Summary
2-photon माइक्रोस्कोपी में हाल के अग्रिमों वास्तविक समय सक्षम है
Protocol
1. माउस धारक विधानसभा
- एक 100 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश के नीचे का सामना करना पड़ ढक्कन के शीर्ष पर एक 100 मिमी ग्लास पेट्री डिश के कवर ढ़कें. गिलास मुश्किल प्लास्टिक पकवान का केंद्र बिंदु को छू जाना चाहिए. कांच का प्रयोग एक स्टैंसिल के रूप में, प्लास्टिक पकवान पर एक निशान का पता लगाने.
- एक हाथ ड्रिल (यानी Dremel) का उपयोग करने के लिए एक 100 मिमी प्लास्टिक पकवान वर्धमान के आकार का एक मंच बनाने के ढक्कन के एक हिस्से को हटा दें. इस वर्धमान के आकार का प्लास्टिक ढक्कन माउस (चित्रा 1 क) के ऊपरी धड़ के लिए एक सहायता के रूप में सेवा करेंगे. वर्धमान के आकार का ढक्कन पर दो छेद ड्रिल करने के लिए एक धातु मोड़ टाई के साथ गैस मास्क सुरक्षित. सुपर गोंद या यों एक मजबूत चिपकने वाला (चित्रा 1b) का उपयोग करते हुए कांच पेट्री डिश के किनारे प्लास्टिक के ढक्कन सुरक्षित.
- गोंद दो गुंबददार - टोपी पीसीआर (काज में कटौती) ट्यूबों जानुपृष्ठीय त्वचा flaps के प्रस्तोता के प्रयोजन के लिए नीचे डिश के केंद्र के अलावा 1 सेमी के lids के.
2. माउस तैयार
3. सर्जरी 4. 2 - फोटॉन इमेजिंग अधिग्रहण ** ** यह शल्य प्रक्रिया intravital 2P - एल एस एम से अन्य इमेजिंग के अन्य रूपों के लिए भी उपयोगी हो सकता है. 5. प्रतिनिधि परिणाम विभिन्न परिसंचारी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग दरों पर दत्तक हस्तांतरण के बाद एल.एन. के लिए भर्ती कर रहे हैं. सीडी 4 के लिए + और CD8 + लिम्फोसाइटों, इन कोशिकाओं को उच्च पर्याप्त संख्या 2 से 4 घंटे 6,17-18 बाद जानुपृष्ठीय एलएन में पहुंचने के साथ चार स्थानांतरण के बाद endothelial venule पहले (HEV) के माध्यम से एलएन में पहुंचने शुरू करते हैं. बी सेल के लिएरास, एक पर्याप्त संख्या 24 से 8 से 19 घंटे के बाद जमा करेंगे. सक्रिय DCs से draining जानुपृष्ठीय एलएन लुटेरा 3,11,16-17 इंजेक्शन के बाद 8 से 16 घंटे में दिखाना शुरू कर देना चाहिए. चित्रा 2 से पता चलता है कि अन्य स्थलों के बिना भी, बी सेल रोम के रूप में ऐसी संरचनाओं दौर गोलाकार सेल 2P - एल एस एम 19 के तहत दिखाई संचय के द्वारा आसानी से discerned किया कर सकते हैं. Ubiquitin-GFP splenocytes (चित्रा 2, पूरक वीडियो 1 और 2) के रूप में एक अंतर्जात फ्लोरोसेंट संवाददाता का प्रयोग, एक दिन के लिए इन लिम्फोसाइट प्रवास और व्यवहार पर नज़र रखने के गैर stimulatory शारीरिक शर्तों के तहत एक सप्ताह के लिए कर सकते हैं. मल्टी चैनल उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने के साथ, यह एक मल्टीप्लेक्स इमेजिंग डाटासेट है कि कई सेलुलर 17,19 भागीदारों के बीच संरचनात्मक रूप में के रूप में अच्छी तरह से जानकारी बातचीत गतिशीलता शामिल प्राप्त करने के लिए संभव है. जब शल्य चिकित्सा तकनीक ठीक से क्रियान्वित कर रहे हैं और पर्यावरण की स्थिति को ध्यान से नजर रखी lymphocytes विशेषता प्रवास गति, के रूप में चित्रा 2c, 2d और कहीं 13-14,16 में प्रदर्शन एक्ज़िबिट चाहिए. लिम्फोसाइटों भी प्रवास गति में मतभेद एल.