Summary
在2001年，研究人员在加州大学洛杉矶分校所述的成体干细胞群的分离，称为脂肪来源的干细胞或的ASC，从脂肪组织。本文概述了先进的结构陶瓷的使用手册，酶消化协议使用胶原酶lipoaspirates隔离。
Abstract
2001年，研究人员在加州大学洛杉矶分校，描述从抽脂的脂肪组织，他们最初被称为脂肪抽吸物处理的细胞或PLA细胞成体干细胞的新的人口的隔离。从那时起，这些干细胞已被更名为脂肪来源的干细胞或先进的结构陶瓷和已移居到成为干细胞研究和再生医学领域最热门的成体干细胞的人群之一。数以千计的文章，现在描述了使用先进的结构陶瓷的各种再生动物模型，包括骨再生，周围神经损伤修复和心血管工程。最近的文章开始描述的用途无数在诊所先进的结构陶瓷。在这篇文章中所示的协议概述了从大量的整容手术获得lipoaspirates手动和酶隔离先进的结构陶瓷的基本程序。这个协议可以很容易地放大或缩小，以accommod吃脂肪抽吸物的体积，并且可以适于通过隔离abdominoplasties和其他类似的方法获得来自脂肪组织的ASC。
Introduction
在2001年，来自脂肪组织的多能干细胞的推定的人口在杂志组织工程1进行了说明。这些细胞被赋予由于其推导通过整容手术获得的名称处理脂肪抽吸物或PLA细胞处理脂肪抽吸物组织。在这篇文章中所描述的隔离方法是基于从脂肪组织2基质血管组分（SVF）的隔离现有的酶战略。将SVF已被定义为红细胞，成纤维细胞，内皮细胞，平滑肌细胞，周细胞和前脂肪细胞，尚未粘附到组织培养基质2，3一最小加工人口。这SVF随时间的培养，提出消除许多这些污染细胞群，从而导致粘附，成纤维细胞群。这些成纤维细胞已在文献中在过去40年被认定为被预脂肪细胞。然而，我们的研究小组证明，这些细胞具有多能的中胚层，并改名为贴壁SVF人口PLA细胞。众多其他研究小组随后的研究加入到这一潜在的，既暗示内胚层和外胚层电位（综述见4）。自那时起，无数的附加条款，这些细胞已在文献中出现。为了提供某种类型的共识，术语脂肪来源的干细胞或先进的结构陶瓷在第二届年度IFATS会上获得通过。因此，该术语ASC将在本文中被使用。
在这篇文章中所描述的协议是一个相对简单的过程，需要标准的实验室设备，并使用简单的试剂如磷酸缓冲液，标准组织培养基试剂和胶原酶。它可以产生的ASC取决于起始脂肪组织体积和随后的C量大量ulture时间。然而，如此大量的脂肪组织的处理可呈现可使用该协议来减轻至一定程度的一些物理问题。此外，该协议不要求无菌组织培养设施和批准的生物安全罩，因此必须使用经认可的组织培养设施。这个要求也可以降低ASC人口的效用在临床应用中，除非他们被隔离在良好生产规范设计的分离和扩增材料的临床应用（GMP）认证的工厂。作为一种替代方法，自动化系统，可以在手术室隔离的ASCs在一个封闭的系统将避免这个关键问题，并允许直接使用的ASC的而不需要任何随后的体外扩增 。迄今为止，有六个自动化系统，是市售的用于细胞从人体组织的隔离。这些系统使得可以以分离显著数量从它的立即下收获大量脂肪组织的ASCs的。这些先进的结构陶瓷可随后被重新引入到患者体内，适用于各种不必离开手术室再生的目的，而病人。除了这个协议描述的ASC的手动隔离，一个协议，用于使用Celution系统的ASC自动隔离在一个同伴文章还给出。
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Protocol
这里显示的协议描述的ASC的使用酶消化和差速离心通过整容手术获得lipoaspirates手动隔离。该协议最初是发表在该杂志组织工程于2001年1，其中所产生的细胞被称为，因为从lipoaspirates他们的隔离处理脂肪抽吸物细胞或PLA细胞。然而，长期解放军电池现已替换为术语脂肪来源的干细胞或先进的结构陶瓷 ，让外地在命名方面的某 种一致性。细胞通过本协议中分离已显示由许多具有在体外和体内中胚层电势（综述见4）。此外，ASC的外胚层和内胚层的电位也被探讨4。隔离技术是简单明了，需要大约一个小时才能完成。所得到的细胞s的标准组织培养条件下培养。随着培养时间，ASC的人口变得更均匀，由成纤维细胞，扩张容易，表现出良好的生存能力在长期的文化。
注：所需设备的以下部分被列在本文的结尾。所有的玻璃器皿，培养基和试剂应通过高压灭菌或消毒，通过0.22微米过滤器过滤。无菌组织培养技术应遵循在任何时候。为了确保这一点，放置在生物安全柜中的所有材料应当通过喷雾用70％的乙醇溶液中，用干净的纸巾擦拭进行消毒。
