Summary
الكورتيزول (CORT) يتراكم في جذع الشعرة متزايد من البشر والرئيسيات غير البشرية. وصفنا طرق لاستخراج وتحليل CORT الشعر مع دقة عالية وحساسية. قياس الشعر CORT بشكل خاص مناسبة تماما لتقييم الإجهاد المزمن على مدى فترات من أسابيع إلى أشهر.
Abstract
أدرج الكورتيزول هرمون التوتر (CORT) ببطء في جذع الشعرة متزايد من البشر، والرئيسات من غير البشر والثدييات الأخرى. قمنا بتطوير والتحقق من صحتها وسيلة لCORT استخراج وتحليل من شعر قرد هندي صغير وتكييفها في وقت لاحق هذا الأسلوب للاستخدام مع شعر فروة الرأس الإنسان. وعلى النقيض من كورت "عينات نقطة" تم الحصول عليها من البلازما أو اللعاب، الشعر CORT يوفر تدبيرا متكاملة من النشاط الغدة النخامية الكظرية (HPA) النظام، وبالتالي الإجهاد الفسيولوجية، خلال الفترة من هرمون التأسيس. لأن الشعر فروة الرأس الإنسان ينمو بمعدل 1 سم / الشهر، ومستويات CORT تم الحصول عليها من قطاعات عدة الشعر سم في الطول يمكن أن يحتمل أن تكون بمثابة العلامات البيولوجية من التوتر شهدت على مدى عدد من الشهور.
في أسلوبنا، يتم غسلها كل عينة الشعر أولا مرتين في الأيزوبروبانول لإزالة أي CORT من الخارج من جذع الشعرة التي أودعت من عرق أو الزهم. بعد التجفيف، ووالأرض العينة إلى مسحوق ناعم لتفريق الشعر في بروتين المصفوفة وزيادة المساحة السطحية لاستخراج. يتم استخراج CORT من داخل جذع الشعرة في الميثانول، يبخر الميثانول، وأعيد استخراج العازلة في الفحص. المستخرجة CORT، جنبا إلى جنب مع معايير وضوابط الجودة، ثم يتم تحليلها عن طريق حساسة ومحددة متاحة تجاريا انزيم المناعه (EIA) عدة. يتم تحويل قراءات من تقييم الأثر البيئي لخريج CORT في ملغ مسحوق شعر الوزن. وقد استخدمت هذه الطريقة في المختبر لدينا لتحليل CORT الشعر في البشر، وعدة أنواع من القرود المكاك، القرد الأميركي، والكلاب، والدببة القطبية. وقد أثبتت العديد من الدراسات سواء من مختبرنا ومن مجموعات بحثية أخرى في تطبيق واسعة من CORT الشعر لتقييم التعرض التوتر المزمن في الطبيعية، فضلا عن بيئة معملية.
Introduction
وقد استخدم قياس CORT في البلازما واللعاب، أو أحيانا في البول أو البراز وذلك في مؤشر الإجهاد الفسيولوجية منذ اكتشاف Selye للدور المحور HPA في الإجهاد 1. على الرغم من أن العديد من ورقات وقد نشرت المتعلقة النشاط HPA إلى المواقف العصيبة الحاد، وقد أعاق هذا المجال من خلال عدم وجود مؤشر بسيط وموثوق بها من الإجهاد الفسيولوجية المزمن. تنشأ هذه المشكلة بسبب البلازما واللعاب على حد سواء تقديرات العائد "نقطة" من النشاط HPA التي تخضع لاختلاف الساعة البيولوجية، ويمكن أن يكون مرتبك من قبل الاضطرابات البيئية. عينات البول والبراز تسفر قياسات CORT و / أو إفراز الأيض التي تمتد عدة ساعات تصل إلى يوم كامل في بعض الحالات. جمع عينات متعددة باستخدام قد توفر أي من هذه المصفوفات مؤشر مركب الخام من مستويات CORT مع مرور الوقت، ومع ذلك، فإن أيا من هذه النهج يوفر مؤشر حقا على المدى الطويل من النشاط HPA واستجابة لهذا سيوقف لالضغوطات المزمنة.
