Summary
هنا، نحن تصف منهجية لإجراء سيرنا المستهدفة "ubiquitome" الشاشة لتحديد اليوبيكويتين الرواية والمنظمين مثل اليوبيكويتين الاستجابة بوساطة HIF1A الخلوية لنقص الأكسجة. وهذا يمكن أن تتكيف مع أي مسار بيولوجي حيث قراءة قوية من النشاط الصحفي هو متاح.
Abstract
تعديل آخر متعدية من البروتينات مع اليوبيكويتين وتشبه جزيئات اليوبيكويتين (UBLs) والناشئة باعتبارها شبكة الإشارات الخلوية الحيوية التي تنظم مسارات بيولوجية متنوعة بما في ذلك الاستجابة نقص الأكسجة، proteostasis، استجابة الحمض النووي من التلف والنسخ. لفهم أفضل لكيفية UBLs تنظيم مسارات ذات الصلة إلى الأمراض التي تصيب البشر، قمنا بتجميع سيرنا الإنسان "ubiquitome" مكتبة تتكون من 1،186 سيرنا حمامات دوبلكس تستهدف جميع المعروفة ومكونات نظام مسارات أسامة بن لادن توقع. هذه المكتبة يمكن فحص ضد مجموعة من خطوط الخلايا معربا عن صحفيين من المسارات البيولوجية المتنوعة لتحديد المكونات التي تعمل أسامة بن لادن كما المنظمين إيجابية أو سلبية للمسار في السؤال. هنا، نحن تصف بروتوكول الاستفادة من هذه المكتبة لتحديد ubiquitome المنظمين للاستجابة بوساطة HIF1A الخلوية لنقص الأكسجين باستخدام مراسل luciferase القائم على النسخ. مرحلة التطوير الأولي مقايسةيتم تنفيذها لوضع معايير الفرز مناسبة من خط الخلية قبل تنفيذ الشاشة في ثلاث مراحل: الابتدائي والثانوي والجامعي الفحص / deconvolution. استخدام استهدفت أكثر من مكتبات الجينوم سيرنا كله تزداد شعبية لأنها تتيح ميزة الإبلاغ فقط على أعضاء المسار الذي المحققين هي الأكثر اهتماما. على الرغم من القيود المتأصلة في سيرنا الفرز، على وجه الخصوص، ايجابيات كاذبة الناجمة عن سيرنا خارج الهدف آثار، وتحديد المنظمين رواية حقيقية من المسارات في مسألة تفوق أوجه القصور هذه، والتي يمكن التغلب عليها عن طريق إجراء سلسلة من التجارب التي تضطلع التحكم بعناية.
Introduction
تعديل البروتينات مع اليوبيكويتين وتشبه جزيئات اليوبيكويتين (UBLs) يمثل نظام البيوكيميائية توسعية الذي ينظم مسارات بيولوجية متنوعة واستجابات التوتر. المرفق التساهمية من UBLs إلى البروتينات المستهدفة يمكن أن يكون لها نتائج مختلفة تنظم الاستقرار والتوطين، وظيفة أو interactome الركيزة 1. أنشئت الخطوات الأنزيمية الكامنة التعديل الأول لأسامة بن لادن اليوبيكويتين، ويخدم الآن كنموذج للتعديل مع معظم UBLs، بما في ذلك السومو، NEDD8، ISG15 وFAT10. لتعديل لتحدث، ويتم تنشيط مجموعة الكربوكسيل من diglycine عزر أسامة بن لادن أول من انزيم تفعيل E1 لتشكيل ثيول عالية الطاقة التي يتم نقلها إلى السيستين موقع نشط من انزيم التصريف E2. ثم يتفاعل مع E2-E3 يغاز الركيزة ملزمة للتوسط نقل أسامة بن لادن على (عادة) بقايا يسين الهدف خلق سلسلة متفرعة (isopeptide) الربط 2. يمكن أن يحدث جولات متعاقبة من التعديل لبناء سلاسل isopeptide على الركيزة، والتي لاليوبيكويتين يمكن أن يحدث من خلال أي من سبعة lysines لها، أو من خلال-N محطة ميثيونين لخلق سلاسل اليوبيكويتين الخطية. هذه التعديلات تشكل طبولوجيا منفصلة مع أغراض متنوعة مثل إنشاء الزخارف التفاعل جديدة واستهداف البروتينات للتدهور قبل إزالة أسامة بن لادن بواسطة البروتياز المتخصصة. في حالة اليوبيكويتين هناك اثنين من الانزيمات E1، E2 30-40 الانزيمات التصريف، 600 E3 على الأقل ونحو 100 ligases الانزيمات deubiquitylating (يصف). في حين أن مسارات هي أقل توسعية لأخرى 10 أو نحو ذلك UBLs، وتعقد ubiquitome الشاملة يتيح التنوع الهائل في النتيجة البيولوجية للتعديل خاصة أسامة بن لادن. ومع ذلك، في حين تم إحراز تقدم كبير في علم الأحياء أسامة بن لادن، لا تزال الأدوار الخلوية الدقيقة للأغلبية هذه المكونات ubiquitome غير معروف.