1。收获前，请准备以下：
- 无菌1X磷酸缓冲盐水（PBS）的lipoaspirates的洗涤。准备大约1升的1×PBS为每100毫升脂肪抽吸物中。高压灭菌的PBS中，所有的OW在使用前冷却至室温。作为一个选项，抗生素/抗真菌剂可被添加到终浓度为：100 IU / ml青霉素，100微克/毫升链霉素和2.50微克/毫升两性霉素B，一旦PBS中冷却。
- 无菌0.075-0.1％胶原酶IA型 （ 溶组织梭菌 ）的脂肪抽吸物的酶消化。浓度将取决于胶原酶的质量和来源- 即原油与纯化。其他类型的胶原酶，可以使用（ 例如 II型胶原酶或IV）在相似的浓度。使用千毫升过滤系统用0.22μm的过滤器（ 图1A）中的1×PBS和无菌过滤器做好准备。然而，也可以使用配有瓶顶过滤器无菌的玻璃瓶中。准备和使用在室温下。胶原酶溶液可被存储在短期在4℃下直到需要。不要冷冻胶原酶溶液，因为它可能会减少它的活动。
- 无菌控制培养基（CM）的灭活胶原酶和ASC人口的培养。为500毫升的CM，结合以下内容：500毫升的DMEM（4.5 g / L的葡萄糖，含L-谷氨酰胺），加入50ml胎牛血清（加热灭活），5 ml青霉素/链霉素（10,000 IU青霉素，10,000μg/ ml的链霉素）。作为一个选项，将5ml两性霉素B（250微克/毫升两性霉素B），也可加入。如果非无菌试剂用于需要此媒体的无菌过滤。放置在CM中使用地暖介质前37℃水浴中30分钟。
- 无菌玻璃器皿和塑料器皿隔离 。高压灭菌的1000ml的玻璃烧杯中，并允许在使用前冷却至室温。此外，具有下列塑料器皿准备：无菌血清移液管（5毫升，10毫升和25ml），50ml离心管中，和组织培养处理过的培养皿上。
2。由L隔离先进的结构陶瓷的ipoaspirates
最lipoaspirates被收集在一个容器中抽吸（ 见图1B），并且可以由三个不同的层组成：油1）的上层由于成熟脂肪细胞的裂解，2）中间层的脂肪组织，以及3）一底部，含液体清液盐水和污染的细胞类型，如红血细胞（红细胞）。顶部油层可能不存在于显著金额。如果存在的话，它应该被吸入作为所得到的ASC培养的油污染可能会影响培养物的存活率。底部清液前应处理删除，以减少ASC文化与红细胞的污染。这将使中间，脂肪组织层，然后将清洗和酶消化解放其细胞， 间质血管分数（SVF）。
- 洗完脂肪抽吸物：打开在组织培养h时脂肪抽吸物容器OOD和精心倒出脂肪抽吸物进入无菌1升的玻璃烧杯中。允许的脂肪抽吸物的层分开，直至脂肪组织层被很好地分离（ 图1B）。
- 吸脱油层（如果存在）使用无菌玻璃移液管和底部盐水清液用10ml的血清吸液管。这将删除更大的大多数污染的红血细胞和生理盐水。
- 评估所得到的脂肪组织层的体积，并加入无菌1×PBS中以相等的体积。用搅拌以混合脂肪抽吸与PBS用于吸吸管吸出物。让这两个层来解决。如上面所指出的，1×PBS中可补充有抗生素/抗真菌剂。
- 用10毫升血清吸管吸出清液。
- 继续按照步骤2.1.2概述洗脂肪组织部分。和2.1.3。直至脂肪层有一个黄色/金色。第吸Ë清液最后一面，留下的脂肪组织部分在玻璃烧杯中。为了确保足够的去除清液中，让脂肪抽吸物层后，最后一次洗涤和最后愿望之前结清5分钟。
- 在脂肪抽吸物的酶消化：准备无菌胶原酶1A的解决方案作为一个过滤单元上文所述。准备一个容积等于该脂肪级分和无菌过滤器。
- 继胶原酶溶液的过滤，弃去上层过滤单元，仔细倒入洗净的脂肪比例进入胶原酶溶液然后拧紧瓶盖。
- 在37℃水浴中放置胶原酶/脂肪混合物，并消化在37℃30分钟 。轻轻摇动胶原酶/脂肪混合物，每次5-10分钟，放回水浴。脂肪组织层应该采取一种“更流畅”的外观（FIGURË1B）为消化募集资金。额外的消化时间（ 即最多2小时），可如果脂肪组织层似乎仍然有在它坚固件肥使用。
- 隔离的ASC的：将胶原酶消化/脂肪混合物放回生物安全柜。一定要消毒用70％乙醇，过滤器单元放置在背面机壳之前。
- 吸取25毫升等分含有SVF到无菌50ml离心管中清液的 。
- 加25毫升CM的各管中。允许CM，在室温下在机柜温育5分钟以灭活胶原酶。
- 离心10分钟，在1200×g离心 ，收集SVF作为粒料。
- 在生物安全柜中，抽吸从每个管中的上清液。确保顶部油层和任何浮动脂肪细胞吸出这上清液（
- 结合SVF颗粒进入使用30毫升CM 1离心管中，并平分了两个新的50 ml离心管中。离心机如在步骤2.3.3。并从2 SVF粒料（在图中未示出）吸出上清液。
