Summary
2001年には、UCLAの研究者は、成体幹細胞の集団の単離を説明した脂肪組織から、脂肪由来幹細胞またはASCをと呼ばれる。この記事では、コラゲナーゼを使用して手動、酵素消化プロトコルを使用して脂肪吸引物からASCの分離の概要を説明します。
Abstract
2001年には、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の研究者は、彼らが最初に処理脂肪吸引細胞またはPLA細胞と呼ばれる脂肪吸引脂肪組織からの成体幹細胞の新たな集団の単離を記述した。それ以来、これらの幹細胞は、脂肪由来幹細胞またはASCをと改名され、幹細胞研究と再生医療の分野で最も人気のある成体幹細胞集団の1になるために行っている。数千件もの記事になりました骨再生、末梢神経修復および心血管工学など、再生様々な動物モデルにおいてASCの使用を記載している。最近の記事クリニックでのASCの用途の無数を記述するために始めている。この記事に示されているプロトコルは、手動および酵素的に化粧品の手順から得た脂肪吸引物、大量のからのASCを分離するための基本的な手順を説明します。このプロトコルは、簡単またはaccommodまでスケールアップすることができます脂肪吸引の量を食べ、abdominoplastiesや他の同様の手順で得られた脂肪組織からのASCを隔離するために適合させることができる。
Introduction
2001年には、脂肪組織から多能性幹細胞の集団は、推定上のジャーナル·ティッシュ·エンジニアリング1に記載されている。これらの細胞は、美容整形によって得られた処理脂肪吸引組織からの派生のために名前を処理脂肪吸引またはPLA細胞を与えられた。この資料に記載されている分離方法は、脂肪組織2から間質血管画分（SVF）を単離するための既存の酵素の戦略に基づいていた。 SVFは、組織培養基質2、3に付着するには至っていない赤血球、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞および前脂肪細胞の最小限の加工集団として定義されている。経時このSVFの培養は、これらの混入細胞集団の多くを排除し、付着性、線維芽細胞集団を生じることが提案されている。これらの線維芽細胞は事前にされていると、最後の40年間の文献で確認されている脂肪細胞。しかし、我々の研究グループでは、これらの細胞は中胚葉多分化を保有し、PLA細胞として付着したSVFの人口と改名することを実証した。他の多くの研究グループによるその後の研究では、（レビュー4を参照）、内胚葉及び外胚葉の両方電位を示唆し、この潜在的に追加した。その時以来、これらの細胞のための多数の追加の用語が文献に登場している。コンセンサスいくつかのタイプを提供するために、長期的な脂肪由来幹細胞またはASCを、2 回目の年次IFATS会議で採択された。このように、長期的なASCが、この記事で使用されます。
この資料に記載されたプロトコルは、標準的な実験室装置を必要とし、そのようなリン酸緩衝化生理食塩水、標準的な組織培養培地試薬およびコラゲナーゼなどの単純な試薬を使用して比較的簡単な手順である。それは、脂肪組織量およびその後のcと出発の量に応じてASCの多数を生成することができるulture時間。しかし、脂肪組織のような大量の処理は、このプロトコルを使用してある程度まで軽減することができるいくつかの物理的な問題を提示することができる。さらに、このプロトコルは、無菌の組織培養施設を必要としませんし、それによって承認された組織培養施設の使用を必要と、バイオセーフティフードを承認した。これらは適正製造基準分離と臨床使用のための材料の拡大のために設計された（GMP）が承認した施設で隔離されていない限り、この要件には、臨床応用におけるASCの人口の有用性を減少させることができます。別の方法として、手術室に閉鎖系でのASCを単離することができる自動化されたシステムは、この重要な問題を回避するとその後のin vitroでの拡大を必要とせずにASCのすぐに使用可能にする。今日まで、ヒト組織からの細胞の単離のために市販の6つの自動化システムがある。これらのシステムは、単離することを可能にすることができるすぐに収穫後の脂肪組織に大量のからASCのかなりの数。これらのASCは、患者がこれまでに手術室を離れることなく、回生、様々な目的のために患者に再導入することができた。 ASCの手動分離を記述し、このプロトコルに加えて、セリューション·システムを使用したASCの自動化された単離するためのプロトコルも、関連記事に記載されています。
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Protocol
ここに示されているプロトコルは、酵素消化し、差動遠心分離を用いて化粧品の手順で得られた脂肪吸引物からASCの手動単離を記載している。このプロトコルは、最初に得られた細胞が原因で脂肪吸引物からの分離処理脂肪吸引細胞またはPLA細胞と呼ばれていた2001年1、ジャーナルティッシュエンジニアリングに掲載されました。しかし、用語のPLA細胞は現在、長期的な脂肪由来幹細胞またはフィールドの命名法の観点から適合性のようなものを与えるためのASCに置き換えられました。このプロトコルを介して単離された細胞（総説について4参照）、インビトロおよびインビボの両方で中胚葉電位を有することが多くの人に示されている。また、ASCの外胚葉と内胚葉電位も4を探求してきた。分離技術は、シンプルで簡単であり、完了するのに約1時間を必要とします。得られた細胞sが標準的な組織培養条件下で培養される。培養時間とともに、ASCの人口は簡単に拡大し、文化の中で、長期にわたって良好な生存性を示し線維芽細胞で構成される、より均質になる。
注：必要とされる機器の次の部分は、この記事の最後に記載されています。すべてのガラス器具、培地および試薬は、オートクレーブ処理によって滅菌または0.22μmのフィルターを通して濾過されるべきである。無菌組織培養技術を常に従うべきである。これを確実にするために、バイオセーフティキャビネット内に配置されるすべての材料は、70％エタノール溶液を噴霧し、清潔なペーパータオルで拭いて殺菌しなければならない。
