Intravital Imaging of the Mouse knäveckslymfknutas

Summary

Nyligen gjorda framsteg i 2-foton-mikroskopi har möjliggjort realtid

Abstract

Lymfkörtlar (LNS) är sekundära lymfoida organ, som är strategiskt placerade i hela kroppen för att möjliggöra infångning och presentation av främmande antigener från perifera vävnader att förvärma det adaptiva immunsvaret. Intill mellan medfödda och adaptiva immunsvar är LN en idealisk plats för att studera immunceller interaktioner ^1,2. Lymfocyter (T-celler, B-celler och NK-celler), dendritiska celler (DC) och makrofager innefattar huvuddelen av benmärg-härledda cellulära element i LN. Dessa celler är strategiskt placerade i LN att möjliggöra en effektiv övervakning av själv antigener och potentiella utländska antigener ^3-5. Den process genom vilken lymfocyter framgång stöter på likartade antigener är ett ämne för intensiv forskning under de senaste åren, och innebär en integrering av molekylära kontakter, inklusive antigenreceptorer, adhesionsmolekyler, kemokiner och stromala strukturer såsom fibro-retikulära nätverket ^2,6-12 . Före utvecklingen av hög upplösning i realtid fluorescerande in vivo imaging, utredare åberopas statiska bilder, som endast erbjuder svar om morfologi, läge och arkitektur. Även om dessa frågor är grundläggande i vår förståelse av immunceller beteende, medger de begränsningar som med denna teknik inte analys att tyda lymfocyter människohandel och miljö ledtrådar som påverkar dynamiska cellens beteende. Nyligen, utveckling av intravital två-foton laser scanning mikroskopi (2P-LSM) har gjort forskare att visa dynamiska rörelser och interaktioner av enskilda celler i levande LNS på plats ^12-16. I synnerhet har vi och andra tillämpat denna teknik för att bilden cellulär beteende och samspel inom Poplietallymfknutor LN, där dess kompakta, täta naturen erbjuder fördelen av multiplex datainsamling över en stor vävnad område med olika vävnader sub-strukturer ^11,17-18 . Det jagär viktigt att notera att denna teknik ger extra fördelar över explanterade tekniker vävnad imaging, som kräver avbrott av blod, lymfa flöde och slutligen de cellulära dynamiken i systemet. Dessutom explanterade vävnader har en mycket begränsad tidsfönster där vävnaden är lönsamt för avbildning efter uttagandet. Med rätt hydrering och övervakning av djurens miljöförhållanden, kan avbildning tiden avsevärt förlängas med detta intravital teknik. Här presenterar vi en detaljerad metod för framställning av musen poplitea LN för att utföra intravital avbildning.

Protocol

1. Mus Hållare Montering

1. Överlagra locket av en 100-mm petriskål av glas på toppen av en 100-mm plastlock petriskållock nedåt. Glaset ska knappt vidröra mittpunkt plastskål. Med användning av glas som en schablon, spåra ett märke på plastskål.
2. Använda en handborr (dvs. Dremel) för att avlägsna en del av en 100-mm plastskål lock för att skapa en halvmånformad plattformen. Denna halvmåneformade plastlock kommer att fungera som ett stöd för den övre bålen av musen (Figur 1a). Borra två hål på halvmåneformade lock för att säkra gasmasken med en metall twist slips. Fästa plastlock till kanten av den glas-Petri-skål med användning av superlim eller en ekvivalent stark adhesiv (fig 1b).
3. Limma locken på två välvda-cap PCR-rör (skuren i gångjärnet) 1 cm mellanrum i mitten av den nedre skålen för att förankra popliteala hud flikar.