قياس CORT في الشعر بدأت لملء هذه الحاجة الهامة في الأدب الإجهاد. أظهرت الدراسات الأولية من قبل العديد من المختبرات وجود CORT في الشعر الإنسان، ولكن لم تحقق ما إذا كانت مستويات CORT الشعر تغيرت بوصفها وظيفة من التوتر 2. كما كان لدينا مختبر مهتمة لسنوات عديدة في تنظيم محور قرد هندي صغير HPA من قبل مختلف العوامل الاجتماعية والسلوكية 3، شرعنا في إنشاء والتحقق من صحة طرق لاستخراج وتحليل ريسوس قرد الشعر 4. استنادا إلى فرضية أن يتم تضمينها CORT المنقولة عن طريق الدم ببطء وبشكل مستمر في نمو الشعر، وكان الغرض من هذه الطريقة الجديدة لاستخدام مستويات المستمدة من الشعر CORT وذلك في مؤشر متكاملة من النشاط HPA على مدى فترات من أسابيع إلى أشهر.
ووجهت العديد من التحديات المنهجية في تطوير هذا البروتوكول. الأولى، وكانت دراسات سابقة أظهرت أن كميات صغيرة سو تعميم CORT تفرز في العرق والزهم، وبالتالي يمكن أن معطف السطح الخارجي للرمح الشعر 2. من أجل القضاء على هذا الخلط المحتملة، وضعنا إجراء غسيل اللطيفة التي تظهر لإزالة CORT الخارجية في حين وجود تأثير ضئيل على CORT الحاضر داخل رمح الشعر النامي. وبالتالي، قرد الشعر تخضع لهذا الإجراء (أي اثنين 3 مين يغسل مع الأيزوبروبانول) خسر ما يقرب من 7-8٪ من المحتوى الكلي للCORT الشعر، ويغسل الثالثة إزالة أقل من 1٪ أكثر من الستيرويد في العينة 4. يبدو أن هناك أكثر CORT الخارجية في شعر الإنسان، منذ نفس الإجراء إزالة ما معدله 27٪ من إجمالي المحتوى CORT من العينات (ك. روزنبرغ وجيه ماير، غير منشورة). مثل الشعر قرد، ومع ذلك، تضمنت غسل إضافية أقل بكثير CORT (حوالي 7٪) من يغسل الأولين. لذلك، النتائج من كل من القرد والإنسان الشعر دعم حجته بأن معظم (إن لم يكن كلها) CORT الخارجية يمكن إزالتها مع الحفاظ على فارك الرئيسيةنشوئها CORT داخل المصفوفة الشعر الداخلية. الثانية، وأظهرت دراسات تجريبية لدينا أيضا أن طحن الشعر قبل استخلاص زيادة كبيرة الانتعاش CORT من العينة، ويفترض طريق كسر الباب مفتوحا أمام مصفوفة البروتينية المعقدة للعمود الشعر، فضلا عن زيادة المساحة المتاحة لاختراق المذيبات. تم تطوير طريقتين طحن مختلفة، ولكل منها مزاياه وعيوبه. طريقة 1، والذي يستخدم طاحونة الكرة، لديه ميزة من إنتاج أرقى مسحوق. ومع ذلك، مطحنة الكرة هو بند معدات باهظة الثمن نسبيا، وإذا ما استخدمت مع الجرار طحن القياسية والكرات، وأنها قادرة على طحن عينات اثنين فقط في كل مرة. عينات صغيرة هي أيضا من الصعب معالجة باستخدام طاحونة الكرة طحن مع الجرار القياسية. طريقة 2، والذي يستخدم beadbeater، هو أقل فعالية في القدرة الطاحنة التي. ونتيجة لذلك، متوسط الانتعاش CORT هو أقل ما يقرب من 10٪ باستخدام هذا الأسلوب بالمقارنة مع مطحنة الكرة (بيانات غير منشورة). من ناحية أخرى، beadbeaterإلى حد كبير أقل تكلفة من طاحونة الكرة، 16-24 العينات يمكن أن تكون الأرض في وقت واحد اعتمادا على نموذج، وهذه الطريقة مناسبة تماما للعينات الصغيرة. بسبب الانتعاش الفرق المذكورة أعلاه، فإنه من المستحسن استخدام نفس الأسلوب طحن لجميع العينات ضمن دراسة خاصة.