1。収穫前に、次のことを準備します。
- 脂肪吸引物の洗浄のための滅菌1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）。脂肪吸引のすべての100ミリリットルのための1×PBSを約1リットルを準備します。 PBSおよびすべてオートクレーブ使用前に室温まで冷却しOW。オプションとして、抗生物質/抗真菌は、最終濃度に添加してもよい：100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび2.50μg/ mlのアムホテリシンBのPBSを冷却した後。
- 脂肪吸引の酵素消化のための（ クロストリジウムヒストリチカムから）無菌0.075から0.1パーセントのコラゲナーゼタイプIA。濃度は、コラゲナーゼの質とソースに依存します- すなわち原油対は、精製された。他の種類のコラゲナーゼ（ 例えばコラゲナーゼタイプII又はIV）同様の濃度で使用することができる。 0.22μmのフィルター（ 図1A）で千ミリリットルろ過システムを使用して、1X PBSおよび滅菌フィルターで準備します。しかしながら、ボトルトップフィルターを装着し、無菌ガラスびんを使用してもよい。準備し、室温で使用しています。必要になるまでコラゲナーゼ溶液は、4℃での短期保存することができる。それはその活性を減少させる可能性があるコラゲナーゼ溶液を凍結しないでください。
- ASCの人口のコラゲナーゼ不活性化および培養用の滅菌コントロール培地（CM）。 CM 500mlのために、以下組み合わせる500mlのDMEM（L-グルタミン4.5グラム/ Lグルコース）50mlのウシ胎児血清（熱不活化）、5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン（10,000 IUペニシリン10,000μg/ mlのストレプトマイシン）。オプションとして5mlのアンホテリシンB（250μg/ mlのアンホテリシンB）を添加することもできる。非滅菌の試薬が使用される場合、この培地の滅菌ろ過が必要とされる。媒体を温めるために使用前に37℃の水浴中で30分間CMを配置します。
- 単離のための無菌のガラス製品およびプラスチック製品 1,000 mlのガラスビーカーをオートクレーブし、使用前に室温まで冷却する。さらに、以下のプラスチック製品を用意しておいてください。無菌血清学的ピペット（5ミリリットル、10ミリリットルと25ミリリットル）、50ミリリットル遠心管、および組織培養処理された培養皿を。
2。 LからASCの隔離ipoaspirates
ほとんどの脂肪吸引物は、吸引容器（ 図1B参照 ）に回収され、三つの異なる層から構成されてもよい：成熟脂肪細胞の溶解に起因する油1）上部膜、脂肪組織の2）中間層、および3）A底、液体遊泳下の生理食塩水を含有し、例えば赤血球（RBC）のような細胞型を汚染する。上部油層を有意な量で存在してもしなくてもよい。存在する場合は結果として、ASC文化の油汚染は、培養物の生存に影響を与える可能性があるので、それを吸引する必要があります。下の遊泳下のは、赤血球とASC培養の汚染を最小限に抑えるために、処理前に削除する必要があります。これを洗浄し、酵素的にその細胞、 間質血管画分（SVF）を解放するために消化される途中、脂肪組織の層を残す。
- 脂肪吸引を洗浄：組織培養時間で脂肪吸引コンテナを開きますOOD、慎重に、滅菌1リットルのガラスビーカーに脂肪吸引をデカントします。脂肪組織層は、ウェル（ 図1B）分離されるまで吸引脂肪の層を分離することができます。
- 油層オフ吸引物（存在する場合）を、10ml血清学的ピペットを用いて滅菌したガラスピペットおよび底遊泳下の生理食塩水を用いて。これは、赤血球および生理食塩水を汚染する大きな大部分を除去する。
- その結果、脂肪組織の層の体積を評価し、同体積での滅菌1X PBSを追加します。 PBSで脂肪吸引物を混合するために、吸引のために使用さピペットで吸引物を撹拌した。 2層が落ち着くことができます。上述したように、1×PBS、抗生物質/抗真菌剤を補充してもよい。
- 10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて遊泳下のを吸引する。
- ステップ2.1.2で説明したように脂肪組織分率を洗浄するために続けています。および2.1.3。脂肪層はイエロー/ゴールド色を有するまで。吸引物番目Eガラスビーカーに脂肪組織分率を残して、最後にもう一度遊泳下の。遊泳下の十分な除去を確実にするため、脂肪吸引の層は最後の洗浄の後に、最終的な吸引の前に5分間沈降させる。
- 脂肪吸引の酵素消化：フィルターユニットで上記のように無菌コラゲナーゼ1A溶液を調製する。脂肪分や無菌フィルターと同等のボリュームを準備します。
- コラゲナーゼ溶液のろ過に続いて、上部フィルタユニットを破棄し、慎重にコラゲナーゼ溶液に洗浄した脂肪分を注ぎ、しっかりとボトルを閉じます。
- 37°Cの水浴中でコラゲナーゼ/脂肪の混合物を置き、30分間37℃で消化する 。優しくコラゲナーゼ/脂肪の混合物ごとに5〜10分を旋回し、水浴中に戻って置きます。脂肪組織層は、「スムーズな」外観（Figurを取る必要がありますE 1B）の消化が進むにつれて。脂肪組織層は依然として、その中に脂肪の固体片を有すると思われる場合は、追加の消化時間（ すなわち、最大2時間まで）を使用することができる。
- ASCの単離：背面バイオセーフティキャビネットに置き消化コラゲナーゼ/脂肪の混合物。前キャビネットに戻って配置する70％エタノールでフィルタユニットを殺菌するようにしてください。
- ピペットを25mlの無菌の50ml遠心管にSVFを含む遊泳下のアリコート 。
- 各チューブに、CMの25ミリリットルを追加します。 CMは5分間キャビネット内の室温でインキュベートすることによりコラゲナーゼを不活性化することができます。