2. Mus Framställning

1. Bedöva mus med isofluran (2 till 2,5% för induktion, från 1,5 till 2% för kirurgi / avbildning) blandas i 1:1 O _2: luftblandning vid en flödeshastighet av 1L/min med användning av en lACUC godkänt-förfarande. När musen är bedövad, säkra en gasmask över näsan med tejp. Bestäm om musen är helt bedövad av bristen på respons på tå och / eller klämmer svans. Nivån av isofluran kan justeras i enlighet därmed för att säkerställa att djuret helt sederades med en jämn, icke-ansträngd andning 60-80 andetag per minut.
2. Använda en elektrisk trimmer för att avlägsna hår på höger bakben och inguinala area av musen.
3. Borsta bort lösa hår och försiktigt på en blygsam lager Nair lotion på rakade området med en bomullspinne. Efter en minut av den ursprungliga ansökan, ta bort Nair och rengör den exponerade huden med en fuktigpappershandduk. Se till att musen är ren och torr innan du fortsätter.
4. Gör en liten 2 till 3 mm snitt med en sax på höger knä att exponera extensor sena.
5. Tillämpas Vetbond längs mitten av den mus-hållaren där musen kroppen och benet kommer att placeras. Försiktigt fast musen i hållaren, med höger knä ner för att exponera rätt Poplietallymfknutor fossa. Säkra höger knä senan med Vetbond mellan de 2 hudfliken innehavare att hjälpa till att stabilisera imaging fältet.
6. Stretch och tejpa armar och vänster ben till den övre plattformen av hållaren.
7. Använda en najningsband att fästa den gas masken på plats.
8. Placera hållaren under dissektion mikroskop. LN måste vara absolut stilla, oberoende av andningen rörelse musen. Därför måste försiktighetsåtgärder vidtas under utförandet av en operation för att optimera stabiliteten hos benet. Bestämma läget av svansen (typiskt över huvudet) som bidrar till den störstastabilitet åt höger ben och tejpen svansen nedåt.

3. Kirurgi

1. Medan under dissektionen omfattning, hålla temperaturen mus kroppen med hjälp av ett värmeelement eller en värmedyna. För framgångsrik avbildning av Poplietallymfknutor LN, är det viktigt att upprätthålla rätt kroppstemperatur under operationen samt att bevara vävnad fukt genom att ständigt tillämpa varm PBS för att den exponerade vävnaden.
2. Sterilisera huden med betadin. Användning steril sax, gör en mittlinjeincision genom huden vid rätt mitt på vaden, och fortsätter att skära vertikalt upp till det övre partiet av den högra låret.
3. Göra två horisontella snitt hud vid toppen av den vertikala snitt linjen för att skapa hud flikama på varje sida.
4. Dra in och lim ner båda hud flikar med Vetbond. Dra huden spänd före ansökan Vetbond kommer att ytterligare främja benet stabilitet, men se till att huden spänningen inte täppa till blodflödet (dvs. förändringar i vessel färg eller diameter). Fortsätter att limma ner andra områden av huden för att säkerställa stabilitet hos benet innan exponering av LN. Storleken på mus kommer att avgöra hur mycket extra hud behövs för att limmet ner. Vanligtvis kommer större möss kräva mer skal som ska limmas till innehavaren.
5. LN bör ligga inom Poplietallymfknutor fossa antingen till höger eller vänster vena poplitea, beroende på placeringen av musen på hållaren. Försiktigt separera LN från omgivande fettvävnad och muskler med hjälp av mikro-dissekera pincett och tång. För att minimera blödningar och trauma, använd snedhet teknik med mikro-dissekera pincett för att separera vävnader. Försiktigt utsätta Poplietallymfknutor LN utan att äventyra integritet afferenta och efferenta blodkärl och de afferenta lymfkärl.
6. För ökad stabilitet vävnad, kan ett kvadratiskt täckglas placeras över den fuktiga LN, nätt och jämnt vidrör LN och samtidigt undvika kärlocklusion. Täckglaset kan vara SECURED med modellera på vardera sidan av musen.
7. Fluorescerande fartyg färgämnen i olika storlekar (t.ex. TRITC-dextran, minst 70 kDa) kan införas intravenöst i detta skede för att hjälpa belysa den strukturella förhållandet och integritet LN under avbildning.