استخدام الباحث قصيرةوقد برزت erfering حمض النووي الريبي (الرناوات siRNAs) كأداة قوية في مجال علم الوراثة العكسية ويرجع ذلك إلى قدرة الرناوات siRNAs خصيصا لاستهداف mRNAs والخلوية للتدمير، والسماح للدور الجينات الفردية لفحصها في سياقات البيولوجية المختلفة 3. وقد استخدمت شاشات الجينوم لتحديد والتحقق من صحة المنظمين جديدة من العديد من العمليات الخلوية، وخلقت ثروة من البيانات المفيدة في متناول المجتمع العلمي على نطاق أوسع. ومع ذلك، في حين أثبتت شاشات الجينوم مفيدة للغاية، وشاشات استهدفت تزداد شعبية لأنها أرخص وأسرع وأقل تنطوي على إدارة البيانات والتقرير فقط على أعضاء الجينوم التي المحقق هو الأكثر اهتماما. لذلك، من أجل فهم أفضل التي تشارك العمليات الخلوية أسامة بن لادن مكونات الأسرة في، قمنا بتجميع مكتبة سيرنا الإنسان تستهدف جميع المعروفة ومكونات ubiquitome توقع. ويشمل هذا UBLs، E1 الانزيمات تفعيل، E2 التصريفالإنزيمات، ligases E3، مجال ملزم اليوبيكويتين (UBD) التي تحتوي على البروتينات ويصف. هذه المكتبة يمكن استخدامها لشاشة ضد طائفة واسعة من خطوط الخلايا مراسل من المشاكل البيولوجية متميزة، مما يتيح تحديد موضوعية حول مكونات أسامة بن لادن الرواية التي تحكم هذه الممرات.
يصف بروتوكول التالية كيفية إجراء صارم سيرنا المستهدفة ubiquitome الشاشة لتحديد المنظمين رواية من الاستجابة تعتمد على HIF1A لنقص الأكسجة. تحت التوتر الأكسجين العادي، HIF1A يخضع لprolyl الهيدروكسيل أن يؤدي إلى الاعتراف بها والمستهدفة للتدهور من قبل فون هيبل لينداو (VHL) E3 يغاز معقدة 4. نقص الأكسجة يمنع الهيدروكسيل prolyl مما يؤدي إلى استقرار HIF1A واللاحقة ملزمة لعناصر استجابة نقص الأكسجة (HRES) لدفع التعبير الجيني. هنا، نحن تصف الشاشة باستخدام خلايا عظمية U20S معربا عن ستابلي يراعة luciferase تحت سيطرة ثلاث نسخ جنبا إلى جنب من هايpoxia استجابة عنصر (الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان) 5. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لأي مسار بيولوجي إذا قوي للقراءة من النشاط الصحفي هو تحقيق ويمكن أن يقترن مع الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الفحص تنمية المرحلة
ملاحظة: قبل الشروع في الشاشة سيرنا، وهي مرحلة التطوير مقايسة أمر بالغ الأهمية أن تحدد المعالم الهامة لفحص مع خط الخلية المراسل. فمن الضروري أن تستثمر جهدا كبيرا في هذه المرحلة لأن هذا سيدعم النجاح في المستقبل من الشاشة.