可选：如果红细胞裂解需要，悬浮每个SVF沉淀在10ml的RBC裂解缓冲液 （160 mM的NH 4 Cl）的， 并在室温下孵育10分钟。离心机如在步骤2.3.3。和吸出上清液，得到SVF小球（在图中未示出）。- 结合这两个SVF粒料成使用5-10毫升CM（图1B）1新的离心管中。
- 过滤掉较大的组织颗粒，移液管重悬浮沉淀的SVF到一个100微米的筛网过滤器放置在一个新的50毫升离心管的顶部，并允许通过重力流进行过滤。
- 的悬浮等分移液器（过滤），其中包含了先进的结构陶瓷到组织培养处理的培养皿SVF颗粒。补充每道菜与CM的适当的音量。
- 培养的细胞在CM中3-4天，在37℃，5％CO 2的无介质变化。
- 结合SVF颗粒进入使用30毫升CM 1离心管中，并平分了两个新的50 ml离心管中。离心机如在步骤2.3.3。并从2 SVF粒料（在图中未示出）吸出上清液。
根据这一初步培养时间，培养基可能会被吸入和任何污染的红血细胞，用无菌1XPBS洗轻轻取出。更换CM，并根据需要不断培养的ASCs。用于组织培养皿和如何再悬浮的SVF沉淀物中这些菜划分的类型将取决于细胞所需的常规组织培养以下的数量。
3。 ASC的人口特征：流式细胞术及多向分化
一旦分离，应执行所述ASC人口的表征。传统的方法为这个包括流式细胞metry来表征细胞的细胞表面的CD抗原更新和体外分化，以确认它们的多向分化的能力。虽然多种细胞可以在先进的结构陶瓷进行评估，该协议勾勒的ASCs分化成脂肪细胞，成骨和软骨细胞谱系的细胞作为确认多向中胚层的潜力5的一种手段。
在先进的结构陶瓷的体外多向分化
- 先进的结构陶瓷的成骨分化：在此之前归纳，编写成骨培养基（OM），如下所示：要将一个一瓶500毫升的DMEM（4.5克/毫升的葡萄糖）加到25.0毫升青霉素/链霉素的FBS（5.0％终浓度）和5.0ml （10,000 IU / ml和10,000 mg / ml的终浓度，分别）。对此，添加下面的成骨诱导剂给予指示的终浓度地塞米松（0.1微米决赛），L-抗坏血酸-2 - 磷酸（50.0微米决赛）和β-磷酸甘油（10.0毫最终）。
- 在诱导前，收获和板培养的ASCs成所需的组织培养皿中，使约50％汇合的实现。对于每一个实验皿镀金，镀额外的菜非诱导控制。隔夜文化在CM中。
注：50％汇合建议，以允许继续扩散可能发生在诱导过程中的 - 诱导的日子，除去中，添加以下内容：OM到所需的成骨实验井和CM的对照孔。使用介质的体积将取决于组织培养皿的大小。对于12孔培养皿中，1.0毫升每孔介质就足够了。对于6孔培养皿中，加入2.0ml媒体每孔就足够了。为100mm平皿，应使用10.0毫升的媒体每皿。
- 培养最少14天的细胞用适当的培养基中，每3-4变化天。高成骨ASC人群可能最早的7天感应显示外矿物质沉积的迹象。
- 成骨分化（ 即细胞外的矿物沉积）可以使用冯·科萨组织学染色为磷酸钙得到证实。这个污点会产生棕黑色沉淀物识别的胞外钙磷酸盐（参见图2）的存在。
染色与冯·科萨试剂：- 从所述控制单元删除该OM从实验细胞和CM
- 固定在1×PBS中制备的4.0％多聚甲醛固定细胞60分钟。
- 用1×PBS洗涤细胞2次。
- 孵育的细胞用硝酸银2.0％（在水中制得） 在黑暗中 30分钟。
- 除去硝酸银，洗涤2次，用蒸馏水和空气干燥的细胞。
- 暴露的细胞暴露于UV光60分钟来开发卡尔cium磷酸盐沉淀。
- 用1XPBS洗涤细胞数次。
- 如果需要，染液的细胞用苏木精。
- 在诱导前，收获和板培养的ASCs成所需的组织培养皿中，使约50％汇合的实现。对于每一个实验皿镀金，镀额外的菜非诱导控制。隔夜文化在CM中。
- 先进的结构陶瓷的成脂分化：在此之前归纳，编写成脂培养基（AM），如下所示：要将一个一瓶500毫升的DMEM（4.5克/毫升的葡萄糖）加到50.0毫升胎牛血清（10.0％终浓度）和5.0 ml青霉素/链霉素（10,000 IU / ml和10,000μg/ ml的终浓度，分别）。对此，添加下面的成脂诱导剂给予指示的终浓度地塞米松（1.0微米决赛），3 - 异丁基-1 - 甲基黄嘌呤（IBMX - 0.5毫米决赛），吲哚美辛（0.2毫米决赛）和胰岛素（10.0微米决赛）。
- 在诱导前，收获和板培养的ASCs成所需的组织培养皿中，使约80％汇合的实现。对于每一个实验皿镀金，镀加法人菜的非诱导控制。 。文化过夜CM 注：先进的结构陶瓷的成脂分化似乎是与增加的融合更加高效。