- ペレットとしてSVFを収集するために1200×gで10分間遠心分離する。
- バイオセーフティキャビネットでは、各チューブから上清を吸引除去する。 （一番上の油層を確認し、任意の浮遊脂肪細胞をこの上清を吸引し、
- 30ミリリットルのCMを用いたもの遠心管にSVFペレットを組み合わせる2つの新しいの50ml遠心管の上に均等に分割する。ステップ2.3.3のように遠心分離する。二つSVFペレット（図示せず）からの上清を吸引する。
OPTIONAL：RBC溶解が所望される場合、RBC溶解緩衝液 （160mMのNH 4 Cl）の10ml中に各SVFペレットを再懸濁し、10分間室温でインキュベート。ステップ2.3.3のように遠心分離する。およびSVFペレット（図示せず）を得、上清を吸引除去する。- 5〜10ミリリットルのCM（図1B）を使用して、1新しい遠心チューブに2 SVFペレットを兼ね備えています。
- 大きな組織粒子をフィルタリングするには、新しい50mlの遠心管の上部に配置さ100μmのメッシュフィルターに再懸濁SVFペレットをピペット重力流によってフィルタリングすることができます。
- 再懸濁のピペットアリコート（およびフィルタリングされた）組織培養処理した培養皿にASCをを含むSVFペレット。 CMの適切な量と各皿を補う。
- 培地の変更なしに培養物を37℃、5％CO 2で3〜4日間、CM中で細胞を。
- 30ミリリットルのCMを用いたもの遠心管にSVFペレットを組み合わせる2つの新しいの50ml遠心管の上に均等に分割する。ステップ2.3.3のように遠心分離する。二つSVFペレット（図示せず）からの上清を吸引する。
この最初の培養期間の後、培養培地を吸引してもよいし、任意の混入赤血球を穏やかに滅菌1×PBSで洗浄することにより除去した。 CMと交換し、必要に応じて文化にASCをし続けています。用いる組織培養皿の種類及び方法SVF再懸濁ペレットを、これらの料理の間で分割される従来の組織培養後に所望の細胞数に依存するであろう。
3。 ASCの人口の特徴付け：フローサイトメトリーおよび多系統分化
孤立した後は、ASCの人口の特性評価を行うべきである。このための従来のアプローチは、フローインサイトを含むmetryは、細胞の細胞表面CD抗原プロファイルを特徴づけるためおよびインビトロ分化におけるそれらの多系列分化能を確認する。複数の系統がASCの中で評価することができるが、このプロトコルは、多系列中胚葉電位5を確認する手段として、脂肪形成、骨形成および軟骨形成系統の細胞にASCの分化を説明します。
ASCの体外多系統分化に
- ASCの骨形成分化：以前は、誘導、以下のように骨形成培地（OM）を準備するには、次のDMEM 1 500ミリリットルボトル（4.5グラム/ mlのグルコース）には、ペニシリン/ストレプトマイシン、FBS（5.0％最終濃度）の25.0ミリリットルと5.0ミリリットルを追加（10,000 IU / mlおよび万mg / mlの最終濃度、それぞれ）。デキサメタゾン（0.1μM最終）、L-アスコルビン酸2 - リン酸（50.0100μMの最終的な：これに示された最終濃度を与えるために、以下の骨形成誘導エージェントを追加）およびβ-グリセロホスフェート（最終10.0 mm）です。
- 従来、誘導収穫と約50％の密集度が達成されるように、所望の組織培養皿に培養されたASCをプレートする。メッキ、すべての実験的料理に、非誘導制御のための追加的な料理をプレート。 CMで培養一晩。
注意：50％の集密度、誘導の過程で発生する可能性があります継続的な増殖を可能にするために推奨される - 誘導の日に、培地を除去し、以下を追加します。対照ウェルに必要な骨形成実験ウェルにOMとCMを。使用される培地の体積は、組織培養皿の大きさに依存するであろう。 12ウェル皿のために、ウェル当たり1.0mlの培地で十分である。 6ウェルディッシュのために、ウェルあたりのメディアの2.0ミリリットルで十分です。 100mmディッシュのために、皿当たりのメディアの10.0ミリリットルを使用する必要があります。
- 適切な媒体の変化、3〜4日毎に14日以上の培養細胞日。高度に骨形成のASC集団は、早くも7日間の誘導のような細胞外のミネラル沈着の兆候を示すことができる。
- 骨形成分化（ すなわち、細胞外のミネラル沈着）は、リン酸カルシウムのためのフォン·コッサ組織学的染色を用いて確認することができる。この染色は、細胞外カルシウムホスフェート（ 図2参照）の存在を同定する黒褐色の沈殿物を生成する。
フォン·コッサ試薬で染色する。- 対照細胞から実験細胞からOMとCMを削除
- 1X PBS中で調製し、4.0％パラホルムアルデヒドで60分間細胞を固定。
- 1X PBSで細胞を2回洗浄する。
- 暗所で 30分間（水中で調製）2.0％硝酸銀で細胞をインキュベートする。
- 硝酸銀を取り外し、蒸留水で2回洗浄し、細胞を空気乾燥する。
- CALを開発するために60分間紫外線に細胞を公開ciumリン酸沈殿。
- 1×PBSで細胞を数回洗浄する。
- 必要に応じて、ヘマトキシリンでセルを対比染色。
- 従来、誘導収穫と約50％の密集度が達成されるように、所望の組織培養皿に培養されたASCをプレートする。メッキ、すべての実験的料理に、非誘導制御のための追加的な料理をプレート。 CMで培養一晩。
- ASCの脂肪生成分化は：誘導前に、次のように脂肪生成中（AM）を準備します（4.5グラム/ mlのグルコース）（10.0％最終濃度）のFBS 50.0ミリリットルを加えたDMEMの1 500ミリリットルボトルにおよびペニシリン/ストレプトマイシンの5.0ミリリットル（それぞれ、10,000 IU / mlおよび万μg/ mlの最終濃度）。 - 、インドメタシン（最終0.2 mM）およびインスリン（10.0μM最終デキサメタゾン（1.0μM最終）、3 - イソブチル-1 - メチルキサンチン（最終0.5mMのIBMX）：これに、示された最終濃度を得、次の脂肪生成誘導剤を追加）。