- لتوصيف نقص الأكسجة، استجابة U20S-تعليم حقوق الإنسان مراسل خط الخلية، وتنمو 2 × 75 سم 2 قوارير من الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان إلى 80-90٪ التقاء في Dulbeccos التعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع FBS 10٪.
- نضح وسائل الإعلام من قارورة واحدة من الخلايا، ويغسل مرتين مع 10 مل PBS و فصل الخلايا عن طريق إضافة 2 مل 0.05٪ التربسين EDTA-الحل واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. خلايا resuspend في 8 مل DMEM 10٪ FBS وماصة صعودا وهبوطا لإنشاء تعليق خلية متجانسة.
- ماصة 20 ميكرولتر من تعليق إلى غرفة الفرز الخلية، في نسختين، وأدخل غرفة إلى فصول التوجيه الجامعي خلية الآليnter. انقر على زر "عرض صورة" على برنامج مكافحة الخلايا وضمان الخلايا هي في التركيز. انقر على زر "الكونت" وتقديم مذكرة من كثافة الخلية. كرر هذا للالمكررة الأخرى وحساب متوسط كثافة الخلية. تمييع الخلايا مع DMEM 10٪ FBS إلى تركيز من 60،000 خلية / مل.
- باستخدام ماصة الأقنية، إضافة 100 ميكرولتر (6،000 خلايا) من الخلايا المخفف لنفس ثلاثة أعمدة (على سبيل المثال A5-H5، H6 وA6-A7-H7) من 5 العقيمة 96 جيدا لوحات مقايسة أبيض الجدران، ونقل ل ترطيب الحاضنة 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 بين عشية وضحاها. ملاحظة: سيتم استخدام هذه اللوحات لتحديد الناتج luciferase المراسل تعتمد على نقص الأكسجين لمجموعة من التعرض نقص الأكسجة: 0 ساعة، 2 ساعة، 6 ساعة، 10 ساعة و 24 ساعة.
- في نهاية اليوم التالي، لاحظ الوقت وإضافة لوحة نقص الأكسجة 24 ساعة إلى مجموعة محطة نقص الأكسجة إلى 1٪ من الأكسجين. في صباح اليوم التالي، وحساب الوقت ساعة 10، 6 ساعة و 2 ساعة قبل هو لوحة ساعة 24 المقرر إزالتها الابام محطة العمل نقص الأكسجة. في هذه الأوقات، إضافة ساعة 10، 6 ساعة و 2 لوحات ساعة إلى محطة العمل نقص الأكسجة.
- إعداد 30 مل من 2X العازلة مجتمعة luciferase المراسل تحلل / فحص (50 ملي تريس درجة الحموضة 7.8 الفوسفات و 16 ملي MgCl 2، 2 ملي DTT، 2٪ تريتون-X-100؛ 30٪ الجلسرين؛ 1 ملي ATP؛ 1٪ BSA؛ 0.25 ملي وسيفيرين و 8 ميكرومتر نا 4 ف 2 O 7). ملاحظة: إضافة المكونات بالترتيب المدرجة والسماح للجيش صرب البوسنة لا يقل عن 30 دقيقة لتذوب قبل إضافة وسيفيرين ونا 4 ف 2 O 7.
- إزالة جميع لوحات من محطة العمل نقص الأكسجة في الوقت المناسب. إضافة 100 ميكرولتر من 2X العازلة تحلل luciferase المراسل / الفحص إلى الآبار المناسبة من لوحة الفحص، وتغطي مع الفيلم واضحة. يهز لوحات على طبق من ذهب شاكر لمدة 10 دقيقة في 500 دورة في الدقيقة لليز بدقة الخلايا.
