Intravital הדמיה של בלוטות לימפה popliteal עכבר

Summary

ההתקדמות מיקרוסקופיה 2-פוטון אפשרו בזמן אמת

Abstract

בלוטות הלימפה (LNs) הם איברי הלימפה משניים, אשר ממוקמים אסטרטגית בכל הגוף, כדי לאפשר לכידה והצגה של אנטיגנים זרים ברקמות היקפי ראשוניים תגובה חיסונית אדפטיבית. זה לצד זה בין התגובות החיסוניות מולד אדפטיבית, LN הוא אתר אידיאלי ללמוד ^1,2 אינטראקציות החיסונית התא. (לימפוציטים ותאי T, תאים מסוג B ותאי נ"ח), תאים דנדריטים (DCS), ומקרופגים מהווים את חלק הארי של מח עצם הנגזרות אלמנטים הסלולר של LN. תאים אלה ממוקמים אסטרטגית LN כדי לאפשר מעקב יעיל של אנטיגנים עצמיים ו אנטיגנים זרים פוטנציאליים ^3-5. התהליך שבו לימפוציטים בהצלחה נתקלים אנטיגנים מאותו מקור הוא הנושא של חקירה אינטנסיבית בשנים האחרונות, וכולל שילוב של קשרים מולקולאריים כולל קולטנים אנטיגן, מולקולות הדבקה, כמוקינים, ומבנים סטרומה כגון רשת fibro-רשתי ^2,6-12 . לפני התפתחות ברזולוציה גבוהה בזמן אמת ניאון in vivo הדמיה, חוקרים הסתמכו על הדמיה סטטי, אשר רק מציע תשובות לגבי, מורפולוגיה מיקום, ואדריכלות. בעוד שאלות אלה הם בסיסי להבנת התנהגות התא החיסונית, את המגבלות הפנימיות עם טכניקה זו אינה מאפשרת ניתוח לסחר לימפוציטים לפענח רמזים סביבתיים המשפיעים על התנהגות התא דינמי. לאחרונה, פיתוח intravital שני הפוטונים סריקת לייזר מיקרוסקופית (2P-LSM) אפשרה לחוקרים כדי להציג את תנועות דינאמיות ואת האינטראקציות של תאים בודדים בתוך LNs חיות ^12-16 באתרו. בפרט, אנו ואחרים יישמו טכניקה זו התנהגות התמונה אינטראקציות הסלולר בתוך LN popliteal, שם, טבע צפופה קומפקטית שלה מציעה את היתרון של רכישת זמנית נתונים על שטח גדול עם מגוון רקמות רקמות תת מבנים ^11,17-18 . זה אניחשוב לציין כי טכניקה זו מציעה יתרונות על פני הוסיף explanted הדמיה טכניקות רקמה, אשר דורשים הפרעה הדם, זרימת הלימפה, ובסופו של דבר הדינמיקה הסלולר של המערכת. בנוסף, רקמות explanted יש חלון מצומצם מאוד של הזמן שבו הרקמה עדיין מעשית עבור הדמיה לאחר explant. עם לחות ניטור נאות של תנאי הסביבה של בעלי חיים, זמן דימות ניתן להרחיב באופן משמעותי עם טכניקה זו intravital. כאן, אנו מציגים שיטה מפורטת של הכנת LN popliteal העכבר לצורך ביצוע הדמיה intravital.

Protocol

1. מחזיק עכבר האסיפה

1. שכבת כיסוי של צלחת פטרי 100 מ"מ זכוכית על גבי מכסה של 100 מ"מ צלחת פטרי פלסטיק כלפי מטה. זכוכית יש בקושי נוגע נקודת המרכז של צלחת פלסטיק. באמצעות זכוכית כמו סטנסיל, לעקוב אחר סימן על גבי צלחת פלסטיק.
2. השתמש מקדח יד (כלומר Dremel) להסיר חלק המכסה 100 מ"מ צלחת פלסטיק כדי ליצור פלטפורמה בצורת חצי סהר. זה מכסה בצורת חצי סהר פלסטיק תשמש תמיכה עבור הגוף העליון של העכבר (איור 1 א). לקדוח שני חורים על מכסה בצורת חצי סהר להבטיח מסכת גז עם עניבה טוויסט מתכת. לאבטח את מכסה הפלסטיק לקצה צלחת פטרי מזכוכית באמצעות דבק סופר או דבק חזק שקול (1B איור).
3. הדבק את המכסים של 2 בעל כיפת יתר PCR צינורות (לחתוך את ציר) 1 ס"מ זה מזה למרכז הצלחת התחתונה לצורך עיגון דשי העור popliteal.