مرة واحدة تم تجهيزها عينات الشعر، ويتم استخراج أنها مع الميثانول وCORT في مقتطفات تم تحليلها عن طريق مجموعة EIA تجارية حساسة ومحددة صممت في الأصل لقياس CORT اللعابية. تم التحقق من سلامة إجراءات استخراج وفحص جزئيا من خلال إظهار أن التخفيفات المسلسل من مقتطفات من عينات شعر القرد أسفرت EIA القراءات التي يتوازى بشكل وثيق القراءات التي تم الحصول عليها من المعايير CORT أصيلة. نحن بعد ذلك أظهرت أن CORT الشعر (بالإضافة إلى البلازما واللعابية CORT) كان حساسا إلى الضغوطات الحياة الرئيسية لنقل تكليف إداريا من القرود إلى أرباع المساكن الجديدة 4،5. وحاضرايوفر ر رقة وصفا مفصلا للأساليب تستخدم بشكل روتيني في مختبرنا لمعالجة عينات شعر الإنسان والقرد، واستخراج وتحليل CORT من هذه العينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جمع العينات والتخزين
- شعر الإنسان
- تأمين كامل طول الشعر لأخذ عينات (تصل إلى عرض قلم رصاص في القطر) مع الشريط المطاطي أو مقطع. قص الشعر أقرب إلى فروة الرأس ممكن (مع الحرص على عدم شق الجلد) مع مقص نظيفة. ملاحظة: المنطقة أخذ العينات هو معيار قمة الرأس الخلفي من الجمجمة.
- وأفادت بعض المحققين انخفاضا في مستويات CORT شعر الإنسان مع البعد عن فروة الرأس 6، والذي قد يكون ناجما عن تبييض من التعرض المتكرر للماء والشامبو 7 (على الرغم من رؤية Manenschijn وآخرون. 8 وطومسون وآخرون. 9 لنتائج العكس في والذي لوحظ أي انخفاض قطعي) لتقليل تأثير هذه الإمكانات "تأثير تبييض"، نوصي جمع شرائح الشعر الأقرب إلى فروة الرأس بطول لا يزيد عن 3 سم (على افتراض معدل نمو من 1 سم / شهر 10، و سم 3 يحتوي على الجزء CORT التي أودعت على ما يقرب من 3 شهور). لتحقيق ذلك، استخدام مسطرة لقياس 3 سم من أول خطوة من نوعها وقطع مرة أخرى لانتاج العينة 3 سم. ملاحظة: بمجرد قص الشعر لمدة، فإنه لم يعد ضروريا للحفاظ على خيوط في المواءمة ما لم تشتمل على دراسة خفض العينة إلى شرائح 1 سم طويلة منفصلة لإنشاء تقويم بأثر رجعي من CORT ترسب على مدى فترة زمنية قبل أخذ العينات 6.
- وضع عينة الشعر في الحقيبة مصنوعة من رقائق الألومنيوم، ورقة مغلف نظيفة، أو 15 مل المسمار غطاء البولي بروبيلين أنبوب الطرد المركزي من النوع الذي يستخدم لغسل العينة. كما CORT غير مستقر للغاية في الشعر 2، ويمكن تخزين العينات إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية، وعند الضرورة، يتم شحنها بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- يجب أن تمارس الإجراء جمع الشعر على المتطوعين ويجب أن يكون وزنه العينات الممارسة قبل الشروع في دراسة كاملة. ملاحظة: عينات الشعر كما SMAليرة لبنانية كما 5-10 ملغ يمكن تحليلها باستخدام الأساليب المذكورة هنا، على الرغم من أنه أمر مرغوب فيه لجمع عينات> 10 ملغ لتقليل احتمال الحصول على تقييم الأثر البيئي القراءات دون أدنى CORT القياسية.
- قرد الشعر
- يحلق شعر (100-250 ملغ) من مؤخر العنق باستخدام المقص الحيوان القياسية. يحلق أقرب إلى الجلد ممكن، والحرص على عدم شق الجلد ويتسبب في حدوث نزيف لأن مستويات CORT الدم مرتفعة للغاية بالمقارنة مع تلك التي وجدت في الشعر. ملاحظة: تم اختيار منطقة الرقبة لأخذ العينات الروتينية لأنه عموما هو مصدر جيد للشعر ويمكن ملاحظتها بسهولة لنمو الشعر قبل اختزال.
- وضع عينة الشعر في الحقيبة مصنوعة من رقائق الألومنيوم أو 15 مل المسمار غطاء البولي بروبيلين أنبوب الطرد المركزي. يجب أن يتم تخزين العينات قرد الشعر وشحنها بنفس الطريقة كما هو موضح أعلاه للحصول على عينات شعر الإنسان.
