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Summary

해부에서 배양 신경 explants<em> Xenopus laevis</em> 형광 융합 단백질을 표현하는 배아는 성장 콘 cytoskeletal 역학의 이미지 할 수 있습니다.

Abstract

축삭지도의 복잡한 과정은 크게 성장 축삭의 끝에서 동적 운동성 구조입니다 성장 콘에 의해 구동된다. 축삭의 가지 동안 성장 콘 앞으로의 성장 콘을 추진하고 정확하게 특정 목표 ^{1을 (를)} 찾을 수로 이동하기 위해 자사의 세포 골격을 조절하는 가이드 큐 정보를 여러 소스를 통합해야합니다. 이 통합은 cytoskeletal 수준에서 발생하는 방법을 계속 대두되고, cytoskeletal 단백질과 성장 콘에서 이펙터 역학 시험이 메커니즘의 해설을 할 수 있습니다. Xenopus laevis 성장 콘이됩니다 (직경 10-30 미크론) 충분히 큰 높은 수행 할 수 해상도 cytoskeletal 역학의 라이브 영상 (예 ^2-4)과는 다른 vertebrates에 비해 실험실 환경에서 분리하고 조작하기 쉽습니다. 개구리 성장 원뿔 마이크에 발달 신경 생물학 연구, 중요한 초기 분석을위한 고전 모델 시스템입니다rotubule 역학은 처음이 시스템은 ^5-7를 사용 발견되었습니다. 이 방법 ^8, 계란 수집하고 체외에서 수정 된, 유전자 발현을 조작하는 RNA 인코딩 휘황 태그 cytoskeletal 융합 단백질 또는 다른 구조로 주입 한 다음, 신경 튜브 단계로 발전 할 수있었습니다. 신경 튜브는 절개로 분리 한 후 배양하고 있으며, outgrowing neurites의 성장 콘은 이미징 있습니다. 이 문서에서는, 우리는이 방법 이후의 고해상도 이미지 분석을위한 문화 Xenopus laevis의 성장 콘에게있는 목표를 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 우리가 + TIP 융합 단백질 EB1-GFP의 예를 제공하지만,이 방법은 성장 콘 이내에 행동을 명료하게하다하는 단백질의 수에 적용 할 수 있습니다.

Protocol

참고 : 자세한 정보와 함께 우수한 프로토콜이 그 초점을 더 구체적으로 다음 단계에서 (예 : ^8-12) 다른 곳에서 출판 된대로 우리 만 간단한에서 처음 두 절에 나와있는 단계를 설명합니다. 또한, 라이브 세포 배양에 Xenopus 척추 뉴런 작업의 일반적인 프로토콜은 이전에 자세한 방법 제 ⁸ 조에서 출판되었습니다. 여기에 우리가 성공적으로 수행하고 3 단계에서 신경 튜브 해부 및 도금 프로토콜 문제를 해결하기에 충분한 정보를 제공 하긴하지만 우리는 매우,이 동영상에 대한 보완으로 그 문서를 검토하는 것이 좋습니다.

Xenopus 계란 1.에서 체외 수정

1. 계란 수집하기 전에 chorionic 생식샘 자극 호르몬 (400 단위 / 개구리) 12-18 시간으로 주입 된 여성 개구리의 알을 얻습니다. 1X 마크의 수정 벨소리 솔루션 (MMR) (0.1 M NaCl, 2.0 MM KCl, 1.0 MM MgSO _4, 2.0 MM CaCl ₂ 알을 수집, 5.0 밀리미터 HEPES, pH를 7.4 ^9).
2. 이전 ⁹ 설명한 바와 같이, 다진 고환과 체외에 계란을 비옥.
3. 적어도 20 분 후, 3-5 분 동안 1X MMR의 2 % 시스테인 (NaOH로 pH를 7.8로 이동)에 배아를 잠복기에 의해 배아 젤리 코트를 제거합니다. 3 : 0.1X MMR (88 MM NaCl, 1 MM KCl, 0.7 MM CaCl _2, 1 MM MgSO _4, 2.5 MM NaHCO _3, 5 MM HEPES, pH를 7.8) 또는 0.1X MBS (수정 바스의 식염, 1X 조리법)로 씻어 원하는 경우 상온에서 -5 시간, 유지 배아 주사 할 때까지, 또는 14-18의 장소 배아는 ° C 개발을 느리게합니다.

