해부에서 배양 신경 explants<em> Xenopus laevis</em> 형광 융합 단백질을 표현하는 배아는 성장 콘 cytoskeletal 역학의 이미지 할 수 있습니다.
축삭지도의 복잡한 과정은 크게 성장 축삭의 끝에서 동적 운동성 구조입니다 성장 콘에 의해 구동된다. 축삭의 가지 동안 성장 콘 앞으로의 성장 콘을 추진하고 정확하게 특정 목표 1을 (를) 찾을 수로 이동하기 위해 자사의 세포 골격을 조절하는 가이드 큐 정보를 여러 소스를 통합해야합니다. 이 통합은 cytoskeletal 수준에서 발생하는 방법을 계속 대두되고, cytoskeletal 단백질과 성장 콘에서 이펙터 역학 시험이 메커니즘의 해설을 할 수 있습니다. Xenopus laevis 성장 콘이됩니다 (직경 10-30 미크론) 충분히 큰 높은 수행 할 수 해상도 cytoskeletal 역학의 라이브 영상 (예 2-4)과는 다른 vertebrates에 비해 실험실 환경에서 분리하고 조작하기 쉽습니다. 개구리 성장 원뿔 마이크에 발달 신경 생물학 연구, 중요한 초기 분석을위한 고전 모델 시스템입니다rotubule 역학은 처음이 시스템은 5-7를 사용 발견되었습니다. 이 방법 8, 계란 수집하고 체외에서 수정 된, 유전자 발현을 조작하는 RNA 인코딩 휘황 태그 cytoskeletal 융합 단백질 또는 다른 구조로 주입 한 다음, 신경 튜브 단계로 발전 할 수있었습니다. 신경 튜브는 절개로 분리 한 후 배양하고 있으며, outgrowing neurites의 성장 콘은 이미징 있습니다. 이 문서에서는, 우리는이 방법 이후의 고해상도 이미지 분석을위한 문화 Xenopus laevis의 성장 콘에게있는 목표를 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 우리가 + TIP 융합 단백질 EB1-GFP의 예를 제공하지만,이 방법은 성장 콘 이내에 행동을 명료하게하다하는 단백질의 수에 적용 할 수 있습니다.
참고 : 자세한 정보와 함께 우수한 프로토콜이 그 초점을 더 구체적으로 다음 단계에서 (예 : 8-12) 다른 곳에서 출판 된대로 우리 만 간단한에서 처음 두 절에 나와있는 단계를 설명합니다. 또한, 라이브 세포 배양에 Xenopus 척추 뉴런 작업의 일반적인 프로토콜은 이전에 자세한 방법 제 8 조에서 출판되었습니다. 여기에 우리가 성공적으로 수행하고 3 단계에서 신경 튜브 해부 및 도금 프로토콜 문제를 해결하기에 충분한 정보를 제공 하긴하지만 우리는 매우,이 동영상에 대한 보완으로 그 문서를 검토하는 것이 좋습니다.
Xenopus 계란 1.에서 체외 수정
2. RNA의 Microinjection
참고 : 우리가 여기에 RNA 분사를 사용하는 동안, 이러한 기술은 RNA에 국한되지이며, DNA, 단백질, 또는 유전자 조작에 대한 수정 핵산도 사용 할 수 있으며, 이전에 12 설명되어 있습니다.
3. 신경 튜브 해부 및 도금
4. 대표 결과
그림 1A에 요약되어있는 프로토콜을 따라하면 건강 올바르게 – 해부 및 배양 신경 explants는 laminin / 그림 1b에 도시 된 바와 같이 폴리 라이신 기판에 모든 방향으로 다수의 axons 또는 neurites을 보내드립니다. axons의 끝을 성장 콘은 이오를 검사하기 위해 이미지 전체 운동성 역학에 그림 1C에서 볼 DIC 광학, 또는 고해상도 형광 현미경에 의해 이미징 할 수 있습니다휘황 태그 cytoskeletal 단백질의 calization 예를 들어, EB1-GFP는 그림 1D에 표시됩니다.