- لأن الشعر قرد، على عكس الشعر فروة الرأس الإنسان، وينمو لمدة معينة ثم شارعمكتب خدمات المشاريع المتزايدة 11، فهو عموما ليس ممكنا في هذه الحالة استخدام المسافة من الجلد كتقويم لCORT الترسيب. ومع ذلك، إذا كان الحيوان يمكن أخذ عينات أكثر من مرة (على سبيل المثال، خلال امتحانات الصحية الروتينية الدورية)، فمن المستحسن لإجراء الحلاقة الأولي لتحديد نقطة زمنية أساسية، ثم reshave نفس المنطقة بعد انقضاء الفترة الزمنية المطلوبة. أودع CORT في العينة الثانية أثناء الفاصل الزمني الحلاقة reshave، الذي يبيح للإسناد الدقيق للمحتوى CORT العينة إلى النشاط HPA أكثر من تلك الفترة 5.
2. غسل العينة والتجفيف
- غسل
- وضع كل عينة الشعر الى 15 مل المسمار غطاء البولي بروبيلين أنبوب الطرد المركزي.
- إضافة 5 مل من عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) الصف الأيزوبروبانول لكل أنبوب تليها انعكاس المتكرر لمدة 3 دقائق باستخدام المدورة.
- صب الأيزوبروبانول في حاوية النفايات، مع جلا تخسر أي من العينة.
- كرر الخطوات من 2.1.2 و2.1.3 مرة أخرى.
- تجفيف
- تجفيف الشعر لمدة 2-3 أيام على الأقل لضمان كاملة الأيزوبروبانول التبخر.
3. طحن العينة واستخراج CORT - طريقة 1 لعينات كبيرة
- عينة طحن
- وضع ما يصل إلى 250 ملغ من الشعر المجفف إلى 10 مل الفولاذ المقاوم للصدأ طحن جرة جنبا إلى جنب مع واحد 12 ملم الفولاذ المقاوم للصدأ طحن الكرة.
- طحن العينة لمدة 6 دقائق بسرعة 25 هرتز باستخدام طاحونة الكرة.
- يصل وزنه الى 50 ملغ من مسحوق الشعر على توازن التحليلية ومن ثم تحويلها إلى بيئة نظيفة 2.0 مل أنبوب microcentrifuge البولي بروبلين لاستخراج CORT لاحقة.
- استخراج CORT
- إضافة 1.0 مل من HPLC الصف الميثانول إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على عينة المجفف.
- غطاء الأنبوب واحتضان العينة ل18-24 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع زملاءانعكاس nstant باستخدام المدورة.
- أنابيب الطرد المركزي في 14،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتكوير الشعر المجفف.
- نقل 0.6 مل من طاف لنظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه من الشعر المجفف.
4. طحن العينة واستخراج CORT - الطريقة 2 للعينات الصغيرة
- عينة طحن
- وضع ما يصل إلى 60 ملغ من الشعر في preweighed 2 مل أنبوب microcentrifuge عززت لحبة الضرب.
- Reweigh القارورة للحصول على وزن العينة.
- إضافة ثلاث حبات 3.2 مم الصلب الكروم على كل قارورة ثم تطحن العينة لا يقل عن 2 دقيقة في الخافق حبة. إذا يكشف الفحص البصري أن العينة تم المسحوق غير كافية، ثم نفذ طحن إضافية ل0.5 أو 1 دقيقة. ملاحظة: ليس هناك حاجة إلى نقل الشعر الأرض في هذه الحالة لأنه يتم تنفيذ استخراج CORT في نفس القارورة كما طحن.
- استخراج CORT
- إضافة 1.5 مل من HPLC الصف الميثانول إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على عينة المجفف.
- غطاء الأنبوب واحتضان العينة ل18-24 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع انعكاس مستمر باستخدام المدورة.
- أنابيب الطرد المركزي في 10،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الشعر المجفف. ملاحظة: تبقى حبات الكروم الصلب في الأنبوب مع الشعر خلال استخراج والطرد المركزي الخطوات، التي تمثل أقل سرعة الطرد المركزي مقارنة مع الطريقة 1.
- نقل 1.0 مل من طاف لنظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه من الشعر المجفف.
5. تبخر المذيبات وعينة إعادة إعماره
- تجف أسفل الميثانول باستخدام المبخر فراغ أو تيار من غاز النيتروجين إذا المبخر فراغ غير متوفر. إذا تم استخدام المبخر فراغ، بخار الميثانول يمكن المحاصرين عن طريقمن فخ الباردة أو فخ الكيميائية مجهزة خرطوشة الفحم المنشط.