- 従来、誘導収穫と約80％の密集度が達成されるように、所望の組織培養皿に培養されたASCをプレートする。メッキ、すべての実験的料理に、さらにプレート非誘導制御のためのアルディッシュ。培養一晩CM中注：ASCの脂肪生成分化が増加フルエンシーで、より効率的であるように思われる。
- 誘導の日に、培地を除去し、以下を追加します。対照ウェルに必要な骨形成実験ウェルやCMに思います。使用される培地の体積は、組織培養皿の大きさに依存するであろう。 12ウェル皿のために、ウェルあたりのメディアの1.0.mlで十分です。 6ウェルディッシュのために、ウェルあたりのメディアの2.0ミリリットルで十分です。 100mmディッシュのために、皿当たりのメディアの10.0ミリリットルを使用する必要があります。
- 文化適切な媒体の変化、3〜4日ごとに14日以上のための細胞。高度に脂肪形成ASC集団は、早くも7日間の誘導のような脂質空胞形成の兆候を示すことができる。
- 脂肪細胞分化を受けているのASCは簡単に光学顕微鏡下で可視化することができる多数の脂質液胞を開発します。また、脂肪生成分化月（ 図2参照）、これらの空胞の中に蓄積するオイルレッドO組織学的染色を用いて確認すること。
オイルレッドOで染色する。- 実験および対照細胞から培地を除去し、10％の正式なカルシウム固定液を用いて60分間固定します。この固定液を準備するには、次のように組み合わせた。 塩化カルシウムの1.0グラム、25.0ミリリットル16％パラホルムアルデヒド（4.0％最終）及び75.0ミリリットルの蒸留水を。
- 1X PBSで細胞を2回洗浄する。
- 70％エタノールで簡単に細胞を洗浄。
- オイルレッドO溶液で5分間室温で細胞をインキュベートする。オイルレッドO溶液を調製し50.0 mlの70％エタノール50.0 mlのアセトン中で2.0グラムオイルレッドO粉末を溶解する。
- 水道水で、次いで70％エタノールで細胞を洗浄し。
- すぐに時間の経過とともに汚れの退色による染色後の細胞を可視化。
- ASCの軟骨形成分化：軟骨形成分化は、高密度培養技術を介して達成される」とは、マイクロマス培養物」と呼ぶ。次のように培養前に、軟骨形成培地（CHM）を準備します。のDMEM 1 500ミリリットルボトルに（4.5グラム/ mlのグルコース）のFBS（最終濃度1％）の5.0ミリリットルおよびペニシリン/ストレプトマイシンの5.0ミリリットル（10,000 IU / mLを加え10,000μg/ mlの最終濃度、それぞれ）。 L-アスコルビン酸-2 - リン酸（最終50.0μg/ ml）を、インスリン（最終6.25μg/ ml）を、トランスフェリン（最終6.25μg/ ml）をして、TGFβ1：これに示された最終濃度を与えるために、次の軟骨形成誘導エージェントを追加（10.0 ng / mlの）。
- のASCを収穫し、細胞をペレット化し1200×gで5分間遠心する。細胞懸濁液の濃度を決定するために、細胞を計数。
- マイクロマスペレットを調製するために、2つの細胞懸濁液を調製する：つの実験懸濁液を1×10 7細胞の密度でCHMで調製秒/ mlおよび1×10 7細胞/ mlの密度で、CM中で調製つの制御サスペンション。
- マルチウェルディッシュの個々のウェル中の細胞懸濁液の10.0μL "滴"を置きます。 37℃で2〜3時間接着させる
- 優しくCHMまたはCMのいずれかが、細胞を解離しないように注意してでメッキ液滴を重ねる。
- 培地の変化、3〜4日ごとにCHMまたはcmで最大14日間の細胞。 CHMで培養した細胞は、周囲の単層無しの細胞にはほとんどの高密度マイクロマスペレットを形成するために、この時間をかけて凝縮する。培養した対照細胞は、この縮合を受けず、多くの単層として見出される。
- 軟骨形成を確認するために、室温で（1×PBS中で調製）4.0％パラホルムアルデヒドで15分間ペレットを修正。アルシアンブルー組織学的染色を用いて硫酸化プロテオグリカンの存在を染色する。
アルシアンブルーを用いて染色する。- PAを洗う一回1X PBS中raformaldehyde固定ペレット。
- それらのpHを低下させる5分間0.1 N塩酸（pH 1.0）中のペレットをインキュベートする。
- HClを除去し、（0.1N塩酸、pH 1.0に調製した）1％アルシアンブルー試薬を追加します。室温で30分間インキュベートする。
- アルシアンブルー試薬を除去し、余分な汚れを除去するために、0.1N塩酸（pH 1.0）でペレットを洗う。
- 水道水を用いた追加の洗浄は、バックグラウンド染色を減少させるために使用されてもよい。
- 代替として、マイクロマスペレットは、採取され得る10％ホルマリンで一晩固定し、パラフィンに包埋し、切片を、アルシアンブルー染色した。
4。 ASCのフローサイトメトリー特性評価
細胞表面CD抗原プロファイルの特徴付けは、従来のフローサイトメトリーを介して達成することができる。
- フローサイトメトリーのためのASCの準備：前に分析するには、以下の構成フローサイトメトリーバッファー（FCB）を調製：1.0％BSA、2.0％のFBSおよび0.025％サポニンは、1×PBS中で調製。
- のASCを収穫し、ペレットを製造するために1200×gで5分間、細胞を遠心分離する。
- 無菌1×PBSで細胞を再懸濁し、血球計数器を用いて細胞を数える。懸濁液の細胞密度を決定します。
- ペレットに合計し、遠心分離機5×10 5個の細胞のアリコートにサスペンションを分割。
- PBS上清を除去し、氷冷した70％エタノールの過剰-20℃で60分間細胞を固定。必要であれば、必要になるまで、これらの細胞は、-20°Cの冷凍庫内にこの70％エタノール中で保存してもよい。
- 固定後、エタノールを注意深く吸引し、ゆっくりとFCB過剰のペレットを2回洗浄する。洗浄する：
- FCBの過剰を加え、穏やかにペレットを再懸濁します。
- A細胞を収集するために1200×gで5分間遠心SAペレット。
- 慎重にFCB上清を吸引除去する。
- 繰り返します。
- FCB100μlの各分量を再懸濁から最終FCB洗浄上清を除去。メーカー希望希釈を用いて所望の蛍光標識一次抗体を加える。 30分間抗体と氷上で細胞をインキュベートする。