2. עכבר הכנה

1. להרדים את העכבר עם isoflurane (2-2.5% לזירוז, 1.5 עד 2% לניתוח / הדמיה) ונכללה ב 01:01 O _2: תערובת אוויר בקצב זרימת 1L/min באמצעות הליך IACUC המאושרת. לאחר העכבר הוא הרדים, להבטיח מסכת גז על האף עם הקלטת. לקבוע אם העכבר הוא בהרדמה מלאה של חוסר בתגובה אצבע ו / או צובט הזנב. רמת isoflurane עשוי להיות בהתאם כדי להבטיח את בעל החיים הוא מסומם לגמרי, עם קצב קבוע, שאינו עמל הנשימה בין 60-80 נשימות / דקה.
2. השתמש גוזם חשמלי להסרת שיער על רגל אחורית ימין באזור מפשעתי של העכבר.
3. להבריש את השיער פזור בעדינות להחיל את המעיל הצנוע של קרם נאיר על אזור מגולח עם מקלון צמר גפן. אחרי דקה אחת של היישום הראשוני, הסר נאיר ולנקות את העור חשוף עם לחהנייר מגבת. ודא העכבר נקי ויבש לפני שתמשיך.
4. לעשות חתך קטן 2-3 מ"מ עם מספריים בברך את הזכות לחשוף את הגיד פושטי.
5. החל Vetbond יחד במרכז מחזיק את העכבר שבו הגוף העכבר הרגל ימוקמו. בזהירות להבטיח את העכבר על בעל, עם ברך ימין למטה, כדי לחשוף את הפוסות popliteal הנכון. להבטיח את גיד הברך הימנית עם Vetbond של בין 2 בעלי דש העור כדי לעזור לייצב את תחום ההדמיה.
6. למתוח סרט הזרועות רגל שמאל לפלטפורמה העליונה של בעל.
7. השתמש עניבה טוויסט כדי לאבטח את מסיכת הגז במקום.
8. מניחים את בעל תחת מיקרוסקופ לנתיחה. LN חייב להישאר דוממים, ללא תנועה נשימה של העכבר. לכן, יש לנקוט באמצעי זהירות בעת ביצוע ניתוח כדי לייעל את יציבות הרגל. לקבוע את המיקום של הזנב (בדרך כלל מעל לראש), כי תתרום הגדול ביותריציבות ברגל ימין קלטת הזנב למטה.