4. 2-Photon Imaging Acquisition **

1. När LN är tillräckligt utsatt och stabiliteten uppnås, omedelbart överföra hela enheten musen hållaren på mikroskopet scenen utrustad med en programmerbar temperaturåterkoppling kontrollerad uppvärmning pad i en miljö mikroskop kammare hölls vid 37 ° C. Tillsätt tillräckligt sterilt varmt (37 ° C) PBS eller HBSS att dränka den LN. Volymen kommer att ändras beroende på storleken och placeringen av musen. Alternativt kan varmt PBS eller HBSS appliceras direkt på dissekerade LN genom en fin glaspipett monteras på en peristaltisk pump och tejpade till kolumnen i immersion linsen målet. Flödet av vätska bör vara sådan att enstabil vatten-kolonn kan upprätthållas mellan linsen och vävnaden.
2. Bibehålla PBS eller HBSS temperatur vid 37 ° C med användning av en värmedyna med en återkoppling sond. En separat temperatursond bör placeras i mus hållaren för att bekräfta att temperaturen i PBS i intervallet från 36,5 till 37,5 ° C. En rektalsonden kan också användas för att övervaka kroppstemperaturen hos den experimentella musen hela avbildning sessionen.
3. Använd en epi-lysrör för att vägleda LN placering under målet. Skaffa fluorescerande bild travar med tidsintervall som är lämpliga för den önskade cellulär interaktion (vanligtvis 10 sekunder till 1 minut mellan varje xyz bildstapel).
4. Övervaka status djuret i mikroskopet kammaren ofta genom visuell inspektion eller genom att använda ett system för djur övervakning. Bestäm om musen är helt bedövad av bristen på respons på tå och / eller nypor spik, och en stadig, icke-ansträngd andning mellan 60-80 breaths per minut. Nivån av isofluran kan justeras i enlighet därmed för att säkerställa att djuret helt sövd. Med rätt övervakning och vätsketillförsel, kan djuren avbildas i 4-6 timmar, eller möjligen längre.
5. Efter avbildning experimentet euthanize djuret i en CO ₂ kammare med lACUC godkänd dödshjälp protokollet. Djuret ska inte tillåtas att ta sig ur narkos före eutanasi.

** Detta kirurgiska ingrepp kan också vara användbar för andra former av intravital avbildning än 2P-LSM.

5. Representativa resultat

Olika cirkulerande immunceller rekryteras till LN med olika hastigheter efter adoptiv överföring. För CD4 ⁺ och CD8 ⁺ lymfocyter, dessa celler börjar anlända till LN genom höga endotel venolen (HEV) minuter efter iv överföring med ett stort antal anländer till Poplietallymfknutor LN efter 2 till 4 timmar ^6,17-18. För B CELLS, kommer ett stort antal samlas efter 8 till 24 timmar ^19. Aktiverade DC ska börja visas i dränerande popliteala LN 8 till 16 timmar efter trampdyneinjektion ^3,11,16-17. Figur 2a visar att även utan andra landmärken, kan strukturer såsom B-celler folliklarna urskiljas enkelt genom att den runda sfäriska cellackumulering synliga under 2P-LSM ^19. Använda en endogen fluorescerande reporter såsom ubiquitin-GFP splenocyter (Figur 2, kompletterande Videos 1 och 2) kan man spåra dessa lymfocyter vandringar och beteenden i flera dagar upp till en vecka under icke-stimulerande fysiologiska förhållanden. Med flerkanaligt högkänsliga detektorer, är det möjligt att få ett dataset multiplex avbildning som omfattar strukturell information samt dynamik samspel mellan flera cellulära partners ^17,19.

När kirurgiska tekniker korrekt genomförs och miljöförhållanden övervakas noggrant, lymphocyTES bör uppvisa karakteristiska migrationshastigheten, såsom visas i Figur 2c, 2d och på andra ställen ^13-14,16. Lymfocyter kan också uppvisa skillnader i migration hastighet beroende på sub-regioner i LN genomgår avbildning, så kommer ytterligare landmärken som blodkärl (vilket betonas av införandet av fartygets färgämnen) hjälpa till att fastställa den övergripande bildkvalitet (dvs lämplig temperaturreglering , minimal trauma LN, etc.) ^3,6,20.

Figur 1. Konstruktion av en mus hållare för mus Poplietallymfknutor LN Imaging a) Schema av mus hållarenheten,. B) representant intravital musen förberedelse, c) Slutförd musen hållarenheten, d) närbilder av Poplietallymfknutor LN efter kirurgisk exponering.

Figur 2. Migrering analys av GFP + lymfocyteri knävecket LN. (en) 3D ögonblicksbild tas från 2P-LSM: en avbildning sekvensen av popliteal LN i en C57BL / 6 mus mottagaren överfördes adoptivt med 1x10 ⁷ GFP ⁺ lymfocyter 1 dag före avbildning. Streckade linjen anger gränsen för B-celler folliklar, (b) Spår av lymfocyter migration under 1 timmes kontinuerlig avbildning, c) Fördelning av den totala lymfocyter migration hastighet. Medelhastighet = 10,04 ± 4,26 m / min (totalt 15,125 analyserade spår), d) Differential cellulär migrering hastighet distribution av celler som finns i B-cellen follikeln (öppna staplar, medelhastighet = 8,79 ± 3,90 m / min; totalt 1,525 spår analyseras ) och T-cell zonen (fyllda staplar, medelhastighet = 13,77 ± 5,93 m / min; totalt 1.250 analyserade spår). Skalstreck = 50 pm.