注：蛍光標識一次抗体が利用できない場合は、非共役一次抗体を使用することができる。 - 使用した各蛍光色素（ 例えば 、FITC、PE）は、ネガティブコントロールとしてのアイソタイプ適合IgGをを含む100ミリリットルのFCBを用いて細胞のアリコートをインキュベートする。
- 追加のコントロールとして全く抗体を含まない100ミリリットルのFCBに1アリコートをインキュベートする。
- ステップ4.1.5で説明するようにFCBを用いて細胞の各アリコートを2回洗浄する。最後の洗浄の後、FCB 100mlの分量を再懸濁し、フロー解析を進める。
注意：非共役一次抗体を使用した場合：この洗浄工程は、FCBとの20分間氷上で分量をインキュベート後、メーカーが推奨する希釈を使用して、適切な蛍光標識二次抗体を補充した。ステップ4.1.5で説明したように2回洗浄します。
- ASCの分析フロー：フロー分析のために、万のイベントの最小値がカウントされるべきである。未染色及びアイソタイプ一致コントロールは前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）でゲートを設定するために使用されるべきである。このために、ステップ4.1.8のない抗体のコントロール（ すなわち未染色）が破片や死者のASCを排除するために使用しないでください。ステップ4.1.7のアイソタイプ適合IgGを制御します。陽性蛍光の領域を確立するために使用されるべきである。
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Representative Results
上記のプロトコルの概要については、マニュアル、大容量の脂肪吸引サンプルからSVFを単離するための酵素法を説明しています。このSVF内にASCを含む多数の細胞集団である。多くの研究は、標準的な組織培養条件下でこのSVFを培養するASCの種類を主成分とする可能性が付着した線維芽細胞集団を選択することを提案する。これと一致して、我々は、培養されたSVFペレットが主要な混入細胞型、すなわち赤血球、平滑筋細胞および内皮系統1の細胞の本質的になることを、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光使用して、示されている。得られたASC集団は比較的外観が均質で線維芽細胞様細胞（ 図2）から構成される。これらの接着性のASCは、標準的な組織培養条件下で培養で良好に成長し、多数の分子および細胞Bに適してい倍加時間1適度な集団を示す生体内のin vitroおよび再生の研究で iology研究。しかし、単離されたSVFの不均一な性質に照らして、ASCの人口の検証が必要である。多くの研究は、 インビトロおよびインビボの両方で 5-9これらの細胞を同定する潜在的な手段として、培養されたASCのCD抗原性プロファイルを特徴付けるために、フローサイトメトリーを使用した。 表1は 、これらの研究の多くから結果を要約する。これらのCD抗原のいくつかの発現は議論の余地があるが、それは一般的に培養されたASCは、CD13、CD29、CD34、CD44、CD49dの、CD54、CD90、正CD140aであることが合意されている。 CD34のような特定の造血マーカーの発現は、この時点では未解決のままであるが、このようなCD31およびCD45のような多数の造血CD抗原の不在は、ASCの中胚葉起源と一致している。近年、ASC抗原性プロファイルは、フローサイトメトリーによって決定されるように、特定のsubpopを選択するために使用されているキュレーション強化分化能力とのASCの生産を期待して10月12日 。
中胚葉、外胚葉と内胚葉系譜への分化に定義された培養条件の結果を用いて、ASCの人口の体外誘導における検証の中で最も一般的な手段として、（ 図2）（レビューのために4を参照）。 in vitroで三胚葉電位が再生モデル系、骨形成への分化の多種多様なASCの使用をもたらした一方で、脂肪形成および軟骨形成細胞は、ASCを識別し、その多分化性を確認することが一般的に十分である。我々の手では、オイルレッドO 5を使用して染色し、明るい脂質液胞を含む細胞内のASC結果の脂肪細胞分化。骨分化用アルカリホスファターゼ陽性細胞をもたらし、リン酸カルシウムフォン·コッサ染色5を用いて染色する細胞外のミネラルの蓄積。高密度マイクロマス条件下での軟骨形成分化は、硫酸化プロテオグリカン（アルシアンブルー染色を用いて検出）を含み、コラーゲン2型5を発現ペレットを生成する。骨格筋および平滑筋分化の両方は、骨格筋ミオシンおよびMYOD1および平滑筋アクチン5、13、14について染色ASCを用いて見ることができる。外胚葉系譜への分化が誘導のASCとのNeuN、神経細胞の転写因子5を含め、多数の神経細胞マーカーの発現による神経様形態を前提によって示唆されている。最後に、細胞内で確立された条件15の結果に基づいて、肝/内胚葉系列に向けてASCの誘導という表現α-フェトプロテイン、肝細胞のよく知られたマーカー。一緒に過去10年間に公開された多数の他のものとこれらのマーカーは、強くASCを容易に維持することができる多能性幹細胞集団であることを示唆している試験管内で増殖させ、3胚性生殖系列の細胞に向かって誘導した。 生体内での再生電位（レビューのために4を参照）に連結され、ASCが再生研究の科学者や臨床医のツールに強力な追加があります。
図1。脂肪吸引サンプルからのヒトASCを手動で、酵素の単離。分離のための調製A.：前に分離するには、次のコンポーネントを準備する必要があります：高圧蒸気滅菌により滅菌1）1X PBS（カルシウムまたはマグネシウムを含まない）、0.075から0.1パーセントのコラゲナーゼタイプIAの2）溶液、1X PBS中で調製し、滅菌0.22μmフィルターユニットを用いて濾過、ASの3）のASC人口のその後の培養のためのコントロール培地（CM）。B.単離CS：脂肪吸引物からの間質血管画分（SVF）を単離するためのステップバイステップのガイドが表示されます。ステップは、滅菌1X PBSで脂肪吸引洗浄を含み、コラゲナーゼタイプIA、遠心分離によるSVFのコレクションとSVF濾過を用いて消化。 SVFのその後の培養は、ASCの人口を含む接着性繊維芽細胞の人口になります。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください。