- 诱导的日子，除去中，添加以下内容：上午到所需的成骨实验井和CM的对照孔。使用介质的体积将取决于组织培养皿的大小。对于12孔板，每孔1.0.ml媒体就足够了。对于6孔培养皿中，加入2.0ml媒体每孔就足够了。为100mm平皿，应使用10.0毫升的媒体每皿。
- 培养最少14天的细胞用适当的介质的变化，每3-4天。高脂肪生成ASC人群可能最早的7天诱导表明脂质空泡形成的迹象。
- 先进的结构陶瓷进行成脂分化将开发可在光学显微镜下很容易地可视化多个脂质空泡。此外，成脂分化可采用油红O染色组织学，将积累这些空泡内（ 见图2）进行确认。
染色与油红O：- 从实验和对照组细胞中取出纸张，解决这些问题，使用10％的正式钙固定液60分钟。为了准备这个固定液，结合以下：1.0克CaCl 2，25.0毫升16％多聚甲醛（4.0％最终）和75.0毫升蒸馏水水。
- 用1×PBS洗涤细胞2次。
- 用70％乙醇简要地洗涤细胞。
- 孵育的细胞在室温下放置5分钟，与油红O溶液。要准备油红O解决方案，化解2.0克油红O粉50.0 1ml 70％乙醇50.0毫升的丙酮。
- 用70％的乙醇中，然后洗涤细胞用自来水。
- 不久后，由于染色随时间褪色染色的可视化的细胞。
- 先进的结构陶瓷的软骨分化：软骨细胞分化是通过被称为“微团培养”高密度培养技术来实现。在此之前的文化，准备软骨中（CHM），如下所示：要将一个一瓶500毫升的DMEM（4.5克/毫升葡萄糖）加入5.0毫升胎牛血清（1％终浓度）和5.0 ml青霉素/链霉素（10,000国际单位/毫升和10,000μg/ ml的终浓度，分别）。对此，添加下面的软骨诱导剂给予指示的最终浓度：L-抗坏血酸-2 - 磷酸（50.0微克/毫升决赛），胰岛素（6.25微克/毫升决赛），转铁蛋白（6.25微克/毫升决赛）和转化生长因子β1 （10.0毫微克/毫升）。
- 收获的ASC和离心5分钟，1,200×g离心沉淀细胞。计数细胞以确定细胞悬浮液的密度。
- 要准备微团颗粒，准备两个细胞悬液：在1×10 7细胞的密度编制CHM 1实验停牌的S /毫升，并在1×10 7个细胞/ ml的密度制备CM 1控制悬浮液。
- 放置在一个多孔盘的各个孔的细胞悬浮液的10.0微升“液滴”。允许在37°C，坚持2-3小时
- 轻轻地覆盖在液滴镀与任何CHM或CM小心不要游离细胞。
- 培养细胞进行长达14天的CHM或者CM的变化在中每3-4天。在细胞培养CHM会凝结在这个时候，形成一个高密度微颗粒几乎没有细胞周围的单层。培养的对照细胞不会发生这种结露，很多人会发现作为一个单层。
- 以确认软骨形成，修复粒料在4.0％多聚甲醛15分钟（在1x PBS中制备的）在室温下进行。染色使用的爱茜蓝染色的组织学的硫酸化蛋白聚糖的存在。
染色用阿尔辛蓝：- 洗PAraformaldehyde固定粒料一次在1×PBS中。
- 孵育5分钟，在0.1N的HCl（pH值1.0）的丸粒，以降低其pH值。
- 除去HCl，并添加1％爱茜蓝试剂（在0.1N HCl中，pH值1.0的方法制备）。孵育30分钟，在室温下进行。
- 除去爱茜蓝试剂和用0.1N的HCl（pH值1.0）洗涤小球以去除过量的染色。
- 用自来水洗涤额外可用于降低背景染色。
- 作为一种替代方案中，微团粒料可以被收获，在10％福尔马林中固定过夜，石蜡包埋和切片染色爱茜蓝。
4。先进的结构陶瓷的流式细胞仪鉴定
细胞表面的CD抗原分布的表征可以通过传统的流式细胞仪来完成。
- 先进的结构陶瓷的制备用于流式细胞术：在此之前分析，准备流式细胞仪缓冲液（FCB），包括下列各项：1.0％BSA，2.0％FBS和在1x PBS制备的0.025％皂素。
- 收获的ASC和离心细胞5分钟，在1200×g离心，以产生沉淀。
- 重悬细胞于无菌1XPBS并使用血细胞计数器计数细胞。确定悬浮液的细胞密度。
- 划分悬挂成5×10 5细胞总离心沉淀等分。
- 除去PBS上清液和固定细胞60分钟，在-20℃下用过量的冰冷的70％乙醇中。如果需要的话，这些细胞可以被存储在这个70％的乙醇在-20℃下冷冻，直到需要。
- 下面固定，小心吸出乙醇，轻轻地两次与过量的FCB的洗涤沉淀。洗：
- 添加过量的FCB，轻轻悬浮颗粒。
- 离心5分钟，在1200×g离心，收集细胞一SA颗粒。
- 小心吸FCB的上清液。
- 重复。
- 来自各等份样品重悬在100μlFCB的取出最后的FCB洗上清。使用制造商的建议稀释添加所需的荧光标记的第一抗体。在冰上孵育细胞与抗体30分钟。
注意：如果荧光标记的第一抗体是不可用时，也可以使用非共轭的第一抗体。 - 对于使用（ 例如 FITC，PE），每个荧光染料，培养细胞的等分试样用100毫升FCB含有同种型匹配的IgG作为阴性对照。