- بعد إزالة الميثانول، إعادة استخراج CORT في حجم مناسب من EIA العازلة الفحص (فحص مخفف). إذا من المتوقع القيم CORT عالية نسبيا، ثم استخدام حجم المخزن المؤقت من 0.4 مل أو أكثر. إذا من المتوقع القيم المنخفضة نسبيا، ومن ثم يمكن خفض مستوى الصوت إلى 0.2 مل أو أقل لزيادة حساسية. ملاحظة: 0.2 مل هو حجم كاف لتشغيل مأخوذة مكررة من العينة مرتين على الأقل في حالة مطلوب باعادة العينة.
- إما مقايسة العينة المعاد فورا أو تجميده عند -20 درجة مئوية لتحليلها لاحقا. ملاحظة: إذا تم تجميد العينة المعاد، فمن المهم تجنب التسامي خلال فترة التجميد منذ تغيير في حجم العينة سيؤدي إلى قيمة CORT كاذبة عندما يتم تنفيذ العمليات الحسابية النهائية.
6. CORT الفحص وتحويل البيانات
- مقايسة مقتطفات الشعر لCORT باستخدام ذات حساسية عالية انزيم المناعه (EIA) عدة. ملاحظة: إذا كنت تستخدم اللعابية تجارية عدة CORT EIA، اتبع توصيات الشركة المصنعة على النحو المحدد في إدراج عدة إلا أن عينات الاختبار ستكون مأخوذة مكررة من كل مستخلص الشعر المعاد بدلا من عينات اللعاب.
- إعداد لمراقبة الجودة (QC) استخراج الشعر للاستخدام في كل فحص.
- جمع عدد من عينات الشعر من خارج وإما معالجتها بشكل فردي كما هو الحال في الخطوات 4.1 و 4.2 أو تجمع لهم للتجهيز عينة كبيرة كما هو الحال في الخطوات 3.1 و 3.2.
- تتبخر المذيبات وإعادة تشكيل مقتطفات كما في الخطوات 5.1 و 5.2، ثم أعيد تجميع مقتطفات من عدة عينات فردية أو مجمعة.
- قسامة حجم مناسب للاستخراج المعاد المجمعة (على سبيل المثال 0.10 مل) في أنابيب microcentrifuge الفردية وتجميد لاستخدامها لاحقا.
- ذوبان الجليد وتشغيل قسامة QC احدة من نسختين على كل صفيحة ميكروسكوبية المناعية لتوفير refeRENCE قيمة CORT للتحقق من جودة كل شوط.
- ويمكن حساب عن طريق تحليل 10-12 QC الآبار في نفس المدى، في حين أن بين فحص السيرة الذاتية ويمكن حساب؛ معامل داخل فحص التباين (الذي يعرف بأنه الانحراف المعياري مقسوما على متوسط مجموعة من القيم عينة CV) باستخدام القيم QC عبر مجموعة من أشواط. إذا كان برنامج واحد قارئ صفيحة ميكروسكوبية بحساب السيرة الذاتية لآبار استخراج مكررة يمثل كل الشعر، ثم أسلوب بديل لتحديد داخل فحص السيرة الذاتية هو لحساب متوسط تلك القيم الذاتية الفردية عبر لوحة بأكمله.
- إن وجدت استخراج عينة تعطي قراءة أكبر من أعلى مستوى CORT في تقييم الأثر البيئي، ثم يتم تخفيف قسامة آخر من استخراج مع كمية مناسبة من العازلة الفحص ويتم تصحيح القراءة EIA اللاحقة لعامل التخفيف. كما أعادوا تحليل عينات روتينية إذا كانت السيرة الذاتية لآبار مكررة هو> 10٪.