एन. के दौर से गुजर इमेजिंग के उप क्षेत्रों के आधार पर प्रदर्शन कर सकते हैं, रक्त वाहिकाओं (के रूप में पोत रंगों का परिचय पर प्रकाश डाला द्वारा) के रूप में अतिरिक्त स्थलों के लिए समग्र इमेजिंग गुणवत्ता (यानी उचित तापमान नियंत्रण निर्धारित करने में मदद करेगा , एल.एन., आदि के लिए न्यूनतम आघात) 3,6,20 पूरक 1 वीडियो एक माउस जानुपृष्ठीय एलएन के रूप में चित्रा 2 में वर्णित समय चूक intravital इमेजिंग 2P - एल एस एम. 1x10 7 लिम्फोसाइटों के कुल अलग थे frओम ubiquitin-GFP + दाता माउस और adoptively में इमेजिंग से पहले 24 घंटे एक C57BL / 6 प्राप्तकर्ता माउस में नसों के द्वारा हस्तांतरित Xy (750 माइक्रोन x 750 माइक्रोन) की एक श्रृंखला प्रतिदीप्ति छवियों निश्चित z ढेर (5 माइक्रोन चरणों 13, कदम) के माध्यम से लिया गया एक xyz इमेजिंग (750 माइक्रोन x 750 माइक्रोन x 65 माइक्रोन) ढेर है, जो हर 20 सेकंड दोहराया गया था उपज 60 मिनट के एक कुल, गति विश्लेषण (आंकड़े -2 सी, 2 डी) के लिए एक xyzt इमेजिंग अनुक्रम में जिसके परिणामस्वरूप के लिए. प्लेबैक 450x = गति. पैमाने बार = 50 माइक्रोन. समय स्टाम्प = मिनट: सेकंड. पूरक वीडियो देखने के लिए यहाँ क्लिक करें . पूरक वीडियो 2 बी सेल कूप में पूरक 1 वीडियो में इमेजिंग अनुक्रम के दृश्य जू़म में - टी सेल क्षेत्र सीमा. प्लेबैक 450x = गति. पैमाने बार = 25 माइक्रोन. समय स्टाम्प = मिनट: सेकंड सीचाटना करने के लिए पूरक वीडियो देखने के लिए.
आकृति 1. माउस जानुपृष्ठीय एलएन इमेजिंग के लिए माउस धारक के निर्माण) माउस धारक विधानसभा की Schematics, ख) प्रतिनिधि intravital माउस तैयारी, ग) पूर्ण माउस धारक विधानसभा, घ) शल्य चिकित्सा प्रदर्शन के बाद घुटने की चक्की एलएन के विचारों को बंद करो.
चित्रा 2. GFP + लिम्फोसाइटों के प्रवास विश्लेषण(क) जानुपृष्ठीय एलएन में 3 डी माउस में एक प्राप्तकर्ता / C57BL 6 2P एल एस एम जानुपृष्ठीय एलएन की इमेजिंग अनुक्रम से लिया स्नैपशॉट adoptively 1x10 GFP 7 + लिम्फोसाइटों 1 इमेजिंग के लिए पहले दिन के साथ स्थानांतरित. पानी का छींटा लाइन बी सेल रोम की सीमा अर्थ, (ख) लिम्फोसाइट प्रवास के निरंतर इमेजिंग के 1 घंटे के दौरान पटरियों, समग्र लिम्फोसाइट प्रवास गति की ग) वितरण. गति मीन = 10.04 ± 4.26 माइक्रोन / मिनट (15,125 विश्लेषण पटरियों की कुल); घ) विभेदकों बी सेल कूप में पाया कोशिकाओं की सेलुलर प्रवास गति के वितरण (खुला सलाखों, मतलब = गति 8.79 ± 3.90 माइक्रोन / मिनट, कुल 1525 पटरियों का विश्लेषण ) और टी सेल क्षेत्र (बंद सलाखों, गति मतलब = 13.77 ± 5.93 माइक्रोन / मिनट, १,२५० विश्लेषण पटरियों की कुल). पैमाने बार = 50 माइक्रोन.