2. RNA의 Microinjection

참고 : 우리가 여기에 RNA 분사를 사용하는 동안, 이러한 기술은 RNA에 국한되지이며, DNA, 단백질, 또는 유전자 조작에 대한 수정 핵산도 사용 할 수 있으며, 이전에 ¹² 설명되어 있습니다.

1. cytoskeletal 또는 기타 구조물에게 AR을 라벨에 대한 실험 RNAs 이전e는 mMessage mMachine 키트 (Ambion)를 사용하여 선형화 된 DNA 템플릿에서 베꼈. mRNAs는 번역을 촉진하고 태아의 저하를 방지하기 위해 5 '캡과 3'polyadenylation 꼬리를 필요로합니다. pCS2 +이 목적을 위해 일반적으로 사용되는 벡터이며, 전사 키트 합성 반응 중에 캡 아날로그이 포함되어 있습니다. 우리는 nuclease 무료 ddH ₂ 0에서 베꼈 mRNA를 다시 중지 500 2000 사이의 재고 농도에서 μl / NG, -80 ° C. 프롬프트 저장 한 다음 전에 주사에, 분사에 대한 적절한 농도로 ddH ₂ 0에서 RNA를 희석. 만 작은 볼륨 배아에 주입되므로, 버퍼에 resuspending하는 것은 필요하지 않습니다. 우리의 마지막 주입 농도는 구조에 따라, 일반적으로 50-200 PG / NL이며, 많은 실험실은 전통적으로 총 볼륨의 약 1 %에 10 NL, 최대 주입하지만 우리는 일반적으로 배아 당 4 NL까지 주입합니다 배아. RNA는 다량의 유독되고, 배아 장군 당 복용 할 수 있습니다최대 5 NG로는 특정 유전자와 순도에 따라 용납 할 수 있지만 베드로, 10 PG에서 1 NG 범위. 그러나, 이미징 단백질 현지화에 대해 가장 낮은 수준 이상의 표현의 유물을 피하기 위해 주입해야합니다. 이 프로토콜의 EB1-GFP를위한 RNA는 배아 당 250 PG의 최종 금액으로 사용됩니다.
2. ~ 0.2 μm의 팁 직경, 바늘 풀러 ⁹ 모세 혈관을 당겨 주입 바늘을 준비합니다. 열 644, 어서 125, 속도 70, 시간 250,하지만 이러한 매개 변수가 시스템에 따라 달라질 및 필라멘트 (현재 2.5 mm를 사용하여 변경 한 후 다시 조정해야합니다 : 셔터 P-87 풀러으로, 우리는 다음과 같은 설정을 사용 폭 2.5 mm)입니다 사각형 상자 필라멘트. 현미경에서 퀼 같은 모양을 생성하기 위해 각도로 집게로 바늘 끝을 부러. 가 주입 바늘 (예 : ^11,12)을 깨고 작성을위한 다른 방법도 있지만, 우리는 작은 드롭 (0.5-1 μl)를 배치하여 RNA로 바늘을 작성의 뒤쪽 끝으로바늘. 태아에 microinjecting를 들어, 피코-주입기 (의료 시스템)되는 가장 일반적인 상업적으로 이용 가능한 분사 장치의 수, 두, 그리고 Nanoject (Drummond 과학)는 (자세한 내용은 ¹¹ 참조)가 있습니다. 우리는 일관 nanoliter 볼륨을 제공하기 위해 시간을 디지털로 설정 한 기간 동안 압축 가스를 사용하는 의료 장비 PLI-100 피코 주사기를 사용합니다. 사출 볼륨은 스테이지 마이크로 미터를 사용하여 각각의 새로운 micropipette에 대해 보정하여야하며, 주입 시간은 주입 RNA의 원하는 금액을 달성하기 위해 조정해야합니다.
3. 장소는 1에서 수정 된 배아를 – 4 – 세포 단계에 0.1X MMR의 5 % Ficoll을 포함하는 플라스틱 그릇에. 포셉과 장소에 배아를 개최하거나 개최 플랫폼 (plasticine 또는 치과 왁스 함께 그릇의 바닥을 준수 ~ 1mm 눈금이있는 플라스틱 메쉬,)에 넣어, (단계 2.1 참조 동물 blastomeres에 원하는 볼륨을 주입 ) 사출 볼륨에 대한 자세한 내용은. 몇 LOC에 배포배아 전역 ations은 동물 blastomeres의 각에 적어도 하나의 분사는 (예를 들어, 4 셀 단계의 배아를 위해, 우리는 일반적으로 2 셀 단계에 반면, 각각의 blastomere에 1-2 번 주사 더 균일 한 분포를 구하는 방법 배아, 우리는)​​ 각 blastomere에 2-4 번 주입. 2-4 세포 단계까지 대기의 이점은 배아가 정상적으로 분열을 시작하기 때문입니다. 시간이 관건입니다 경우, 당신은 주입 할 필요가 더 많은 배아가 아닌 최종 결과에서 거의 차이가있는 1-세포 단계에서 시작할 수 있습니다. 이전 단계의 배아가 함께 사용 및 특정 세포 유형 주사를 대상으로하지만, 우리가 일반적으로 더 폭 넓은 표현을 선호으로, 우리는 더 많은 주사의 필요성을 줄이기 위해 젊은 배아에 주입하는 경우이 특히 유용합니다 수 있습니다.
4. 0.1X MMR을 포함하는 플라스틱 접시에 주입 배아를 전송하고 무대 20-23 ^13까지 개발 할 수 있습니다. 14 22 배아를 배양 ° C 원하는 SPE에 따라개발 거구나. (~ 14 ° C.를 사용 후 다음 날 신경 튜브를 해부를 들어, 하루를 ~ 22 ° C. 사용)