Supplementär video 1. Timelapse intravital 2P-LSM: en avbildning av en mus popliteal LN såsom beskrivs i figur 2. En total av 1x10 ⁷ lymfocyter isolerades frOM en ubiquitin-GFP + donator mus och adoptivt överfördes intravenöst i en C57BL / 6 mottagaren mus 24 timmar före avbildning. En serie av xy (750 | im x 750 pm) fluorescensbilder togs genom fast z staplar (5 ^ m steg, 13 steg) till bildning av en xyz avbildning stapel (750 ^ m x 750 | im x 65 | im), som upprepades var 20: e sekund under totalt 60 minuter, vilket resulterade i en xyzt avbildning sekvens för hastigheten analys (figurerna 2c, 2d). Uppspelningshastighet = 450x. Skalstreck = 50 pm. Tidsstämpel = min: sek. Klicka här för att se extra video .

Kompletterande Video 2 inzoomat på grund av den avbildande sekvensen i Supplemental Video 1 på B-follikeln -. T-cell zonen gränsen. Uppspelningshastighet = 450x. Skalstreck = 25 | im. Tidsstämpel = min. Sek Cslicka här för att se extra video.

Discussion

Senaste framstegen inom högupplöst in situ avbildningstekniker, speciellt 2P-LSM, har åtföljts av en växande intresse för att studera dynamiska cellulära beteende i vivo. 4D bildteknik på Poplietallymfknutor LN av en levande mus tillåter sådana analyser i den dynamiska beteende immunceller inom ostört vävnaden mikro-miljö. Användningen av 2P-LSM med multipla detektorer som spänner över hela det synliga spektrumet medger samtidig avbildning datainsamling av flera cellpopulationer. Detta kan nu uppnås genom användning av in vivo-cell-specifika fluorescerande reportergrupper möss (t.ex. Ubikitin-EGFP,-RFP, eller-eCFP) i kombination med användningen av adoptiv överföring av differentiellt märkta cellpopulationer med organiska fluorescerande färgämnen cell (t.ex. CFSE , Snarf-1 och Cell Tracker Orange) att undersöka cellulära mekanismer och funktion i LN. Förutom den direkt observation av interaktioner mellan differentiellt spåras cEll populationer kan multiplex avbildning datasetet genomgår ytterligare analys med kommersiellt tillgängliga program bildbehandling program (t.ex. Imaris, Bitplane Inc.) för att ytterligare belysa cellens beteende och funktion. Ett brett utbud av möjligheter finns för att studera cellulära interaktionsmekanismer använder dessa in vivo och in silico tekniker.

Den största begränsningen av den experimentella metod som beskrivs här är den tekniska komplexiteten inneboende i operationen strategi. Denna teknik kräver rigorösa utbildning för att bli bekant med relevant anatomi och de exakta tekniska procedurer och färdigheter som krävs i detta protokoll. Ytterligare komplicerande faktorer är svårigheten att minimera vävnadsskada under LN prospektering, optimera vävnaden stabilitet under avbildning och förhindra termisk och laser skador på LN före och under avbildning experiment. Störning på någon av dessa faktorer kommer att resultera i mindre än optimal lymfanocyte motilitet och kommer därför störa korrekt tolkning av den erhållna bilddata analyser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Baxter Internationl Inc.	NDC 10019-773-60
Vetbond	3M	1469SB
Nair - hair removal lotion	Nair
PBS, 1X	Cellgro	21-040-CV
Heating pad	Watlow
Heating Pad Controller	Watlow
Air and O2	Airgas
Temperature probe	Harvard Apparatus
Tweezers Dumont #5	World Precision Instruments, Inc.	14101
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved	World Precision Instruments, Inc.	14141
Scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Cover of 100x20 mm glass cell culture dish	Corning	70165-102
Cover of 100x20 mm polystyrene cell culture dish	Corning	430167
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution)	Purdue Products L.P.	NDC 67618-150-08