- 在100毫升的FCB不含抗体作为一个额外的控制下孵育1等分试样。
- 与FCB洗小区的每个等分试样2倍，如步骤4.1.5详述。继最后一次洗涤，重悬等分在100毫升的FCB，并进行流量分析。
注意：如果使用非共轭的第一抗体：在此之后的洗涤步骤在冰上孵育等分试样进行20分钟，使用的FCB补充有合适的荧光标记的第二抗体使用制造商的建议稀释。如在步骤4.1.5概述洗2次。
- 先进的结构陶瓷流分析：对于流量分析，最低为10,000个事件应该被计算在内。未染色和同型匹配的对照组应使用前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）来设置门。对于这一点，步骤4.1.8的无抗体对照组（ 即未染色的）应以消除碎片和死的ASCs被使用。 4.1.7步的同型匹配的抗体对照。应当用于建立正面荧光的区域。
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Representative Results
上述协议纲要描述了一个SVF从大量脂肪抽吸物样品的隔离手册，酶法。在这个SVF许多细胞群，包括ASC。许多研究建议标准组织培养条件下培养这种SVF会选择贴壁成纤维细胞的人口可能会主要由ASC类型。与此相一致，我们已经表明，使用流式细胞术和免疫荧光，即培养的SVF粒料变得基本上不含主要污染细胞类型，即红细胞，平滑肌细胞和内皮细胞系1的细胞。所得到的ASC人口相对均匀的外观和由成纤维细胞样细胞（ 图2）。这些粘附的ASC在培养标准组织培养条件下生长良好，并显示出适度的群体倍增时间1使得它们适用于许多分子和单元b在体外和再生研究在体内 iology研究。然而，在光的分离的SVF的异质性，所述ASC人口的验证是必要的。许多研究已经使用流式细胞仪，以培养的ASCs的CD抗原特征定性为确定这些细胞在体外和体内 5-9的潜在手段。 表1从许多这些研究的总结了结果。虽然其中一些CD抗原的表达仍存在争议，但普遍认为，培养的ASCs是CD13，CD29，CD34，CD44，CD49d的，CD54，CD90和CD140a阳性。由于没有大量的造血CD抗原，如CD31和CD45，与先进的结构陶瓷的中胚层起源相一致，虽然此时的具体造血标志物CD34一样的表情仍然没有解决。最近，ASC抗原访问，如通过流式细胞术检测，已被用来选择特定subpopulations生产先进的结构陶瓷增强分化能力的希望10-12。
由于验证的最流行 的手段， 在体外诱导使用已定义的培养条件会导致其分化成中胚层，外胚层和内胚层谱系的ASC人口（综述见4）（ 图2）。而在体外三胚层的电位，导致在使用的ASC的为各种各样的再生模型系统中，分化为成骨细胞，脂肪细胞和软骨形成细胞通常是足够的，以确定所述ASC并确认其多能性。在我们的手中，先进的结构陶瓷的结果包含使用染色油红O 5明亮的脂质空泡细胞成脂分化。成骨细胞分化的结果的碱性磷酸酶阳性细胞和细胞外的矿物，即污迹用磷酸钙冯科萨染色5的累积。高密度微条件下的软骨细胞分化生成包含硫酸蛋白多糖（使用阿尔辛蓝染色检测）和胶原蛋白的表达2型5粒。这两种骨骼肌和平滑肌分化可以看到与先进的结构陶瓷染色骨骼肌肌球蛋白和MYOD1和平滑肌肌动蛋白5，13，14。分化成外胚层谱系是通过神经元样形态由诱导的ASC和众多的神经元标记物，包括神经元核抗原，神经元转录因子5的表达的假设提出了建议。最后，对诱导肝/内胚层谱系的ASC根据既定的条件下15结果在细胞中的表达甲胎蛋白，肝细胞的一个著名的标志。这些标记，连同许多其他出版了近10年来有力地表明，ASC的是，可以很容易地保持了多能性干细胞群和在体外繁殖和诱导向三个胚细胞系的细胞。耦合到体内的再生潜能（综述见4），ASC的可能是一个强大的除了再生研究的科学家或医生的工具。
图1。从脂肪抽吸物标本人的ASC手册，酶的隔离。对于隔离A.制备：于隔离下列组分应准备：1）1×PBS（不含钙或镁），通过高压灭菌，2）的0.075-0.1％胶原酶IA型，制备在1×PBS中并灭菌的溶液通过使用0.22μm的过滤器过滤单元，的AS 3）控制培养基（CM）的ASC人口的后续培养。B.分离CS：将显示一个一步一步的指导从lipoaspirates基质血管组分（SVF）的隔离。步骤包括脂肪抽吸物中，用无菌的1×PBS洗涤，用胶原酶IA型，收集SVF通过离心，和SVF过滤消化。随后的SVF的培养将导致包含ASC人口的成纤维细胞贴壁人口。 点击这里查看大图。