3. 신경 튜브 해부 및 도금

1. 이전 dissections을 수행하려면, 문화 요리 ¹⁴ 준비합니다. 첫째, Mattek 또는 랩 – 테크 문화 요리 중의 coverslip의 표면, 이상 수영장, 1 시간 (또는에 품다 200 μg / PBS에 ML 폴리 라이신의 충분한 솔루션을 코팅 coverslips는, 하나는 앉아 유리 coverslips를 사용할 수 이미징 및 immunocytochemistry 유리 슬라이드에 나중에 게재 위치에 대한 페트리 접시)의 나사가 빠진 것. 기음과 PBS 3 회의 초과로 씻어, 건조 보자. 그런 다음 10 μg / PBS에 ML laminin과 코트 요리 37도에서 한 시간 동안 (우리는 일반적으로 충분한 표면 위로 수영장을 coverslip 당 500 μl를 사용). laminin 솔루션을 기음과 PBS의 초과로 3 회 씻어, laminin 코팅 표면은 무선 인터페이스에 노출 될 수 있도록하지 않도록주의 것. Replac문화 미디어 전자 PBS (50 % 벨소리의, 49% L-15 미디어, 1 % 태아 소 혈청, 플러스 50 μg / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신과 gentamycin, 산도 7.4 및 필터는 소독). (벨소리의 미디어, 115 MM NaCl, 2.5 MM KCl, 2 MM CaCl _2, 10 밀리미터 Hepes의 산도 7.4, 0.5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). 우리의 프로토콜이 미디어를 사용하지만, 그것은이 뉴런이 에너지 보유 감소 나이가 Xenopus 망막 신경절 문화에 대한 일반적인 풍부한 미디어, 것에주의해야한다. 청소년 척추의 문화는 생존 및 추가 성장 요인없이 순수 Ringers의 미디어 이상의 24 시간을위한 성장,이 참이 시스템을 사용의 장점 중 하나입니다 것입니다. 선택 사항 : 추가 NT3와 BDNF 축삭의 가지를 높이기 위해 문화 미디어 (25 μl / NG 각각의 최종 농도까지).
2. 때문에 주입 mRNA의 표현의 다양성 때문에, 배아는 형광의 모자이크가 발생할 수 있습니다. 이전 EXP 그 배아를 식별하는 dissections, 형광의 존재에 대한 화면 배아를 수행하기신경 튜브의 형광 융합 단백질을 ress. Steinberg의 미디어 (58 MM NaCl, 0.67 MM KCl, 0.44 MM 칼슘 (NO _{3) 2,} 1.3 MM MgSO _4, 4.6 MM 트리스 후 7.8로 산도로 가득 아가로 오스 코팅 플라스틱 그릇에 무대 20-23에서 형광 배아를 배치 autoclaved) ^5. 아가로 오스 코팅 요리, 0.1X MMR 그리고이 굳어에 녹인 1% 아가로 오스와 플라스틱 접시의 코트 바닥을 확인합니다. 손상은 이후의 분해 단계에서 사용되는 고급 집게와 텅스텐 바늘로 발생하지 않습니다 그래서이 부드러운 표면을 제공합니다. 단계 23 이후 배아의 해부가 가능하지만, 조직은 서로 밀접하게 준수하기 때문에 collagenase로 더 이상 치료를 필요로 더 도전합니다.