図2。付着性のASC人口の多系統分化能。培養SVF細胞は接着、線維芽ASCの比較的均質な集団になる。脂肪形成、骨形成、軟骨形成、骨格筋形成および円滑な筋原系統の細胞に定義されている条件の結果の下のASC人口の誘導。また、ASCはまたNeuNを、ニューロンのマーカーおよびα-フェトプロテイン（AFP）、内胚葉/肝細胞系統の確立されたマーカーを発現する、外胚葉系統の細胞に分化させることができる。いくつかの組織学および免疫蛍光画像は、以前に公表された結果の1,5,6,7,8,9から取得されます。一緒に組織学的、免疫組織や蛍光染色で分化系統が示されている。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください。
| 発現プロフィール | ||
| 陽性発現 | 否定の表現 | |
| CD9、CD10、CD13、CD29、CD34、CD44、CD49a、CD49b、CD49dの、CD49E、 CD51、CD54、CD55、CD59、CD61、CD63、CD71、CD73、CD90、CD105、CD138、CD140a、CD146、CD166、HLA-ABC、STRO-1 | のCD11a、CD11bの、CD11cの、CD14、CD16、CD18、CD31、CD41a、のCD49f、CD45、CD50、CD56、CD62E、CD62L、CD62P、CD104、CD106、CD133、CD144、CD146、 HLA-DR、SMA、ABCG2 | |
| ASCの提案の表現型 （2つ以上の研究の間に共通） | CD10、CD13、CD29、CD34、CD44、CD49dの、CD54、CD90、CD140a、 HLA-ABC、STRO-1 | のCD11a、CD11bの、CD11cの、CD14、 CD31、CD45、CD106、CD144 |
| ASCは中物議マーカー （複数の研究上の微分結果） | CD105、CD117、抗CD140b、CD146、CD166、SMA、HLA-DR | |
| 間質CELLマーカー | CD29、CD44、CD73、CD90、CD166 | |
| 造血マーカー | CD31、CD34、CD45、ABCG2 | |
| 太字で示した2つ以上の研究の間に共通のマーカー SMA =平滑筋アクチン HLA =ヒト白血球抗原 ABCG2 =多剤トランスポータータンパク質のG2 | ||
表1。ヒトASCの細胞表面発現プロファイル。
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Discussion
ASCの分離のための脂肪組織は、さまざまな形で来ることができる：注射器抽出または吸引補助脂肪形成術（ すなわち脂肪吸引）のいずれかによって得られた小さな断片に切除または脂肪形成術によって得られた組織の固体片から。競合する研究は16,17提示されているように、複数のSVF細胞（ASCは、それによって）が切除または脂肪吸引サンプルから得ることができるかどうかは不明である。それは、脂肪組織の形態のいずれかがある限り、オペレータが彼らの分離技術に堪能であるように、SVFの細胞とASCの単離のために適したよりも多い可能性があります。しかし、脂肪吸引は、その中に切除よりも有利を保持し、それは低侵襲で、大幅に少なく術後ケアを必要とします。脂肪吸引の種類は、超音波支援、パワーアシストおよびレーザ支援脂肪吸引18などの技法を含め、過去10年間に増加しているが、最も一般的なのは、腫れ上がっ脂肪吸引のままここで脂肪コンパートメントは19を吸引する前に滅菌生理食塩水、麻酔薬や血管収縮薬の大量が殺到している。技術の選択は、外科医から外科医に異なる場合があります。抽出手段は、研究者にとって重要に見えるかもしれないがしかし、それは技術はASC数および生存率に対する効果を有し得ることを理解することが重要である。例えば、脂肪吸引真空圧力を増加させることは、負SVF細胞収率20に影響を与えることができる。また、ASCの増殖の減少は、超音波アシスト脂肪吸引17時に測定されています。
しかし得られた貯蔵温度は、SVF生存率および最終的なASC歩留まりに影響を与える可能性があるとして、吸引を迅速に処理する必要があります。松本らによる研究は、吸引物がより長い24時間21室温で保存されている場合ASCの収率が低下することが示されている。必要に応じて、4℃で24時間貯蔵は、任意の有害な効果なしに使用することができるこの蓄積時間は、その点を超えて増加する場合ASC集団の生物学的特性に複数しかし、再度、細胞生存率を減少させることができる。脂肪吸引物処理の容易さを直接その全体積に関連する。シリンジ抽出により得られたボリュームが小さく、処理するのが比較的容易である。しかし、脂肪吸引によって得られる大きなボリューム吸引液は、物理的な課題を提示することができます。吸引量が大きい場合には、例えば、それを洗浄することができるように、吸引容器からの脂肪を移送ような単純なものは、問題を提示することができる。この資料に記載されているプロトコルは、これらの課題のいくつかを軽減するためのものです。
