해부에서 배양 신경 explants Xenopus laevis 형광 융합 단백질을 표현하는 배아는 성장 콘 cytoskeletal 역학의 이미지 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
축삭지도의 복잡한 과정은 크게 성장 축삭의 끝에서 동적 운동성 구조입니다 성장 콘에 의해 구동된다. 축삭의 가지 동안 성장 콘 앞으로의 성장 콘을 추진하고 정확하게 특정 목표 1을 (를) 찾을 수로 이동하기 위해 자사의 세포 골격을 조절하는 가이드 큐 정보를 여러 소스를 통합해야합니다. 이 통합은 cytoskeletal 수준에서 발생하는 방법을 계속 대두되고, cytoskeletal 단백질과 성장 콘에서 이펙터 역학 시험이 메커니즘의 해설을 할 수 있습니다. Xenopus laevis 성장 콘이됩니다 (직경 10-30 미크론) 충분히 큰 높은 수행 할 수 해상도 cytoskeletal 역학의 라이브 영상 (예 2-4)과는 다른 vertebrates에 비해 실험실 환경에서 분리하고 조작하기 쉽습니다. 개구리 성장 원뿔 마이크에 발달 신경 생물학 연구, 중요한 초기 분석을위한 고전 모델 시스템입니다rotubule 역학은 처음이 시스템은 5-7를 사용 발견되었습니다. 이 방법 8, 계란 수집하고 체외에서 수정 된, 유전자 발현을 조작하는 RNA 인코딩 휘황 태그 cytoskeletal 융합 단백질 또는 다른 구조로 주입 한 다음, 신경 튜브 단계로 발전 할 수있었습니다. 신경 튜브는 절개로 분리 한 후 배양하고 있으며, outgrowing neurites의 성장 콘은 이미징 있습니다. 이 문서에서는, 우리는이 방법 이후의 고해상도 이미지 분석을위한 문화 Xenopus laevis의 성장 콘에게있는 목표를 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 우리가 + TIP 융합 단백질 EB1-GFP의 예를 제공하지만,이 방법은 성장 콘 이내에 행동을 명료하게하다하는 단백질의 수에 적용 할 수 있습니다.
프로토콜
참고 : 자세한 정보와 함께 우수한 프로토콜이 그 초점을 더 구체적으로 다음 단계에서 (예 : 8-12) 다른 곳에서 출판 된대로 우리 만 간단한에서 처음 두 절에 나와있는 단계를 설명합니다. 또한, 라이브 세포 배양에 Xenopus 척추 뉴런 작업의 일반적인 프로토콜은 이전에 자세한 방법 제 8 조에서 출판되었습니다. 여기에 우리가 성공적으로 수행하고 3 단계에서 신경 튜브 해부 및 도금 프로토콜 문제를 해결하기에 충분한 정보를 제공 하긴하지만 우리는 매우,이 동영상에 대한 보완으로 그 문서를 검토하는 것이 좋습니다.
Xenopus 계란 1.에서 체외 수정
- 계란 수집하기 전에 chorionic 생식샘 자극 호르몬 (400 단위 / 개구리) 12-18 시간으로 주입 된 여성 개구리의 알을 얻습니다. 1X 마크의 수정 벨소리 솔루션 (MMR) (0.1 M NaCl, 2.0 MM KCl, 1.0 MM MgSO 4, 2.0 MM CaCl 2 알을 수집, 5.0 밀리미터 HEPES, pH를 7.4 9).
- 이전 9 설명한 바와 같이....
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토론
조건이 적절한 경우 Xenopus laevis 신경 explants는 laminin / 폴리 라이신 기판에 도금 후 24 시간으로 매우 강력한 방식으로 neurites을 보낼 수 있습니다. 일반적으로 길이가 100 μm 이상 있지만,이 기판과, 성장 콘은 높은 운동성하고 explant에서 바깥쪽으로 모든 방향으로 연장, 1 mm까지의 축삭의 길이를 얻을 수 있습니다. neurites 알아 성장하지 않으면 경우가이 이유 제한된 수의가 있습니다. 하나의 가능성은 신경 explants가 제대로 음식을 준수하지 않은 것입니다. 실수로 도금 한 후 요리를 이동하여 첨부 파일에 방해가되지해야합니다. 또한, laminin 및 폴리 라이신 - 코팅 요리는 모든 신선하게 조리 된 시약 제대로 만든 있는지 확인하십시오. 가지의 부족에 대한 또 다른 가능성은 세포 배양 미디어 조건이 최적이 아닐 수 있습니다. 모든 미디어 솔루션이 제대로 책정되었는지 확인하기 위해 프로토콜과 계산을 다시 확인. 마지막으로, 가능입니다배아는 신경 튜.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
저자는 개구리 시설의 사용에 대한 교육과 Kirschner 연구실에 밥 프리먼을 감사하고, 지원 밴 Vactor 연구실의 구성원 것이다. 우리는 그림 1의 이미지에 빛을 현미경으로 도움이 하버드 의과 대학에서 니콘 이미징 센터를 감사합니다. 이 작품은 다음에 의해 추진하는 사업 : NRSA NIH 교제와 랄에 NIH K99 교제, 기초 과학 협력 기금 ( https://bsp.med.harvard.edu/ AEF에), 그리고 NIH RO1 NS035909을 DVV에
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| Chorionic 생식샘 자극 호르몬 | 은의 화학 연구소 | C-HCG-ON-10 | |
| 시스테인 | 시그마 - 알드리치 | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine 키트 | Ambion | AM1340 | |
| Borosil의 바늘에게 1.2 mm를 모세관 (OD) × 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 | |
| Ficoll | 시그마 | F2637 | |
| 뒤몽 # 5 Biologie Inox 집게 | 정밀 과학 도구 | 11252-20 | |
| Collagenase | 시그마 - 알드리치 | 9001-12-1 | |
| Mattek 요리 | 매트 테크 주식회사 | P35G - 1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| 폴리-L-라이시NE | 시그마 | P-1399 | |
| Laminin | 시그마 | L2020 | |
| NT3 | 시그마 | N1905 | |
| BDNF | 시그마 | B3795 |
참고문헌
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosc....
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