3. כירורגיה

1. בעוד היקף תחת לנתיחה, לשמור על גוף העכבר הטמפרטורה באמצעות תנור חימום או כרית חימום. הדמיה מוצלחת של LN popliteal, חשוב לשמר את חום הגוף הנכונה במהלך הניתוח, כמו גם לשמור על לחות הרקמה על ידי יישום כל הזמן PBS חם לרקמות חשוף.
2. לחטא את העור בבטאדין. בעזרת מספריים סטריליות, לעשות חתך קו האמצע דרך העור בקצה הימני באמצע השוק, ולהמשיך לחתוך אנכית עד החלק עליון של הירך הימני.
3. לעשות שני חתכים אופקיים העור בחלק העליון של קו חתך אנכי ליצור יריעות עור משני הצדדים.
4. לחזור בו ולהדביק את שני שולי העור עם Vetbond. מושך את העור מתוח לפני החלת Vetbond יהיה עוד יותר לקדם את היציבות הרגל, אולם לוודא כי מתח העור לא לחסום את זרימת הדם (כלומר שינויים vesseאני צבע או קוטר). ממשיכים את הדבק במקומות אחרים בגוף, כדי להבטיח יציבות של הרגל לפני חשיפת LN. גודלו של העכבר תקבע עד כמה העור הנוסף נדרש דבק למטה. בדרך כלל, עכברים גדולים ידרוש העור יותר להיות דבוק בעל.
5. LN צריך לשכב בתוך השקע popliteal או ימינה או שמאלה של הווריד popliteal, בהתאם למיקום של העכבר על בעל. בזהירות להפריד LN מרקמות השומן והשרירים הסמוכים באמצעות מיקרו המבתרים פינצטה או מלקחיים. כדי למזער את הדימום טראומה, להשתמש בטכניקות פילוח עם מיקרו לנתח פינצטה לרקמות שונות. בזהירות לחשוף LN popliteal מבלי לסכן את תקינות כלי הדם מביא ו efferent וכלי הלימפה מביא.
6. ליציבות רקמות הוסיף, זכוכית מכסה מרובע עשוי להיות ממוקם מעל LN לח, בקושי נוגע LN תוך הימנעות חסימת כלי הדם. הזכוכית המכסה יכול להיות securאד עם פלסטלינה משני צדי העכבר.
7. צבעי ניאון כלי בגדלים שונים (למשל TRITC-dextran, לפחות 70kDa) יכול להיות מוצג דרך הווריד בשלב זה כדי לעזור להדגיש את מערכת היחסים השלמות המבנית של LN במהלך ההדמיה.

4. 2-Photon הדמיה רכישת **

1. לאחר LN נחשף בצורה נאותה את היציבות מושגת, מיד להעביר את מכלול שלם בעל העכבר על הבמה מיקרוסקופ מצויד בלוק לתכנות משוב טמפרטורת חימום מבוקר בתא מיקרוסקופ הסביבה כל הזמן על 37 ° C. הוסף סטרילית מספיק חמים (37 מעלות צלזיוס) PBS או HBSS לצלול LN. נפח ישתנה בהתאם לגודל והמיקום של העכבר. לחלופין, PBS חם או HBSS ניתן להחיל ישירות LN גזור באמצעות פיפטה כוס בסדר מצויד למשאבה peristaltic והדביקה לעמודה המטרה העדשה טבילה. זרימת הנוזל צריך להיות כךעמודת המים יציבה יכולה להתקיים בין העדשה רקמה.
2. לשמור על PBS או הטמפרטורה HBSS על 37 מעלות צלזיוס באמצעות כרית חימום עם החללית משוב. בדיקה נפרדת בטמפרטורה צריך להיות ממוקם מחזיק את העכבר כדי לאשר את הטמפרטורה של PBS בטווח של 36.5-37.5 ° C. בדיקה רקטלית יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר הטמפרטורה של ליבת הגוף העכבר ניסיוני במהלך הפגישה הדמיה.
3. השתמש EPI-מנורת פלורסנט לעזור מיקום מדריך LN תחת המטרה. לרכישת ערימות תמונה ניאון באמצעות מרווחי זמן המתאימים אינטראקציה הסלולרי הרצוי (בדרך כלל 10 שניות עד 1 דקה בין כל ערימה התמונה XYZ).
4. לפקח על מצב בעלי החיים בתא מיקרוסקופ לעתים קרובות על ידי בדיקה ויזואלית או באמצעות מערכת ניטור בעלי חיים. לקבוע אם העכבר הוא בהרדמה מלאה של חוסר בתגובה אצבע ו / או צובט ציפורניים, ו יציב, בלתי מאומצת קצב הנשימה בין ב 60-80reaths / דקה. רמת isoflurane עשוי להיות בהתאם על מנת להבטיח כי בעל החיים הוא מסומם לגמרי. עם ניטור נוזלים תקין, בעלי חיים ניתן הדמיה למשך 4-6 שעות, או אולי יותר.
5. לאחר ניסוי הדמיה, להרדימו בתא ₂ CO באמצעות IACUC המאושרת פרוטוקול המתת חסד. בעלי חיים אסור לצאת מן ההרדמה לפני המתת חסד.