概して、この資料に記載されている酵素法を用いて、脂肪吸引物からのASC集団の単離は、過去10年間で大幅に変更されていません。脂肪吸引物からASCの分離の彼らの説明に優れているPubMedによって使用でき、多数のプロトコルがあります。 MそのうちのOSTはわずかな変更で非常によく似たプロトコルの概要を説明します。基本的には、脂肪吸引は、汚染物質の洗浄、ASCの人口を含む、SVFとSVFを解放するために、酵素的に消化し、遠心分離により収集されます。ほとんどの大容量脂肪吸引物は、真空容器の何らかのタイプに到着 - の構成は、外科医から外科医に変えることができる。適切バイオセーフティーフード内に置く前に洗浄されていない場合、コンテナ自体が汚染源となる可能性があるため、このプロトコルは、洗浄前に大きな滅菌ビーカーに吸引を除去することを推奨しています。成熟脂肪細胞の溶解、中間脂肪層および生理食塩水の下層から生じる赤血球を汚染トップ、油層：一旦移し、重力によって沈降させ、吸引物は3層に分離する。我々はそれが得られた細胞培養物（未発表の観察）に対して毒性であることに気づいたように、オイル層を除去する必要があります。また、このプロトタイプCOLは、生理食塩水とRBCの遊泳下の前のASCを培養後、RBCを汚染する潜在的な数を減少させるために最初の洗浄に削除されることをお勧めします。しかし、フランシスらの研究は、この遊泳下のものASC 22の供給源であり得ることを示唆している。 10ミリリットルの血清学的ピペットの使用は、この遊泳下のの除去が比較的容易になります。残りの部分から、次いで、容易に滅菌PBSを用いて洗浄し、又は所望であれば、滅菌PBS 23-25、汚染の機会を減少させるために抗生物質や抗真菌剤を補充することができる脂肪層である。洗浄後、脂肪組織を酵素コラゲナーゼタイプIAの滅菌溶液を用いて消化する。このような動画に示さミリポア手段として濾過ユニットの使用は、無菌的に洗浄した脂肪組織を37℃で後続の水浴消化のために添加することができる密閉容器内にコラゲナーゼをフィルタリングする便利な手段を組み合わせ
使用されるコラゲナーゼのタイプは、より一般的であるように見せかけ1コラゲナーゼタイプIA、24、25群からの基に変化した。しかし、商業的にコラゲナーゼの11以上の異なる種類の利用可能な、特定の組織のための消化親和性を有する、それぞれがあります。脂肪組織の消化のために、このようなシグマアルドリッチのような企業は、コラゲナーゼI型およびII型を推奨し、両方のタイプがよく、今日の文献1、24〜27で表されます。元の記事では、ズクらは、0.075％1の濃度でウシ源から得コラゲナーゼタイプIAを使用しています。しかし、コラゲナーゼタイプIAの最も商業的な供給源は、現在の嫌気性細菌クロストリジウムヒストリまたはEから得られ、遺伝的にCで修正された大腸菌ヒストリ遺伝子。多くの企業は原油から硫酸アンモニウム沈殿によって製造されたものに、コラゲナーゼタイプIAの数々の準備を提供します。ザ·このJoveの記事で概説したプロトコルは、コラゲナーゼの活動だけでなく、非特異的プロテアーゼ、クロストリパインおよびトリプシン酵素活性だけではないが含まれているIa型コラゲナーゼの粗調製を使用しています。これらの追加の酵素は消化効率28に重要ですが、そこの粗コラゲナーゼタイプIA 28、29に関連する多くの変動に多くのことを報告するもので、効率的な消化23を得るために、0.2％までのコラゲナーゼのそれらの濃度を増加させる。粗コラゲナーゼタイプIAを用いてこれらのグループは、酵素の性能を改善し、脂肪マトリックス内の細胞の安定性を高めるために、ウシ血清アルブミン（0.1から1.0パーセントのBSA）との補給をお勧めします。この資料に記載されているプロトコルは、消化効率に悪影響を与えることの補充なしで、コラゲナーゼを使用していますしかし、これは、必要でないかもしれない。
以上の定義されたコラゲナーゼCOMPを使用したい方にosition、プロテアーゼの正確なブレンドと一緒に、高度に精製されたコラゲナーゼを含む市販の供給源が利用可能になりました。これらの製剤は、クロストリジウムコラゲナーゼタイプIおよびII高活性のようなディスパーゼおよびサーモリシンなどの既知の中性プロテアーゼ活性、それらを組み合わせることを精製する。コラゲナーゼおよびサーモリシンを使用した効率的な脂肪の消化はZachar ら 27により報告されている。この作品との合意では、Pilgaard ら 30もコラゲナーゼおよびサーモリシンのいくつかのブレンドを使用して優れた消化効率を報告している。しかしながら、それらは、コラゲナーゼとディスパーゼの調製物を用いて良好な消化効率を観察しない。
脂肪組織からの細胞の単離のための消化時間は、研究から研究に変えることができる。多くの公開されたプロトコルは、1〜2時間27、30の消化時間をお勧めします。しかし、過度の消化時間は、最終的に生存可能なASの数に影響を与えることができることを理解することが重要であるCSとその幹細胞表現型。 Pilgaardらは、37℃で2時間の消化は消化、過去45分は、消化を、15分毎に2までの時間の最大値を観察することを推奨する。Zacharらとともに、組織解離およびASC機能30の最適なバランスを与えることを決定した脂肪組織は、より均質な外観27を取る一旦停止されている。我々は、この勧告に同意する。しかしながら、0.075から0.1パーセント、多くともコラゲナーゼタイプIA調製物は30〜45分で多量の脂肪吸引物を消化することができ、これらの時間は十分な数の細胞を遊離するのに十分であることをことを我々の経験である。したがって、このプロトコルは、30分の消化時間を推奨しています。より多くの時間が必要な場合は、脂肪吸引の整合性が監視されるべきであり、脂肪吸引は、「クリーミー」又は「スープ状」の外観（ 図1）を前提としたときに消化を停止した。
第一回電子消化が解除SVFの単離を単純に遠心分離を用いて達成され、完了する。しかし、吸引圧のように、遠心分離の物理的な効果は、SVFの生存能力と文化のために利用可能なASCの数に影響を与える可能性がある。栗田と同僚31による研究では、3000 XGを超える速度は、ASCを損傷する可能性があることを示している。しかし、速度はSVFの十分なペレット化を確実にするほど変化するはずです。原則として、この1を含むほとんどのプロトコルは、1,200-1,500 x gでの遠心分離速度をお勧めします。ケアは関係が特定の遠心ローターに依存する彼らは、遠心力（Gで測定）と（回転数として測定）遠心分離速度との関係を理解していることを確実にするために研究者が注意する必要があります。しかしながら、原則として、例えば、1,200×gでの低級遠心力は、しばしば遠心分離速度と同等であり、安全に交換可能に使用され得る。