图2。粘附ASC人口的多谱系分化的潜能。养SVF细胞导致粘附，成纤维细胞的ASC相对同源性的群体。诱导下定义的条件导致的脂肪细胞，成骨，软骨，骨骼和肌源性肌光滑谱系的细胞ASC人口。此外，先进的结构陶瓷也可以分化成外胚层谱系的细胞，表达的NeuN，神经元的标记物和α-甲胎蛋白（AFP）的内胚层/肝细胞谱系的标志物确定。一些组织学和免疫荧光图像取自以前的发布结果1,5,6,7,8,9。分化谱系，与组织学，免疫组织或荧光染料一起展示。 点击这里查看大图。
| 表达谱 | ||
| 阳性表达 | 阴性表达 | |
| CD9，CD10，CD13，CD29，CD34，CD44，CD49A，CD49B，表达CD49d，CD49e的， CD51，CD54，CD55，CD59，CD61，CD63，CD71，CD73，CD90，CD105，CD138，CD140a，CD146，CD166，HLA-ABC，STRO-1 | CD11A，细胞CD11b，CD11c的，CD14，CD16，CD18，CD31，CD41a，CD49f的，CD45，CD50，CD56，CD62E，CD62L，CD62P，CD104，CD106，CD133，CD144，CD146， HLA-DR，SMA，ABCG2 | |
| 先进的结构陶瓷的表型建议 （两个或两个以上的研究之间的共同） | CD10，CD13，CD29，CD34，CD44，CD49d的，CD54，CD90，CD140a， HLA-ABC，STRO-1 | CD11A，细胞CD11b，CD11c的，CD14， CD31，CD45，CD106，CD144 |
| 在先进的结构陶瓷争议的标记 （在多个不同的研究结果） | CD105，CD117，CD140b，CD146，CD166，SMA，HLA-DR的 | |
| 基质CELL标记 | CD29，CD44，CD73，CD90，CD166 | |
| 造血标志物 | CD31，CD34，CD45，ABCG2 | |
| 2个或更多以粗体显示的研究标记之间的共同点 = SMA平滑肌肌动蛋白 HLA =人类白细胞抗原 ABCG2 =多药转运蛋白G2 | ||
表1中。人类的ASCs的细胞表面表达谱。
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Discussion
脂肪组织为先进的结构陶瓷的隔离可以有多种形式：从通过切除或抽脂来或者通过注射器抽取或抽吸辅助抽脂（ 如吸脂术）获得更小的碎片得到的固体片组织。是否有更多的SVF细胞（从而先进的结构陶瓷）可从切除或抽吸的脂肪样本获得的是不清楚冲突的研究已经提出了16，17。这是可能的，只要操作者熟练的分离技术包括两种形式的脂肪组织是多适于SVF细胞和先进的结构陶瓷的隔离。但是，吸脂不持有，超过切除术的优点是它创伤小，需要显著较少术后护理。而吸脂的种类有所增加，在过去的十年中，包括技术，例如超声辅助，动力辅助和激光辅助吸脂18，最常见的仍然肿胀吸脂，其中脂肪车厢内充斥着大量的吸入性19日之前无菌生理盐水，麻醉剂和血管收缩剂。技术的选择可以有所不同从外科医生到外科医生。然而，在提取的装置看起来可能不重要的研究者，但要认识到，该技术可能对ASC数目和生存力的影响是重要的。例如，增加吸脂真空压力可以SVF细胞产率20产生负面影响。此外，在降低细胞增殖的ASC已经在超声辅助吸脂术17测定。
然而得到的吸应迅速处理，作为存储温度可能会影响SVF生存能力和最终ASC产量。已研究由Matsumoto 等人的结果表明，如果在吸液被存储在室温下超过24小时，21 ASC收率降低。如有必要，可无任何有害影响使用24小时存储在4℃在所述ASC人口的生物学特性s，但是，再次，细胞生存力可以减少，如果这个存储时间增加超出该点。脂肪抽吸物处理的容易，直接关系到其整体体积。更小的体积，通过注射器提取获得，都比较容易处理。然而，更大的容量抽吸，通过吸脂得到的，可以提出物理的挑战。例如，从抽吸容器转移脂肪，这样它可以被洗涤这样简单的事情会出现问题时，在吸液量是很大的。在这篇文章中列出的协议是为了减轻这些挑战。