3. 박리 범위에서 고급 집게로 vitelline 멤브레인을 제거하고 절개 일련의하여, 배아의 전체 등쪽 부분을 분리. 한 포셉이 곳에서 배를 누른 상태 동안의 절개를 만들기 위해 두 번째를 사용하여중공 내부를 노출 할 수있는 배아의 측면. 그런 다음이를 신경 튜브를 포함하는 등쪽 부분을 분리 할 수​​ 반으로 배아를 절단, 배의 등쪽과 복부 반쪽 사이의 조직을 함께 공략하기 위해 두 집게를 사용합니다.
4. 조직을 느슨하게 할 수있는 회선 근에 15-20 분,하고 신선한 Steinberg의 솔루션과 플라스틱 아가로 오스 – 코팅 접시에 피펫 등의 explant에 대한 Steinberg의 미디어에 2 밀리그램 / ML collagenase있는 Eppendorf 튜브에 등쪽 explant를 놓습니다. 또는 explant은 전체 절개가 이후 수행 할 수 15 분에 대한 collagenase 솔루션을 포함하는 페트리 접시에 배치 할 수 있습니다.
5. 포셉 한 쌍의를 사용하여 부드럽게 등쪽 표피와 복부 notochord에서 신경 튜브를 해부. 표피와 기본 조직 사이의 집게의 끝을 밀어 천천히 신경 튜브 아래를 공개, 표피를 잡아. 그런 다음 사이에 팁을 슬라이드에 조직을 개최 한 집게를 사용하여 다른신경 튜브 및 notochord. 마지막으로, 관의 양쪽에 somites을 제거 포셉을 사용합니다.
6. 단계 3.1에서 설명한 바와 같이, 문화, 미디어로 가득한 아가로 오스 – 코팅 접시에 신경 튜브를 전송합니다.
7. 여러 신경 튜브의 수집 후, 밖으로 확산, 중간 (단계 3.1에서 작성)로 가득 한 후 날카롭게 텅스텐 바늘이나 포셉, 그리고 플레이트 문화 요리의 조각을 사용하여 수많은 조각 (약 20 전체 튜브가 분리되어있는 경우)으로 잘라 균등 행의 explants.
8. 이 연결 셀을 방해하기 때문에 도금 후, 요리를 이동하지 않습니다. 20-22 주위 도금 신경 튜브 explants를 품다 ° C. 우리는 일반적으로 하룻밤 실온에서 벤치에 세포의 요리를 두십시오. Xenopus laevis 뉴런의 장점 중 하나는 CO ₂ 수준 또는 온도를 조절 세포 배양을위한 특별 보육이 필요하지 않습니다 것입니다. Neurites과 성장 콘은 실온 12 준수하고 이미징 할 수 있습니다도금 후 -24 시간, 가지가 성장 요인의 추가로 가속 할 수는 있습니다. 일반적으로, RNA 또는 플라스미드 제품의 표정은 세포 사이의 변수 표현 될 것이고, 따라서 성장 콘 사이의 형광 표현 수준의 범위가있을 수 있습니다. 이 특정 구조에 따라 달라집니다 있지만 우리는 도금 후 48 시간 이상 지속하는 형광 단백질의 RNA 발현을 관찰했습니다.