- لأنها مصممة CORT EIA مجموعات لقياس CORT فازهري في عينات السائل مثل اللعاب أو البلازما، ويجب تحويل الناتج من برنامج قارئ صفيحة ميكروسكوبية لكمية CORT لكل وحدة وزن الشعر المجفف. الصيغة التالية تحويل الإخراج مقايسة في ميكروغرام / ديسيلتر إلى خريج CORT في الشعر ملغ:
(A / B) * (C / D) * E * F = 10،000
حيث A = ميكروغرام / ديسيلتر من الناتج الفحص؛ B = الوزن (في ملغ) من الشعر تعرض لاستخراج؛ C = المجلد. (في مل) من الميثانول تضاف إلى مسحوق الشعر؛ D = المجلد. (في مل) من الميثانول تعافى من استخراج والمجففة في وقت لاحق إلى أسفل؛ E = المجلد. (في مل) من العازلة الفحص المستخدمة لإعادة استخراج المجففة، وF = القيمة النهائية للشعر تركيز CORT في الغرام / ملغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 النسخة المطبوعة من مجموعة تمثيلية من عينات شعر الانسان (الذكور البالغين والموضوعات البشرية النسائية) معالجتها باستخدام أسلوب 2 طحن والاستخراج. تم استخدام برامج الكمبيوتر لتوليد إخراج البيانات وتناسب منحنى السيني 4 المعلمة لمعايير CORT (الشكل 2). تراوحت بين السير الذاتية جيدا من هذه اللوحة 0،01-5،73٪ بمتوسط CV داخل مقايسة من 1.34٪. تحديد السيرة الذاتية بين الفحص باستخدام القيم QC من تسعة فحوصات الأخيرة شعرة الإنسان كان 4.41٪. 37 العينات التي تم تحليلها في هذه اللوحة أسفرت عن مجموعة من الشعر القيم CORT 3،1 حتي 650 جزء من الغرام / ملغ (متوسط = 10.2 جزء من الغرام / ملغ؛ يعني ± SD = 36.0 ± 110 جزء من الغرام / ملغ).
يستخدم الأسلوب 1 في مختبرنا لمعالجة عينات الشعر من الرئيسيات غير البشرية والحيوانات الكبيرة الأخرى. A مقايسة ممثل الكبار شعر قرد هندي صغير (ومعظمهم من الإناث) أسفرت عن مجموعة من القيم CORT 50،1 حتي 102 جزء من الغرام / ملغ (متوسط = 75.0؛ يعني ± SD= 75.8 ± 14.0 جزء من الغرام / ملغ). كان متوسط CV داخل مقايسة لهذا الاختبار 2.08٪، وتحديد السيرة الذاتية بين الفحص باستخدام القيم QC من تسعة فحوصات الشعر قرد الأخيرة كان 4.63٪.
الشكل 1. إخراج البرنامج للممثل CORT شعرة الإنسان الفحص. الآبار مكررة هي كما يلي: S1-S6 - معايير CORT تتراوح بين 0.012 ميكروغرام / ديسيلتر (S6) إلى 3.0 ميكروغرام / ديسيلتر (S1)؛ S7 - 0 الآبار CORT؛ B1 - غير محددة ملزمة (جهاز الأمن القومي) الآبار التي تفتقر لمكافحة CORT الأجسام المضادة (البرنامج يطرح تلقائيا متوسط الكثافة البصرية جهاز الأمن القومي [OD] القيمة من جميع قراءات OD الأخرى)؛ C1 و C2 - معايرة العالية والمنخفضة CORT المقدمة من قبل الشركة المصنعة؛ T1 - مراقبة الجودة؛
T2-T38 - عينات الاختبار. من C1 إلى T38، والقيمة العليا في كل خلية من خلايا المصفوفة هو VALU OD قياس ه من المقابلة بشكل جيد، وانخفاض القيمة في الخلية اليسار يد الزوج هو القيمة CORT في ميكروغرام / ديسيلتر تحسب من قيمة OD يعني. ملاحظة أن عينات T9 T31 وأسفرت قراءات فوق أعلى مستوى CORT. ونتيجة لذلك، تم تخفيفه لاحقا كل من عينات 4 أضعاف في مقايسة مخفف وأعادوا تحليل. واستخدمت القيم أعادوا تحليل بعد التصحيح لعامل التخفيف. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. منحنى مستوى القيم OD مقابل تركيز سجل CORT لنفس الفحص شعرة الإنسان. قيمة الجذر التربيعي هو مبين في لوحة A هو الخير المحسوبة لنوبة من منحنى للمعايير./ 50882/50882fig2highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الإجراء CORT الشعر المذكورة أعلاه بسيطة لتنفيذ، غير مكلفة نسبيا، يجعل من استخدام المواد الكيميائية متاحة بيسر والكواشف، واللوازم، والمعدات التي تتطلب، مع استثناء واحد، ومن المرجح أن يكون حاضرا في مختبر تحليلي نموذجي. الاستثناء هو جهاز طحن مثل طاحونة الكرة أو مصغرة beadbeater. نلاحظ أن بعض المجموعات البحثية تخطر على عينات الشعر إلى أجزاء صغيرة ما يقرب من 1 ملم في الطول 12، ولكن على أساس ملاحظاتنا نوصي أداء طحن بدلا من تنميق إذا كان ذلك ممكنا. مجال آخر من الاختلاف المنهجي في الأدب ينطوي على وجود أو عدم غسل الشعر قبل CORT استخراج 13، وإذا كان الأمر كذلك، ما هي الشروط غسل للاستخدام. إذا لم يتم تنفيذ الغسيل، ثم واحدة مخاطر إمكانية أن استخراج الميثانول سيحتوي CORT ليس فقط أدرجت ببطء على مدى أسابيع أو أشهر من نمو الشعر ولكن أيضا العرق و / أو المستمدة من الزهم CORT أودعت مؤخرا علىسطح الشعر. دراسات على عينات الدب القطبي دعم وجود اثنين من كسور CORT في الشعر: جزء ملزمة فضفاضة قابلة للإزالة من قبل وجيزة الأيزوبروبانول غسل الشعر سليمة يفترض أن يمثل أساسا تلوث السطح، وجزء أكثر بإحكام والتي يمكن الوصول إليها عن طريق استخراج الميثانول واسعة من عينات الشعر المجفف 14. ويمكن استخلاص الاستنتاج نفسه من المبالغ المتناقصة من CORT المستخرجة من القرد والإنسان من خلال الشعر تكرار غسل الأيزوبروبانول (انظر المقدمة). من ناحية أخرى، إذا تم تنفيذ الغسيل، ثم اختيار المذيبات وغسل الظروف يمكن أن يكون لها تأثير كبير على القيم CORT الناتجة عن ذلك. وقد نشرت جمعية الشعر اختبار المبادئ التوجيهية لاختيار مذيب المناسبة لتقليل التورم والشعر المحتملة شطف المذاب من داخل المصفوفة الشعر أثناء عملية الغسيل 15. على الرغم من أن وضعت هذه التوصيات لتطبيقها على اختبار المخدرات في الشعر، فهي إعادةالمشرق العربي للتحليل الستيرويد كذلك.
قياس CORT في الشعر بدلا من البلازما أو اللعاب تقدم عددا من المزايا 2. الأهم من ذلك، يوفر هذا النهج العلامات البيولوجية CORT مستويات متكاملة على مدى فترات من أسابيع إلى شهور التي لا يخضع لنفوذ الوقت من اليوم عندما يتم جمع عينات أو عن طريق التعرض الإجهاد وجيزة قبل المجموعة. جمع الشعر هو موسع، على الرغم من أخذ عينات من بعض أنواع الحيوانات مثل القرود والدببة قد تتطلب تخدير للموضوع لأسباب تتعلق بالسلامة. ميزة أخرى هي أن CORT غير مستقر للغاية في الشعر مقارنة مع المصفوفات عينة أخرى، والذي يسمح تحليل عينات تاريخية أو أرشيفية حتى إذا كان قد تم تخزينها في درجة حرارة الغرفة لفترة طويلة من الزمن. أخيرا، وفي بعض الأحيان استخدمت مستويات CORT في قطاعات قطع شعرة الإنسان على مسافات أكبر تباعا من فروة الرأس إلى إنشاء تقويم بأثر رجعي من النشاط HPA مع مرور الوقت. في مثل هذه الحالات هو خاصمهم لاي ليكون على بينة من التي سبق ذكرها "تبييض" تأثير تنتجها تكرار غسل الشعر. على الرغم من أن بعض الدراسات قد فشلت في تكرار هذا التأثير 8،9، تجدر الإشارة إلى أنه في تلك الدراسات والعينات لا غسلها قبل استخراج الميثانول. هذا الاختلاف المنهجي هامة قد تساعد في تفسير سبب مستويات CORT الشعر لم تتراجع مع المسافة من فروة الرأس.