总的来说，使用本文中介绍的酶法lipoaspirates ASC种群的隔离并没有显著在过去的10年改变了。但是也有一些优秀的先进的结构陶瓷的自lipoaspirates隔离他们的描述可以通过PubMed的众多协议。 M他们的OST勾勒出一个非常类似的协议与小的修改。基本上，脂肪抽吸物进行洗涤的污染物，消化酶，以释放SVF和SVF，含有所述ASC人口，通过离心收集。最大量lipoaspirates到达某种类型的真空容器 - 这配置可以不同的外科医生操刀。本协议建议去除吸进洗涤前一个大，无菌烧杯中，由于容器本身可能是污染的来源，如果放置在生物安全罩前未妥善清理。一旦被转移，并使其靠重力沉降，在吸液将分离成三层：一个顶部，油层，结果从成熟脂肪细胞的溶胞，中脂肪层和盐水污染的红细胞的底层。正如我们已注意到，它可能是有毒的所得细胞培养物（未发表的观察结果）油层应被删除。另外这个原山口建议盐水和红细胞的清液将之前以减少污染的红细胞，一旦的ASC是培养的电位数的第一洗涤除去。然而，一项研究由弗朗西斯等人建议，这清液也可能是先进的结构陶瓷22的一个来源。采用10毫升血清吸管使得消除这个清液的相对容易。剩下的是，可以然后使用无菌PBS中很容易地清洗，或者如果需要的话，无菌PBS补充有抗生素和抗真菌剂，以减少污染23-25 的机会的脂肪层。在洗涤中，脂肪组织被酶促使用型胶原酶IA的无菌溶液消化。使用过滤装置，如在该视频显示的Millipore公司的单元的组合的无菌过滤胶原酶放入密闭容器中，以该洗涤脂肪组织可以用于随后的水浴中消化在37℃下加入一种方便的手段
用胶原酶的类型已经从组变化到组胶原酶IA型似乎是更普遍的1，24，25。但是，也有可超过11种不同类型的胶原酶市售，每消化亲和力的特定组织。对于脂肪组织的消化，如西格玛奥德里奇公司推荐胶原酶I型和II和这两种类型在今天的文学1，24-27很好的体现。在他们的原创文章，Zuk 等人用从牛源在0.075％1浓度得到胶原酶IA型。然而，型胶原酶IA的大部分商业来源正在从厌氧细菌溶组织梭菌或大肠杆菌得到大肠杆菌基因与C histolyticum基因。许多公司提供胶原酶IA型众多制剂，从原油到那些通过硫酸铵沉淀法制备。该此朱庇特的文章中所述协议使用粗制剂IA型胶原酶包含不仅胶原酶的活动，也有非特异性蛋白酶，梭菌和胰蛋白酶酶活性。而这些附加的酶的消化效率28关键的，也有那些对许多变异报告很多与粗型胶原酶IA 28,29相关联，并增加它们的浓度的胶原酶高达0.2％，以便获得高效的消化23。使用粗型胶原酶IA的那些基团，以提高酶的性能和脂肪基质内增加细胞的稳定性也建议其补充牛血清白蛋白（0.1-1.0％BSA）中。不过，这可能不是必要的，如本文中所述的协议使用胶原酶没有补充的消化效率无不利影响。
对于那些希望使用更明确的胶原酶排版osition，含高度纯化的胶原酶具有精确的蛋白酶融合在一起的商业来源，现已。这些制剂净化梭菌胶原酶I型和II高活性，与已知的中性蛋白酶的活动，如分散酶和嗜热菌组合它们。用胶原酶和嗜热脂肪有效消化已报道通过Zachar 等 27。与此工作协议，Pilgaard 等 30也报道极好的消化利用效率胶原酶和嗜热菌的几种混合物。然而，他们用胶原酶和分散酶制剂观察更好的消化效率。
消化时间对细胞从脂肪组织中分离的时间可能在研究研究。许多出版协议建议1-2小时27，30的消化时间。然而，必须认识到，过度的消化时间可能会最终影响可行，数量是很重要的铯和它们的干细胞表型。 Pilgaard和他的同事已经确定，2小时的消化，在37°C给出了组织解离和ASC功能30之间的最佳平衡，与Zachar 等 ，建议消化，过去的45分钟，可以观察到每15分钟至2小时最大，消化被停止一次的脂肪组织呈现出更均匀的外观27。我们同意这一建议。然而，这是我们的经验，大多数胶原酶IA型制剂在0.075-0.1％能够消化大量lipoaspirates在30-45分钟，并且这些时间足以解放细胞数量充足。因此，该协议建议的30分钟的消化时间。如果需要更多的时间，则脂肪抽吸物的稠度应监视和消化停止时的脂肪抽吸物假定一个“奶油状”或“糊状的”外观（ 图1）。
第一次ê消化完成后，释放SVF的隔离使用离心简单地完成。然而，像抽吸压力，离心对身体的影响可能对SVF活力和可用于培养的ASCs的数量的效果。一项由栗田和他的同事31表明，速度超过3000 XG会损坏ASC。然而，速度应该足够显著确保SVF足够的造粒。作为一项规则，大多数的协议，包括这一个，建议为1,200-1,500×g的离心速度。应注意由研究员，以确保他们理解离心力（以克计）和离心速度（测量为每分钟转速）之间的关系，由于工作的关系取决于具体的离心机转子。然而，作为一个规则，低级离心力，如1200×g离心，通常相当于离心速度，并且可以安全地被可互换地使用。