4. 대표 결과

그림 1A에 요약되어있는 프로토콜을 따라하면 건강 올바르게 – 해부 및 배양 신경 explants는 laminin / 그림 1b에 도시 된 바와 같이 폴리 라이신 기판에 모든 방향으로 다수의 axons 또는 neurites을 보내드립니다. axons의 끝을 성장 콘은 이오를 검사하기 위해 이미지 전체 운동성 역학에 그림 1C에서 볼 DIC 광학, 또는 고해상도 형광 현미경에 의해 이미징 할 수 있습니다휘황 태그 cytoskeletal 단백질의 calization 예를 들어, EB1-GFP는 그림 1D에 표시됩니다.

그림 1. 실험 프로토콜과 예상 결과의 요약. A) 프로토콜 흐름 차트입니다. 일 3 절개에 대한 자세한 내용은 동영상을 참조하십시오. 전체 신경 튜브는 약 20 동일 크기의 조각으로 잘라 coverslip에 행에 고르게 분산되어야한다. 이 만화에서, 가위는 훌륭한 포셉으로 조직을 절단 대표 그려져있다. CG chorionic 생식샘 자극 호르몬 B) explant (왼쪽 상단 모서리에있는 explant)에서 성장 axons 또는 neurites의 DIC 이미지입니다. 성장 축삭의 끝에서 성장 콘의 C) 높은 배율 이미지입니다. 성장 콘에서 EB1-GFP의 D) 형​​광 현미경 이미지입니다. 스케일 바는 10 μm이 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

Discussion

조건이 적절한 경우 Xenopus laevis 신경 explants는 laminin / 폴리 라이신 기판에 도금 후 24 시간으로 매우 강력한 방식으로 neurites을 보낼 수 있습니다. 일반적으로 길이가 100 μm 이상 있지만,이 기판과, 성장 콘은 높은 운동성하고 explant에서 바깥쪽으로 모든 방향으로 연장, 1 mm까지의 축삭의 길이를 얻을 수 있습니다. neurites 알아 성장하지 않으면 경우가이 이유 제한된 수의가 있습니다. 하나의 가능성은 신경 explants가 제대로 음식을 준수하지 않은 것입니다. 실수로 도금 한 후 요리를 이동하여 첨부 파일에 방해가되지해야합니다. 또한, laminin 및 폴리 라이신 – 코팅 요리는 모든 신선하게 조리 된 시약 제대로 만든 있는지 확인하십시오. 가지의 부족에 대한 또 다른 가능성은 세포 배양 미디어 조건이 최적이 아닐 수 있습니다. 모든 미디어 솔루션이 제대로 책정되었는지 확인하기 위해 프로토콜과 계산을 다시 확인. 마지막으로, 가능입니다배아는 신경 튜브 단계로 발전 할 수 있는지,이 문제가 될 가능성이 높습니다 있지만 explants 취득 된에서 태아가 건강에 해로운 수 있습니다. 그러나, 그 지속적인 개발이 발생하기 위해 dissections과 함께 0.1X MMR에서 배양 완전 그대로 태아를 유지하는 것이 가장 좋습니다.

