما في ذلك مستقبلات المستضد، جزيئات الالتصاق، كيموكينات، وهياكل اللحمية مثل شبكة الليفي شبكي 2،6-12 . قبل وضع من فلوري في الوقت الحقيقي وعالية الدقة في التصوير الحي، والمحققين اعتمدوا على التصوير الثابت، الذي لا يقدم سوى الأجوبة المتعلقة التشكل، موقف، والهندسة المعمارية. في حين أن هذه الأسئلة أساسية في فهمنا لسلوك الخلايا المناعية، والقيود الذاتية مع هذه التقنية لا تسمح تحليل للاتجار اللمفاويات فك خيوط والبيئية التي تؤثر على سلوك الخلية الحيوية. في الآونة الأخيرة، وتطوير intravital اثنين من الفوتون سمح ليزر المسح المجهري (2P-LSM) المحققين لعرض حركات ديناميكية وتفاعلات الخلايا الفردية ضمن LNS حية في الموقع 12-16. على وجه الخصوص، وقد طبقت نحن وغيرنا هذا الأسلوب لسلوك صورة الخلوية والتفاعلات داخل LN المأبضية، حيث شكله المدمج، والطبيعة كثيفة توفر ميزة الحصول على بيانات متعددة على مساحة والنسيج واسعة مع الهياكل الفرعية الأنسجة المختلفة 11،17-18 . هذا أنامن المهم أن نلاحظ أن هذه التقنية توفر فوائد إضافية على explanted تقنيات التصوير الأنسجة، والتي تتطلب انقطاع الدم، وتدفق الليمفاوية، وفي نهاية المطاف ديناميات الخلوية للنظام. بالإضافة إلى ذلك، الأنسجة explanted لها نافذة محدودة للغاية من الوقت الذي لا تزال قابلة للحياة الأنسجة للتصوير بعد ازدراع. مع الترطيب المناسب ورصد أحوال الحيوان البيئية، يمكن تمديد الوقت التصوير بشكل ملحوظ مع هذه التقنية intravital. هنا، نقدم طريقة مفصلة لإعداد الماوس المأبضية LN لغرض أداء التصوير intravital.
Protocol
1. فأر حامل الجمعية
- تراكب غطاء صحن 100 ملم بيتري الزجاج على رأس 100 مم من البلاستيك غطاء طبق بيتري أسفل. يجب أن يكون زجاج لمس بالكاد نقطة وسط طبق من البلاستيك. استخدام الزجاج واستنسل، تتبع علامة على طبق من البلاستيك.
- استخدام الحفر اليد (أي DREMEL) لإزالة جزء من غطاء 100 مم طبق من البلاستيك لخلق منصة على شكل هلال. وهذا غطاء من البلاستيك على شكل هلال بمثابة دعم الجذع العلوي من الفأرة (الشكل 1A). حفر اثنين من الثقوب على غطاء على شكل هلال لتأمين قناع غاز مع معدن التعادل تطور. تأمين غطاء من البلاستيك على حافة طبق بيتري الزجاج باستخدام الغراء عظمى أو لاصق قوي مكافئ (الشكل 1B).
- الغراء الأغطية اثنين من القبة الحد الأقصى للأنابيب PCR (قطع في المفصل) 1 سم بعيدا إلى وسط الطبق أسفل لغرض رسو اللوحات الجلد المأبضية.