下面纺，几个二的油和“蓬松”白色脂肪细胞，中间层胶原酶和细胞沉淀的顶层：stinct层在离心管中（ 图1）观察到。粒料本身可能有两个不同的层：红细胞的上层和下白SVF粒料，含有的ASC。此协议建议小心吸出的油和脂肪细胞，如油可能是有毒的细胞培养物和脂肪细胞已被证明能够脱分化回到更原始的细胞类型32。但是，这些脂肪可以在这一点上，如果需要可以收获。由于这些污染物，该协议建议一个额外的洗涤步骤，以确保其充分去除。这一步也允许研究者结合多个SVF颗粒随后便于过滤。过滤可能是必要的，因为大块纤维化材料和以下消化细胞聚集体的存在。这些材料容易地除去通过通过70或100微米筛网过滤器简单的重力为基础的过滤。滤液的等分试样可采取以计数，如果需要的有核细胞的数量和镀ASC粘附和扩展的剩余滤液。
尽管勤奋努力来消除尽可能多的红细胞越好，没有ASC准备将完全没有红细胞的污染。在我们最初的文章中，我们提出了通过沉淀重新悬浮在160 mM的NH 4 Cl 等低渗溶液中除去这些红细胞。广大随后分离的文章包含这一步，建议使用NH 4 Cl等为基础的解决方案或无菌水22〜24，27，33，虽然必须小心，如果使用无菌水服用，以减少时间的SVF细胞暴露在低渗溶液27。但是，这一步骤可能不是必需的红细胞是一个非粘附细胞群和以下的过夜培养可以很容易地除去ASC的人口。此外，虽然轶事充其量，这些红细胞出现改善所得到的贴壁细胞（ZUK，未发表的观察结果）的初始膨胀。因此，该协议消除了红细胞裂解步骤和建议的初始ASC培养被允许在这些红细胞的存在扩大的第3-4天无培养基的任何变化。这样做的原因可能观察污染的血细胞是由于某种类型的旁分泌信号或可能仅仅是由于与红细胞裂解步骤的排除更好的生存能力。在此之后，培养基可以通过轻轻地洗涤该平板，用无菌1×PBS中被吸出，大部分的红细胞的除去。随着时间的推移，任何剩余的红细胞最终会死，从文化中删除。
所学专业Zachar和Boquest估计，再悬浮的颗粒SVF 25-50％坚持组织培养塑料23，27。由此产生的“通道0”的ASC立方米ltures是异构的，由小而圆的细胞被认为是建议为内皮细胞起源的ASC和更不规则形状的细胞。而由多组包括我们的研究已经证实不存在污染的细胞类型，如平滑肌细胞，造血细胞和ASC培养1成纤维细胞，额外的细胞类型的存在不能被排除。 事实上 ，TALLONE 等有特点通道0的文化和观察到四个不同的群体：1）小，圆形，快速更新的细胞，2）梭形纤维母细胞被认为是ASC的，3）慢慢地复制大细胞具有更受限电位（ 即前脂肪细胞）和4），它们失去了与通道34立方形内皮细胞。随后的研究表明，该圆的，快速更新的细胞群具有最高multipotentiality和表达典型的干细胞标记物35，36。此外，他们可能会形成“球体”，由于他们的迅速增殖，并经常包围梭形纤维母细胞。因此，它可能是上面提出的纺锤状的ASC人口可能源于这些细胞。以下这些通道0的ASC文化的初始扩展，它被认为是持续培养一段时间选择为ASC，用所得培养物中假定一个更成纤维细胞，均匀的组合物。然而，污染细胞的残存，不能完全排除，因此，ASC的人口仍然被认为是均相的。
虽然本文中描述的协议很简单，价格低廉，不要求通常不会在一个组织文化设施发现的任何设备部件，它确实需要有这样一个机构的缺点。许多研究通过动物模型研究了先进的结构陶瓷的平移应用和使用ASC的临床研究已经开始出现（综述见4
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Disclosures
这个手稿的作者是由加州大学董事会，并授权给Cytori治疗所拥有的专利的共同发明人。
Acknowledgments
作者要承认并感谢那些额外的研究人员促成所描述的协议和先进的结构陶瓷，其隔离的发展，包括：H.博士彼得·洛伦茨博士，博Muzuno博士，医学博士，杰里黄教授，医学博士博士亚当·卡茨博士，威廉·富特雷尔博士，医学博士荣Zhang博士，渠务署署长，博士，拉里萨·罗德里格斯博士，医学博士，阿方索·泽尼博士，博士，博士和约翰·弗雷泽博士。给出的结果进行资助，一部分，由美国国立卫生研究院，包括NIAMS和NIDCR研究院的研究经费。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone - water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
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