Discussion
Vivo में गतिशील सेलुलर व्यवहार के अध्ययन में एक बढ़ती रुचि के द्वारा स्वस्थानी इमेजिंग तकनीक, विशेष रूप से 2P एल एस एम, में उच्च संकल्प में हाल के अग्रिमों के साथ है. एक जीवित माउस के जानुपृष्ठीय एलएन पर 4D इमेजिंग तकनीक undisrupted सूक्ष्म वातावरण ऊतक के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिशील व्यवहार में इस तरह के विश्लेषण की अनुमति देता है. कई पूरे दृश्य स्पेक्ट्रम फैले डिटेक्टरों के साथ 2P - एल एस एम का उपयोग एकाधिक सेल आबादी के साथ - साथ इमेजिंग डेटा संग्रह परमिट. यह अब vivo में सेल विशिष्ट फ्लोरोसेंट संवाददाता (जैसे Ubiquitin EGFP, आरएफपी, या eCFP) के विभिन्न लेबल सेल कार्बनिक फ्लोरोसेंट सेल रंगों का उपयोग कर आबादी के दत्तक हस्तांतरण का उपयोग के साथ संयुक्त चूहों में के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है (जैसे CFSE , SNARF-1, और ट्रैकर ऑरेंज सेल) एलएन भीतर सेलुलर तंत्र और समारोह की जांच के. इसके अलावा विभिन्न नज़र रखी ग के बीच बातचीत के प्रत्यक्ष प्रेक्षण के लिएपक्ष आबादी, मल्टीप्लेक्स इमेजिंग डाटासेट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम (जैसे Imaris, BitPlane इंक) के लिए आगे सेल व्यवहार और समारोह को स्पष्ट करने के साथ आगे के विश्लेषण से गुजरना कर सकते हैं. संभावनाओं की एक विस्तृत सरणी के लिए सेलुलर बातचीत vivo में और सिलिको तकनीक में इन का उपयोग तंत्र का अध्ययन करने के लिए मौजूद है.
प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की मुख्य सीमा यहाँ वर्णित तकनीकी जटिलता सर्जरी दृष्टिकोण में निहित है. इस तकनीक प्रासंगिक शारीरिक रचना और सटीक तकनीकी प्रक्रियाओं और के रूप में इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक कौशल के साथ परिचित बनने के लिए कठोर प्रशिक्षण की आवश्यकता है. आगे उलझी कारकों एलएन अन्वेषण के दौरान ऊतकों को नुकसान को कम करने में कठिनाई, इमेजिंग दौरान ऊतक स्थिरता का अनुकूलन, और पहले एलएन के लिए थर्मल और लेजर चोट को रोकने और इमेजिंग प्रयोग के दौरान शामिल हैं. इन कारकों में से किसी भी गड़बड़ी से कम इष्टतम लसीका में परिणाम होगाocyte गतिशीलता और इसलिए इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करती है जिसके परिणामस्वरूप की उचित व्याख्या के साथ हस्तक्षेप करेगा.
Disclosures
लेखकों का खुलासा कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम - NCI 1R01CA154656, 1R21AI092299 NIAID, कैंसर अनुसंधान संस्थान, सेंट Baldrick फाउंडेशन, दाना फाउंडेशन, गेबरियल एन्जिल फाउंडेशन, और अमेरिका की हुंडई "आशा पर पहियों" कार्यक्रम मोटर्स से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isoflurane, USP | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Nair - hair removal lotion | Nair | ||
PBS, 1X | Cellgro | 21-040-CV | |
Heating pad | Watlow | ||
Heating Pad Controller | Watlow | ||
Air and O2 | Airgas | ||
Temperature probe | Harvard Apparatus | ||
Tweezers Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14101 | |
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved | World Precision Instruments, Inc. | 14141 | |
Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
Cover of 100x20 mm glass cell culture dish | Corning | 70165-102 | |
Cover of 100x20 mm polystyrene cell culture dish | Corning | 430167 | |
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 |
References
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