2. فأر التحضير
3. عملية جراحية 4. 2-الفوتون التصوير اكتساب ** * قد يكون هذا الإجراء الجراحي يكون من المفيد أيضا لأشكال أخرى من التصوير intravital بخلاف LSM-2P. 5. ممثل النتائج يتم تجنيد مختلف خلايا المناعة المنتشرة في LN بمعدلات مختلفة بعد نقل بالتبني. لCD4 + و CD8 + الخلايا اللمفية، وهذه الخلايا تبدأ في الوصول إلى LN من خلال ارتفاع البطانية دقيقة (اتش اى فى) الوريد بعد نقل الرابع مع أعداد كبيرة وصوله الى LN المأبضية بعد 2 إلى 4 ساعات 6،17-18. لباء سلليرة سورية، وعدد كبير تتراكم بعد 8 إلى 24 ساعة 19. وينبغي أن البلدان النامية المنشط تبدأ في الظهور في استنزاف المأبضية ساعات 8-16 LN بعد حقن 3،11،16-17 قاطع الطريق. 2A الرقم يدل على ان حتى من دون معالم أخرى، يمكن تمييز هياكل مثل بصيلات الخلية B بسهولة عن طريق تراكم خلية كروية جولة مرئية تحت 2P-LSM 19. باستخدام مراسل الذاتية فلوري مثل splenocytes ubiquitin-GFP (الشكل 2، فيديو إضافي 1 و 2)، يمكن للمرء أن تتبع هذه الهجرات اللمفاويات والسلوكيات لعدة أيام تصل إلى أسبوع في ظل الظروف الفسيولوجية غير المحفزة. مع متعدد القنوات للكشف عن حساسية عالية، فمن الممكن الحصول على بيانات التصوير المتعدد الذي يشمل المعلومات الهيكلية، فضلا عن دينامية التفاعل بين الشركاء الخلوية متعددة 17،19. عندما يتم تنفيذها بشكل صحيح التقنيات الجراحية والظروف البيئية رصدها بعناية، lymphocyوينبغي أن قسم التدريب والامتحانات يحمل سمة السرعة والهجرة، وكما هو موضح في الشكل 2C، 2D و 13-14،16 في مكان آخر. الخلايا اللمفية قد يحمل أيضا اختلافات في سرعة الهجرة تبعا لمناطق فرعية من التصوير LN تمر، وسوف معالم إضافية حتى مثل الأوعية الدموية (كما يتضح من مقدمة السفينة من الأصباغ) تساعد على تحديد نوعية التصوير الكلي (أي التحكم في درجة الحرارة المناسبة ، الحد الأدنى من الصدمة إلى LN، الخ.) 3،6،20. تكميلية الفيديو 1. الوقت الفاصل بين intravital 2P-LSM التصوير على فأرة الحاسوب المأبضية LN كما هو موضح في الشكل رقم 2. تم عزل ما مجموعه من الخلايا الليمفاوية 7 1x10 الابأم متبرع + ubiquitin-GFP الماوس ونقل adoptively عن طريق الوريد إلى الفأر المتلقي C57BL / 6 قبل 24 ساعة من التصوير. وكانت سلسلة من س ص (750 ميكرون × 750 ميكرون) واتخذت صور مضان من خلال مداخن Z ثابت (خطوات ميكرون 5 و 13 خطوات) أن يؤديا إلى كومة التصوير XYZ (750 ميكرون × 750 × 65 ميكرون ميكرون)، والذي كان يتكرر كل 20 ثانية أي ما مجموعه 60 دقيقة، مما أدى إلى تسلسل التصوير xyzt للتحليل السرعة (أرقام 2C، 2D). قراءة السرعة = 450X. شريط النطاق = 50 ميكرون. قضاء الوقت = دقيقة: ثانية. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو تكميلية . تكميلية فيديو 2 تم تكبيره في ضوء تسلسل التصوير في فيديو إضافي 1 في جراب الخلية ب - تي منطقة الحدود الخلية. قراءة السرعة = 450X. شريط النطاق = 25 ميكرون. الطابع الزمني = دقيقة: ثانية Cلعق هنا لمشاهدة الفيديو التكميلي. 
الشكل 1. بناء حائز الماوس لLN الماوس التصوير المأبضية أ) الخطط التجمع حامل الماوس؛. ب) إعداد الممثل الماوس intravital ج) حامل الماوس أنجزت الجمعية د) عن قرب وجهات نظر LN المأبضية بعد التعرض الجراحية. 
الشكل 2. تحليل الهجرة من الخلايا اللمفية + GFPفي LN المأبضية. (أ) لقطة 3D مأخوذة من تسلسل التصوير 2P-LSM من LN المأبضية في فأر متلق C57BL / 6 نقل adoptively مع 1x10 7 أيام + GFP 1 اللمفاويات قبل التصوير. خط اندفاعة يدل على الحدود من بصيلات الخلية B، (ب) مسارات هجرة الخلايا اللمفاوية خلال 1 ساعة من التصوير المستمر؛ ج) توزيع إجمالي سرعة هجرة الخلايا اللمفاوية. يعني السرعة = 10.04 ± 4.26 ميكرون / للدقيقة (من مجموع 15125 المسارات تحليلها)؛ د) التفاضل سرعة الهجرة الخلوية توزيع الخلايا الموجودة في جراب الخلية B (الحانات مفتوحة، يعني السرعة = 8.79 ± 3.90 ميكرون / دقيقة، 1525 مجموع تحليل المسارات ) ومنطقة تي خلية (الحانات مغلقة؛ يعني السرعة = 13.77 ± 5.93 ميكرون / دقيقة، ما مجموعه 1250 تحليل المسارات). شريط النطاق = 50 ميكرون.