次のスピニング、いくつかのディ油及び「ふわふわ」白色脂肪細胞、コラゲナーゼ中間層および細胞ペレットの最上層：stinct層を遠心分離管（ 図1）において観察される。のASCを含む、RBCの上層と下層白色SVFペレット：ペレット自体が2つの別個の層を有していてもよい。オイルは、細胞培養に対して毒性であってもよく、脂肪細胞が戻ってより原始的な細胞型32への脱分化し得ることが示されているように、このプロトコルは、油や脂肪細胞を慎重に吸引することをお勧めします。しかしながら、所望であれば、これらの脂肪細胞は、この時点で収穫することができる。ため、これらの汚染物質のために、このプロトコルは、彼らの十分な除去を確実にするために、余分な洗浄工程を推奨しています。このステップでは、研究者が、ろ過のその後の容易さのために複数のSVFペレットを組み合わせることができます。濾過は、線維性物質の大きな破片及び消化後の細胞凝集体の存在のために必要である可能性が高い。これらの材料は、容易に除去される70または100ミクロンメッシュフィルターを通してシンプルな重力ベースろ。ろ液のアリコートは、必要に応じて有核細胞の数及びASCの付着および拡張のためにプレーティングし、残りの濾液をカウントするために取ることができる。
できるだけ多くの赤血球を除去するために勤勉な試みにもかかわらず、ASCの準備は、RBCの混入なしに、完全にできなくなります。私たちのオリジナルの記事では、160 mMの塩化アンモニウムの低張液中でのペレットの再懸濁を介してこれらの赤血球を除去することを提案した。その後の単離の記事の大半は、このステップが含まれているし、滅菌水を使用している場合に注意がSVF細胞がさらされる時間を最小限に抑えるために、注意する必要がありますが、NH 4 Cl系溶液または滅菌水22〜24、27、33を使用することをお勧めします低張液27へ。赤血球は、非付着性細胞集団であり、簡単に一晩培養した後に除去することができるただし、このステップは必要でないかもしれないASCの人口。せいぜい逸話ながらまた、これらの赤血球は、得られる接着細胞（ズク、未発表の観察）の初期展開を向上させるために表示されます。このように、このプロトコルはRBC溶解工程を排除し、初期ASC培養物を培養培地の変更なし第3〜4日間これらのRBCの存在下で膨張させることが提案されている。この観察の理由は、血液細胞を汚染によるパラクリンシグナル伝達のいくつかのタイプであり得るか、単にRBC溶解ステップを排除してより良好な生存率に起因し得る。これに続いて、培地を吸引することができ、RBCの大部分は緩やかに滅菌1×PBSでプレートを洗浄することにより除去した。時間が経つにつれて、残りのRBCは、最終的に死ぬと文化から削除される。
ZacharとBoquestによる研究は、再懸濁SVFペレット25〜50％は組織培養プラスチック23、27に準拠していると推定している。得られた「継代0 "ASC CUはltures原点の内皮であることが提案のASC、より不規則な形状の細胞であると考え、小さな丸いセルからなる、不均一である。我々を含む多くのグループによる研究では、SMCの、造血細胞およびASC培養1における線維芽細胞などの細胞型を汚染がないことを確認しているが、追加の細胞型の存在は排除できない。 実際 、Tallone らは 0の文化の通路を特徴とし、4つの異なる集団を観察しました：1）小さくて丸い急速に再生細胞を、2）紡錘状の線維芽細胞は、ASCであると考え、3）ゆっくりと、より制限されたとの大規模な細胞を複製する潜在的な（ つまり、前脂肪細胞）と通路34との失われた4）立方内皮細胞。その後の研究は、円形、迅速に更新された細胞集団が最高の多能性を有することが示されており、典型的な幹細胞マーカー35,36を発現している。さらに、それらはのために「回転楕円体」を形成することができる彼らの急速な普及と、多くの場合、紡錘形の線維芽細胞に囲まれています。このように、上記で提案紡錘状ASC集団は、これらの細胞を起源とする可能性がある。これらの継代0 ASC培養の初期膨張に続いて、得られた培養物をより線維芽細胞、均一な組成物を想定して、時間をかけて継続的な培養は、ASCのために選択したと考えられている。しかし、混入した細胞の残骸は完全に排除することはできない、したがって、ASCの人口は依然として異質考慮されるべきである。
この資料に記載されているプロトコルは、安価で簡単であり、通常は組織培養施設で見つかっていない機器のいずれかの部分を必要としませんが、そのような設備を必要とするという欠点を持っています。多くの研究は、動物モデルを通してASCの並進のアプリケーションを調査しており、ASCを用いた臨床研究が現れ始めている（総説については4
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Disclosures
この原稿の著者は、カリフォルニア大学とサイトリピューにライセンスが所有する特許の共同発明者である。
Acknowledgments
作者は認めるしたいを含む記載されているプロトコルとASCのその単離の発展に貢献し、それらの追加の研究人材、感謝博士H.ピーター·ローレンツ博士、博士宏Muzuno、MD、博士ジェリー黄、MDを博士アダム·カッツ、MD、博士はウィリアム·フトレル、MD、博士は栄チャン、DDS、PhDは、博士ラリッサロドリゲス、MD、博士はゼニアルフォンソ博士は、博士ジョン·フレイザー博士。提示された結果は、NIAMSおよびNIDCR研究所などの国立衛生研究所から研究助成金によって部分的に資金を供給されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone - water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
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