تجدر الإشارة أيضا إلى بعض القصور في النهج CORT الشعر. أولا، فإن هذا النهج لا يمكن الكشف عن التغييرات في النظمية الإيقاعية النشاط HPA (كما رأينا في بعض مرضى الاكتئاب) أو الاستجابة الصحوة CORT. مستويات الشعر CORT أيضا قد لا يكشف تأثير الضغوطات وجيزة نسبيا التي وقعت خلال الفترة من هرمون التأسيس. وبالتالي، ينبغي اعتبار هذا النهج من مكملة لقياسات اللعابية و / أو CORT البلازما، وليس كبديل لمثل هذه القياسات. الثانية، في حين أن استخدام CORT الشعر سوفمن المرجح أن تكون ذات قيمة خاصة للباحثين المهتمين في الضغوطات النفسية والاجتماعية والبيئية، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن ارتقى يمكن أن يحدث النشاط HPA في ظل مجموعة متنوعة من الظروف، بما في ذلك ممارسة الرياضة البدنية، حالات الشذوذ الأيضي، والأمراض المعدية. الثالث، في حين وجود بيانات من كل من البشر والقرود دعم الفرضية القائلة بأن CORT الشعر مشتق أساسا من مجرى الدم 2، لم يتم حتى الآن أثبتت هذه الفرضية. في الواقع، أظهرت إيتو وزملاء العمل 16 وجود نظام HPA مثل ظيفية في microdissected بصيلات الشعر البشري يحتفظ في الثقافة الجهاز. يبقى الدرجة التي تسهم بصيلات الشعر إلى CORT قياسها في جذع الشعرة غير معروف في هذا الوقت.
في غضون بضع سنوات منذ إنشائها والعلامات البيولوجية الجديدة من HPA محور النشاط، وقد استخدم الشعر CORT في طائفة واسعة من التطبيقات عبر أنواع عديدة. تقع العديد من هذه التطبيقات في غضون عدة ر الرئيسيةhemes تهدف إلى تحديد كيفية ارتباط النشاط HPA طويلة الأمد للإجهاد المزمن، واضطرابات الغدد الصماء مثل داء كوشينغ، أو الاضطرابات العصبية والنفسية مثل اضطراب ما بعد الصدمة 2،17-19. واستخدمت دراسات أخرى CORT الشعر لدراسة وظيفة HPA محور فيما يتعلق مزاجه السلوكية، التطور الطبيعي، وتأثير العوامل التنموية مثل تجارب الطفولة المبكرة في البشر أو الظروف مختلفة في تربية القرود والمحافظة على البيئة من الحيوانات الحية البرية، والتحقيق بأثر رجعي من عينات تاريخية أو أرشيفية. الأنواع التي شملتها الدراسة حتى الآن فيما يتعلق CORT الشعر وتشمل البشر، وعدة أنواع من الرئيسيات غير البشرية (قرود المكاك، والقرود الفرفت، وقردة البابون) والكلاب والقطط والأبقار والخيول، والعديد من أنواع الدببة. فمن المرجح أن استخدام CORT الشعر لتقييم النشاط HPA طويلة الأجل، سواء للتحقيق في الاستجابة الفسيولوجية للإجهاد المزمن أو لمعالجة مسائل تجريبية أخرى، وسوف تستمر لالسابقينوPAND ليتم تطبيقها على مجموعة أكبر من الأنواع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم تضارب المصالح لتعلن.
Acknowledgments
نشكر Kymberlee أوبراين، سيليا مور، وإدوارد Tronick (قسم علم النفس، جامعة ماساشوستس، بوسطن) لتوفير عينات شعر الإنسان تحليلها في هذه الدراسة، وستيفن سومي وأماندا Dettmer (مختبر المقارن علم السلوك، معاهد الصحة القومية) ل توفير عينات الشعر قرد هندي صغير. واستمر استخدام هذه الطريقة وقد تم دعم التطوير الأولي من قبل المعاهد الوطنية للصحة RR11122 لMAN
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15 ml Polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0 ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2 mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10 ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12 mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Rotator for 15 ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipettor | |||
| Analytical balance |
References
- Selye, H. Stress and the general adaptation syndrome. Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model. Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).
- Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).
- Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. Hair as a retrospective calendar of cortisol production - Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).
- Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations. Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).
- Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. Evaluation of a method to measure long term cortisol levels. Steroids. 76, 1032-1036 (2011).
- Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).
- LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair. Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).
- Dolnick, E. H. Variability of hair growth in Macaca mulatta. Adv. Biol. Skin. Montagna, W., Dobson, R. L. IX, Pergamon Press. 121-128 (1969).
- Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. an, H, S. Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).
- Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).
- Bechshøft, T. Ø, Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears. Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).
- Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).
- Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol. FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).
- Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).
- Stalder, T., Kirschbaum, C. Analysis of cortisol in hair - State of the art and future directions. Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).
- Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).