Discussion
وقد صاحبت التطورات الحديثة في ذات الدقة العالية في تقنيات التصوير في الموقع، خصوصا 2P-LSM، من خلال الاهتمام المتزايد في دراسة سلوك الخلوية الحيوية في الجسم الحي. تقنية التصوير 4D على LN المأبضية على فأرة الحاسوب حية تسمح مثل هذه التحليلات في السلوك الديناميكي من الخلايا المناعية داخل النسيج undisrupted الصغرى البيئة. استخدام LSM-2P مع كاشفات متعددة تغطي كامل الطيف المرئي يسمح في وقت واحد لجمع البيانات والتصوير من السكان الخلية متعددة. ويمكن الآن يمكن تحقيق ذلك من خلال استخدام الخلايا في الجسم الحي محددة الفئران مراسل فلوري (على سبيل المثال، Ubiquitin eGFP، طلب تقديم العروض، أو eCFP-) جنبا إلى جنب مع الاستفادة من نقل بالتبني من سكان الخلية المسمى تفاضلي باستخدام الأصباغ العضوية خلية فلوري (على سبيل المثال CFSE ، SNARF-1، وخلية المقتفي أورانج) لبحث الآليات الخلوية وظيفة داخل LN. بالإضافة إلى الملاحظة المباشرة للتفاعلات بين ج تتبع تفاضليالسكان الذراع، لا يمكن للبيانات التصوير المتعدد الخضوع لمزيد من التحليل المتاحة تجاريا مع برامج التصوير برامج معالجة (على سبيل المثال Imaris، BitPlane شركة) لتوضيح مزيد من سلوك الخلايا وظيفة. مجموعة واسعة من الاحتمالات موجودة لدراسة آليات التفاعل الخلوية باستخدام هذه في الجسم الحي، وعلى تقنيات السيليكو.
القيد الرئيسي من المنهج التجريبي وصفها هنا هو التعقيد التقني الكامنة في نهج عملية جراحية. هذا الأسلوب يتطلب تدريب صارم لتصبح مألوفة مع تشريح ذات الصلة، والإجراءات الدقيقة والمهارات الفنية كما هو مطلوب بموجب هذا البروتوكول. العوامل يزيد من تعقيد وتشمل صعوبة في الحد من تلف الأنسجة أثناء التنقيب LN، وتحسين الاستقرار الأنسجة أثناء التصوير، ومنع الإصابة الحرارية والليزر إلى LN قبل وأثناء تجريب التصوير. واضطراب في أي من هذه العوامل تؤدي إلى أقل من المستوى الأمثل الليمفاويةوالحركة ocyte وبالتالي التدخل مع التفسير الصحيح لتحليل البيانات الناتجة التصوير.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم أي شيء لكشف.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من لجنة التحقيق الوطنية 1R01CA154656، NIAID 1R21AI092299، معهد بحوث السرطان، مؤسسة سانت Baldrick، ومؤسسة دانا، مؤسسة غابرييل في الملاك، وهيونداي موتورز الأمريكية "الأمل على اساس عجلات" البرنامج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Nair - hair removal lotion | Nair | ||
| PBS, 1X | Cellgro | 21-040-CV | |
| Heating pad | Watlow | ||
| Heating Pad Controller | Watlow | ||
| Air and O2 | Airgas | ||
| Temperature probe | Harvard Apparatus | ||
| Tweezers Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14101 | |
| Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved | World Precision Instruments, Inc. | 14141 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| Cover of 100x20 mm glass cell culture dish | Corning | 70165-102 | |
| Cover of 100x20 mm polystyrene cell culture dish | Corning | 430167 | |
| Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 |
References
- Bousso, P. T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies. Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).
- Germain, R. N. Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging. Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).
- Huang, A. Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
- Stefanova, I. Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes. Nature. 420, 429-434 (2002).
- Stefanova, I. On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen. Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).
- Bajenoff, M. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
- Celli, S. Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo. Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).
- Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes. Immunity. 25, 867-869 (2006).
- Worbs, T. CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo. J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).
- Bajenoff, M. byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node. Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).
- Mempel, T. R. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- von Andrian, U. H., Mempel, T. R. Homing and cellular traffic in lymph nodes. Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).
- Castellino, F. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440, 890-895 (2006).
- Halin, C. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).
- Qi, H. Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells. Science. 312, 1672-1676 (2006).
- Germain, R. N. An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging. Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).