그림 1. 실험 프로토콜과 예상 결과의 요약. A) 프로토콜 흐름 차트입니다. 일 3 절개에 대한 자세한 내용은 동영상을 참조하십시오. 전체 신경 튜브는 약 20 동일 크기의 조각으로 잘라 coverslip에 행에 고르게 분산되어야한다. 이 만화에서, 가위는 훌륭한 포셉으로 조직을 절단 대표 그려져있다. CG chorionic 생식샘 자극 호르몬 B) explant (왼쪽 상단 모서리에있는 explant)에서 성장 axons 또는 neurites의 DIC 이미지입니다. 성장 축삭의 끝에서 성장 콘의 C) 높은 배율 이미지입니다. 성장 콘에서 EB1-GFP의 D) 형광 현미경 이미지입니다. 스케일 바는 10 μm이 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
조건이 적절한 경우 Xenopus laevis 신경 explants는 laminin / 폴리 라이신 기판에 도금 후 24 시간으로 매우 강력한 방식으로 neurites을 보낼 수 있습니다. 일반적으로 길이가 100 μm 이상 있지만,이 기판과, 성장 콘은 높은 운동성하고 explant에서 바깥쪽으로 모든 방향으로 연장, 1 mm까지의 축삭의 길이를 얻을 수 있습니다. neurites 알아 성장하지 않으면 경우가이 이유 제한된 수의가 있습니다. 하나의 가능성은 신경 explants가 제대로 음식을 준수하지 않은 것입니다. 실수로 도금 한 후 요리를 이동하여 첨부 파일에 방해가되지해야합니다. 또한, laminin 및 폴리 라이신 – 코팅 요리는 모든 신선하게 조리 된 시약 제대로 만든 있는지 확인하십시오. 가지의 부족에 대한 또 다른 가능성은 세포 배양 미디어 조건이 최적이 아닐 수 있습니다. 모든 미디어 솔루션이 제대로 책정되었는지 확인하기 위해 프로토콜과 계산을 다시 확인. 마지막으로, 가능입니다배아는 신경 튜브 단계로 발전 할 수 있는지,이 문제가 될 가능성이 높습니다 있지만 explants 취득 된에서 태아가 건강에 해로운 수 있습니다. 그러나, 그 지속적인 개발이 발생하기 위해 dissections과 함께 0.1X MMR에서 배양 완전 그대로 태아를 유지하는 것이 가장 좋습니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 신경 튜브 해부 있습니다. 많은 모델 시스템 배아 마이크로 dissections에 비해이 비교적 간단 기법이며, Xenopus laevis의 배아는 해부에 대한 최대의 가장 관대 한 생물 중 하나입니다. 실험은 배아 dissections를 수행에 완전히 새로운 경우,이 단계 (최상 2-3 세션에 흩어져) 완벽하게하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 다른 한 후 표피 제거로 시작하는 것을 선호하고있는 동안 collagenase 처리 후 일부는 다음 따라서 분리 된 신경 튜브의 결과, 표피 다음 중배엽, notochord, 그리고 somites를 제거하는 것을 선호신경 튜브의 다른 조직을 분리. 그것은 각 연구자에 최선을 작동 결정하기 위해 두 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 또한 그 절연 동안 신경 튜브에 너무 많은 부담을하지 않도록주의. 이 튜브에 긴장을 줄이고 조기에 fragmenting 않도록하기 위해, 신경 튜브의 다른 조직을 제거하기보다는 다른 조직에서 신경 튜브를 제거하는 것이 좋습니다. 주변 조직의 신경 튜브에 너무 점착성의 경우 마지막으로, 다음 몇 분 더 collagenase 솔루션에 explant을 다시 배치합니다. 이 훨씬 쉽게, 특히 주변 조직, 표피에서 신경 튜브의 분리를 할 것입니다. 이전 배아는 더 이상 치료, 최대 단계에 45 분 이상 28 배아로 필요로 collagenase 치료의 길이는, 배의 무대에 따라 달라집니다.
배양 신경 튜브 explants뿐만 아니라, 신경 튜브는 orde에서 이전 도금에 dissociated 될 수이미지 하나의 셀에 대한 연구. 이 방법에 대한 프로토콜은 8, 15에 설명되어 있습니다. 이 방법의 이점은 neuronal 형태이며, 전지 본체는 explant 내부에 왜곡되지 않으므로 neurite 길이는 검사를 할 수 있습니다. 또한, 신경 explants도 다양한 패턴 기판에서 배양 할 수 있습니다. 예를 들어,지도 큐 "스트라이프 분석은"문화 16, 17에 기판 테두리가 발생에 대한 응답으로 성장 콘 역학의 변화를 평가하기 위해 사용되었습니다. 신호의 스트라이프 패턴을 준비하기위한 자세한 프로토콜은 18 설명되어 있습니다. 성장 콘이지도 큐 운영 의사 결정을 겪 동안이 cytoskeletal 역학 분석 할 수 있습니다.
신경 explant의 배양 실험에 Xenopus의 laevis를 사용하는 이점이 있습니다. 다른 시스템에 비해 배양이 기본 뉴런은 낮은 비용을 확보하고 필요로하는 비교적 쉽습니다. 그들이 실온에서 배양 및 이미징 될 수 있듯이,비싼 인큐베이터는 Xenopus의 배아가 쉽게 접근 할 수 있습니다. 필요하지 않습니다 및 대량으로 얻을 수있다, 그들은 신속하게 개발하고, 그들은 최소한의 교육으로 해부 할 수있을만큼 큽니다. 따라서,이 시스템은 특히 교육 연구소에 적합합니다.
개구리 배아를 사용하는 또 다른 장점은 사람들이 특정 실험의 필요에 따라 유전자 mRNA 또는 단백질 표현 수준의 조작에 복종 할 의무가있는 점입니다. 예를 들어, mRNA를 사용하는 장점은, 농도 및 주입 볼륨이 조심스럽게 반면에, DNA를 주입하는 동안 결과로 표현 수준을 제어 할 titrated 수 있다는 것입니다 유전자 발현에 의해 제어 할 수있는 유전자 변형 배아의 생성을 허용 공간이나 시간적 특정 발기인 (예 : 19). 따라서이 신경 explant 방법은 축삭의 가지 중 단백질 수준의 관심의 동작과 기능을 이해에 대해 여러 상황에 적용 할 수있는및 성장 콘 역학.
The authors have nothing to disclose.
Chorionic Gonadotropin | Argent Labs | C-HCG-ON-10 | |
Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC, Inc. | 30-31-0 | |
Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | |
Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P-1399 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
NT3 | Sigma-Aldrich | N1905 | |
BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 |