- نقل لوحة لكومة الآلي 96 لوحة جيدا رف luminometer. ضمن القائمة "البروتوكولات"، حدد "القيمة المطلقة 595" وتسليط الضوء على جميع أهلا وسهلاليرة سورية يمكن ان تقرأ في لوحة الخريطة على الشاشة ضمن القائمة "اختيار جيد". انقر على زر "تشغيل" لقياس التلألؤ من كل بئر ثم حساب متوسط القراءة لكل لوحة. حساب تعتمد على نقص الأكسجة أضعاف زيادة النشاط مراسل بقسمة متوسط قراءة كل لوحة نقص الأكسجة على المتوسط القراءة من normoxia (0 ساعة نقص الأكسجة) لوحة التحكم. ملاحظة: من الضروري مراقبة قوية تعتمد على نقص الأكسجة استجابة luciferase المراسل لتكون مناسبة لفرزها. ويعتبر زيادة أضعاف 5-10 في النشاط مراسل ممتازة.
- إنشاء لوحة التحكم الرئيسية التي تحتوي على أربعة السيطرة على ارتفاع (HIF1A سيرنا) مكررات (الآبار A1-D1)، وأربعة السيطرة منخفضة (FIH1 سيرنا) يعيد (الآبار A12-D12)، وأربعة العازلة السيطرة إلا مكررات (الآبار E1-H1) وأربعة مكررات تحكم سيرنا غير المستهدفة (E12-H12)، حيث كل حمامات سيرنا هي بتركيز 200 نانومتر. ملاحظة: يتم وضع ضوابط عالية ومنخفضة على أساس المنظمين مسار المعروفة التي تزيد من وdecrتخفيف استجابة نقص الأكسجة على التوالي. بدلا من ذلك، وضع مقايسة باستخدام مجموعة فرعية من مكتبة يمكن أن تستخدم لتحديد ضوابط مناسبة.
- باستخدام ماصة الأقنية، ونقل 10 ميكرولتر من كل سيرنا التحكم إلى معقمة بيضاء الجدران لوحة الفحص. تحضير مزيج ترنسفكأيشن من 0.1 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن في 10 ميكرولتر المتوسطة انخفاض المصل (1:100) لكل بئر، ونقل 10 ميكرولتر من مزيج ترنسفكأيشن إلى كل عنصر تحكم جيدا. ماصة صعودا وهبوطا لفترة وجيزة لخلط، وترك لوحة للراحة لمدة 20-60 دقيقة للسماح ترنسفكأيشن تشكيل المعقدة.
- إعداد تعليق خلية من 75،000 خلية / مل مع القارورة الثانية من الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان. باستخدام ماصة الأقنية، إضافة 80 ميكرولتر (6،000 خلايا) من تعليق خلية إلى كل مزيج ترنسفكأيشن. نقل لوحة لترطيب الحاضنة 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة، ثم نقل إلى محطة عمل نقص الأكسجة عن 24 ساعة أخرى، وإجراء فحوصات luciferase المراسل كما هو موضح في الخطوات 1.61.8.
- حساب عامل Z لعناصر العالية والمنخفضة باستخدام الصيغة Z = 1 - [3 × (الانحراف المعياري للتحكم عالية + الانحراف المعياري للسيطرة منخفض) / (يعني السيطرة عالية - متوسط تحكم منخفضة)]. ملاحظة: قيمة تتراوح بين 0.5-1 يدل على وجود مقايسة ممتازة ويجب أن تسعى ل.
2. الشاشة الابتدائية
ملاحظة: مرة واحدة هذه الشروط الأساسية من مرحلة التطوير الاختبار هي في مكان، والشاشة الرئيسية لا يمكن أن يؤديها في ثلاث نسخ في 96 لوحة جيدا تنسيق باستخدام بروتوكول التالية.
- تنمو 7 × 75 سم 2 قوارير من الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان إلى 80-90٪ التقاء في DMEM تستكمل مع 10٪ ت / ت مصل بقري جنيني (FCS).