** זה הליך כירורגי עשוי להיות שימושית גם עבור סוגים אחרים של הדמיה intravital מלבד LSM-2P.

5. נציג תוצאות

תאים חיסוניים שונים במחזור מגויסים כדי LN בקצב שונה בעקבות העברת המאמצת. עבור CD4 ⁺ CD8 ⁺ ו לימפוציטים, תאים אלה מתחילים להגיע LN דרך גבוהה אנדותל (HEV) ורדיד דקות לאחר העברת הרביעי עם מספרים משמעותיים המגיעים LN popliteal לאחר 2 עד 4 שעות ^6,17-18. עבור B cells, מספר לא מבוטל יצטברו לאחר 8 עד 24 שעות ^19. DCS הופעל צריך להתחיל להופיע הייבוש popliteal הוזהרו 8 עד 16 שעות לאחר הזרקת ^3,11,16-17 שודד דרכים. איור 2 א 'עולה כי גם ללא נקודות ציון אחרות, כגון מבנים זקיקי ב התא ניתן להבחין בקלות על ידי הצטברות תא עגול כדורי גלוי תחת 2P-LSM ^19. באמצעות כתב ניאון אנדוגני כגון splenocytes היוביקוויטין-GFP (איור 2, סרטונים תוספת 1 ו 2), ניתן לעקוב אחר העברות אלה הלימפוציטים והתנהגויות ימים עד שבוע בתנאים פיזיולוגיים גירוי לא. עם הרב ערוצית גלאי רגישות גבוהה, אפשר לרכוש הדמיה זמנית במערך שכולל מידע מבניים, כמו גם הדינמיקה של אינטראקציה בין בני זוג הסלולר מספר ^17,19.

כאשר טכניקות כירורגיות מתבצעות כראוי את תנאי הסביבה במעקב צמוד, lymphocyTES צריך להפגין מהירות הגירה אופיינית, כפי שמודגם באיור 2 ג, 2 ד ובמקומות אחרים ^13-14,16. לימפוציטים יכול גם להפגין ההבדלים במהירות העברה בהתאם תתי אזורים של הדמיה LN עוברת, ציוני דרך נוספים כך כמו כלי דם (מסומן על ידי כניסתה של צבעים כלי) יסייע לקבוע את איכות ההדמיה הכללי (כלומר שליטה בטמפרטורה הנכונה , טראומה מינימלית LN, וכו ') ^3,6,20.

באיור 1. הבנייה של בעל העכבר על העכבר popliteal LN Imaging) שרטוטים של ההרכבה בעל העכבר,. ב) הכנת נציג העכבר intravital, ג) השלימו בעל הרכבה העכבר, ד) תקריב הדעות של LN popliteal לאחר חשיפה כירורגית.

איור 2. הגירה ניתוח של ה-GFP + לימפוציטיםב LN popliteal. (א) תמונת מצב 3D מתוך רצף 2P-LSM הדמיה של LN popliteal בעכבר C57BL / 6 הנמען העביר adoptively עם 1x10 ⁷ יום GFP ⁺ 1 לימפוציטים לפני הדמיה. קו דש מציין את הגבול של זקיקים ב 'תא (ב) שירים של הגירה לימפוציטים במהלך שעה 1 של הדמיה רציפה, ג) התפלגות המהירות הכוללת העברת לימפוציטים. מהירות ממוצעת = 10.04 ± 4.26 מיקרומטר / ד '(סך של 15,125 שירים, ניתח) ד) הגירה הסלולר דיפרנציאלי מהירות הפצה של תאים הנמצאים זקיק תא B (ברים פתוחים, מהירות ממוצעת = 8.79 ± 3.90 מיקרומטר / ד', 1,525 שירים, בסך הכל נותחו ) ו-T לתא שטח (ברים סגורות, מהירות ממוצעת = 13.77 ± 5.93 מיקרומטר / ד ', סך של 1,250 שירים ניתח). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.