이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 신경 튜브 해부 있습니다. 많은 모델 시스템 배아 마이크로 dissections에 비해이 비교적 간단 기법이며, Xenopus laevis의 배아는 해부에 대한 최대의 가장 관대 한 생물 중 하나입니다. 실험은 배아 dissections를 수행에 완전히 새로운 경우,이 단계 (최상 2-3 세션에 흩어져) 완벽하게하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 다른 한 후 표피 제거로 시작하는 것을 선호하고있는 동안 collagenase 처리 후 일부는 다음 따라서 분리 된 신경 튜브의 결과, 표피 다음 중배엽, notochord, 그리고 somites를 제​​거하는 것을 선호신경 튜브의 다른 조직을 분리. 그것은 각 연구자에 최선을 작동 결정하기 위해 두 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 또한 그 절연 동안 신경 튜브에 너무 많은 부담을하지 않도록주의. 이 튜브에 긴장을 줄이고 조기에 fragmenting 않도록하기 위해, 신경 튜브의 다른 조직을 제거하기보다는 다른 조직에서 신경 튜브를 제거하는 것이 좋습니다. 주변 조직의 신경 튜브에 너무 점착성의 경우 마지막으로, 다음 몇 분 더 collagenase 솔루션에 explant을 다시 배치합니다. 이 훨씬 쉽게, 특히 주변 조직, 표피에서 신경 튜브의 분리를 할 것입니다. 이전 배아는 더 이상 치료, 최대 단계에 45 분 이상 28 배아로 필요로 collagenase 치료의 길이는, 배의 무대에 따라 달라집니다.

배양 신경 튜브 explants뿐만 아니라, 신경 튜브는 orde에서 이전 도금에 dissociated 될 수이미지 하나의 셀에 대한 연구. 이 방법에 대한 프로토콜은 ^{8, 15에} 설명되어 있습니다. 이 방법의 이점은 neuronal 형태이며, 전지 본체는 explant 내부에 왜곡되지 않으므로 neurite 길이는 검사를 할 수 있습니다. 또한, 신경 explants도 다양한 패턴 기판에서 배양 할 수 있습니다. 예를 들어,지도 큐 "스트라이프 분석은"문화 ^{16, 17에} 기판 테두리가 발생에 대한 응답으로 성장 콘 역학의 변화를 평가하기 위해 사용되었습니다. 신호의 스트라이프 패턴을 준비하기위한 자세한 프로토콜은 ¹⁸ 설명되어 있습니다. 성장 콘이지도 큐 운영 의사 결정을 겪 동안이 cytoskeletal 역학 분석 할 수 있습니다.

신경 explant의 배양 실험에 Xenopus의 laevis를 사용하는 이점이 있습니다. 다른 시스템에 비해 배양이 기본 뉴런은 낮은 비용을 확보하고 필요로하는 비교적 쉽습니다. 그들이 실온에서 배양 및 이미징 될 수 있듯이,비싼 인큐베이터는 Xenopus의 배아가 쉽게 접근 할 수 있습니다. 필요하지 않습니다 및 대량으로 얻을 수있다, 그들은 신속하게 개발하고, 그들은 최소한의 교육으로 해부 할 수있을만큼 큽니다. 따라서,이 시스템은 특히 교육 연구소에 적합합니다.

개구리 배아를 사용하는 또 다른 장점은 사람들이 특정 실험의 필요에 따라 유전자 mRNA 또는 단백질 표현 수준의 조작에 복종 할 의무가있는 점입니다. 예를 들어, mRNA를 사용하는 장점은, 농도 및 주입 볼륨이 조심스럽게 반면에, DNA를 주입하는 동안 결과로 표현 수준을 제어 할 titrated 수 있다는 것입니다 유전자 발현에 의해 제어 할 수있는 유전자 변형 배아의 생성을 허용 공간이나 시간적 특정 발기인 (예 : ^19). 따라서이 신경 explant 방법은 축삭의 가지 중 단백질 수준의 관심의 동작과 기능을 이해에 대해 여러 상황에 적용 할 수있는및 성장 콘 역학.

Materials

Chorionic Gonadotropin	Argent Labs	C-HCG-ON-10
Cysteine	Sigma-Aldrich	52-90-4
mMessage mMachine kit	Ambion	AM1340
Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID)	FHC, Inc.	30-31-0
Ficoll	Sigma-Aldrich	F2637
Dumont #5 Biologie Inox Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Collagenase	Sigma-Aldrich	9001-12-1
Mattek dishes	Mat Tek Corporation	P35G-1.5-14-C
L-15	Invitrogen	21083-027
Poly-l-lysine	Sigma-Aldrich	P-1399
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
NT3	Sigma-Aldrich	N1905
BDNF	Sigma-Aldrich	B3795