משלימה וידאו 1. צילום בהילוך מהיר intravital 2P-LSM הדמיה של LN העכבר popliteal כמתואר באיור 2. סך של ⁷ לימפוציטים 1x10 בודדו frאום ubiquitin-GFP + התורם העכבר והעבירו adoptively לווריד לעכבר C57BL / 6 הנמען 24 שעות לפני הדמיה. סדרה של XY (750 מיקרומטר צילומי 750 מיקרומטר) התמונות צולמו באמצעות הקרינה קבועה z ערימות (5 שלבים מיקרומטר, 13 שלבים) להניב מחסנית הדמיה XYZ (750 מיקרומטר צילומי 750 מיקרומטר 65 x מיקרומטר), אשר חזר על עצמו כל 20 שניות עבור סכום כולל של 60 דקות, והתוצאה היא רצף הדמיה xyzt לניתוח מהירות (איורים 2 ג, 2 ד). פלייבק מהירות = 450X. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. חותמת זמן = דקות: שניות. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו משלימה .

משלימה וידאו 2 הוגדל-נוכח רצף הדמיה וידאו משלימה '1 של זקיק תא B -. אזור T גבול התא. פלייבק מהירות = 450X. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. חותמת זמן = דקות:. שניות Cללקק כאן כדי לצפות בווידאו משלימה.

Discussion

ההתקדמות ברזולוציה גבוהה בטכניקות הדמיה באתרו, במיוחד 2P-LSM, היה מלווה עניין הולך וגדל בחקר התנהגות הסלולר הדינאמי in vivo. טכניקת הדמיה 4D על LN popliteal של עכבר חי מאפשר ניתוחים כאלה בהתנהגות הדינמית של תאים חיסוניים בתוך רקמת undisrupted מיקרו סביבה. השימוש LSM-2P עם גלאי מרובים רוחב הקשת כולו גלוי מאפשר הדמיה נתונים בו זמנית אוסף של אוכלוסיות תאים שונות. זה יכול להיות מושג על ידי שימוש בתא ספציפיים בעכברים ב vivo הכתב ניאון (לדוגמה ubiquitin-eGFP,-RFP, או eCFP-) בשילוב עם שימוש של העברת המאמצת של אוכלוסיות תאים אורגניים שכותרתו דיפרנציאלי באמצעות צבעי ניאון סלולריים (למשל CFSE , SNARF-1, תא כתום Tracker) לבחון מנגנונים תאיים ותפקוד בתוך LN. בנוסף תצפית ישירה של יחסי הגומלין בין ג מעקב דיפרנציאליאוכלוסיות גיד, במערך ההדמיה זמנית יכולים לעבור ניתוח נוסף עם זמינים מסחרית עיבוד הדמיה תוכנות (למשל Imaris, BitPlane Inc) להמשיך להסביר, התנהגות התא ותפקודו. מגוון רחב של אפשרויות קיים ללמוד מנגנוני האינטראקציה הסלולר באמצעות אלה in vivo ו בטכניקות סיליקו.

המגבלה העיקרית של גישה הניסוי המתואר כאן הוא המורכבות הטכנית הטמונה בגישה הניתוח. טכניקה זו דורשת אימון קפדני על מנת להכיר את האנטומיה רלוונטי בהליכים טכניים מדויקים ומיומנויות כנדרש על ידי פרוטוקול זה. גורמים מסבכים עוד כוללים קושי מזעור הנזק לרקמות במהלך החיפושים LN, אופטימיזציה של יציבות רקמות במהלך ההדמיה, ומניעת פגיעה תרמית לייזר LN לפני ובמהלך ניסוי הדמיה. ההפרעות לכל הגורמים הללו תגרום הלימפה פחות מ-אופטימליתנועתיות ocyte ועל כן להפריע הפרשנות הנכונה של הנתונים וכתוצאה מכך ניתוחים הדמיה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Baxter Internationl Inc.	NDC 10019-773-60
Vetbond	3M	1469SB
Nair - hair removal lotion	Nair
PBS, 1X	Cellgro	21-040-CV
Heating pad	Watlow
Heating Pad Controller	Watlow
Air and O2	Airgas
Temperature probe	Harvard Apparatus
Tweezers Dumont #5	World Precision Instruments, Inc.	14101
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved	World Precision Instruments, Inc.	14141
Scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Cover of 100x20 mm glass cell culture dish	Corning	70165-102
Cover of 100x20 mm polystyrene cell culture dish	Corning	430167
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution)	Purdue Products L.P.	NDC 67618-150-08