ملاحظة: الخطوات التالية 2،2-2،13 ينبغي الاضطلاع بها في يوم 1. - بدء تكرار 1 من خلال إعداد لوحة التحكم الرئيسية التي تحتوي على 200 ميكرولتر من كل عنصر تحكم كما هو موضح في الخطوة 1.9 والذوبان بسلسلة التخفيف من سيرنا ubiquitome لibrary مدة لا تقل عن 30 دقيقة. ملاحظة: كل يحتوي أيضا مجموعة من 4 الرناوات siRNAs تجميعها في لوحات 17 × 96 جيدا مع الأعمدة 1 و 12 تركت فارغة لعناصر.
- في غطاء تدفق الصفحي، والتسمية (أو الكود الشريطي) 17 بيضاء معقمة لوحات مقايسة مع أغطية الجدران من أرقام 1-17، المقابلة لكل لوحة من سلسلة مكتبة سيرنا.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة التحكم الرئيسية وسيرنا ubiquitome لفترة وجيزة مكتبة (1 دقيقة في 2،000 x ج) لضمان أن جميع الرناوات siRNAs تتراكم في الجزء السفلي من البئر.
- استخدام السائل موزع آلي آليا "ختم" 10 ميكرولتر من كل من لوحة التحكم التحكم الرئيسية على لوحات مقايسة 17، وذلك باستخدام نفس 96 جيدا غيض المكدس للحصول على كل لوحة.
- باستخدام 96 جيدا كومة غيض جديدة لكل من لوحات المكتبة 17، ونقل 10 ميكرولتر من كل ubiquitome سيرنا لوحة فحص المقابلة لها باستخدام موزع السائل الآلي.
- تحضير 40 مل ترنسفكأيشن كاشف لوحات مقايسة 17 باستخدام فاق نسبةtablished في 1.10. ملاحظة: هذا يتضمن 20 مل إضافية لحساب "حجم القتلى" في موزع الخلية. و"حجم القتلى" يشير إلى حجم السائل الحاضر باستمرار ضمن شبكة أنابيب موزع في الخلية.
- استخدام موزع خلية الآلي لنقل 10 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن إلى كل بئر في لوحات مقايسة 17. لفترة وجيزة يهز لوحات مقايسة على شاكر (1 دقيقة في 500 دورة في الدقيقة) للسماح خلط دقيق من سيرنا وترنسفكأيشن الكاشف، ثم ترك تزال في درجة حرارة الغرفة ل20-60 دقيقة للسماح سيرنا: كاشف ترنسفكأيشن تشكيل المعقدة.
- غسل اثنين 75 سم 2 قوارير من الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان مرتين مع 10 مل PBS وفصل مع 2 مل التربسين EDTA-عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 8 مل DMEM FBS 10٪ على كل قارورة وماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لإنشاء تعليق خلية متجانسة. الجمع بين الخلايا من كلا قوارير ونقل إلى العقيمة 50 مل أنبوب بلاستيكي.
- حساب تركيز الخلية بواسطة pipetting20 خلايا ميكرولتر من نسختين إلى غرفة الفرز الخلية وحساب متوسط تركيز الخلية من قراءتين للعداد الخلايا الآلي كما هو موضح في الخطوة 1.3.
- إعداد 155 مل من تعليق خلية عن طريق تمييع مع DMEM 10٪ FBS إلى تركيز من 75،000 خلية لكل مل في حاوية بلاستيكية معقمة. ملاحظة: هذا الحجم يكفي لمدة 17 لوحات ويتضمن 25 مل إضافية لحجم القتلى في موزع الخلية.
- إضافة محرك مغناطيسي معقمة لتعليق الخلية ومكان على النمام اقامة داخل غطاء تدفق الصفحي للحد من التثاقل الخلية. تتوازن موزع خلية الآلي مع تعليق الخلية ووضعه على الاستغناء 80 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر (6،000 خلايا).
- وضع كل من 17 لوحات، بدوره، على موزع خلية الآلي والاستغناء الخلايا. تسجل الوقت وألواح مكدس في مجموعات من 5 ثم ضع مداخن في الرطبة الحاضنة 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة. ملاحظة: للتركيز النهائي منوسوف تجمع سيرنا يكون 20 نانومتر في 100 ميكرولتر اجمالى حجم.
ملاحظة: الخطوات التالية 2،14-2،15 ينبغي الاضطلاع بها في يوم 2. - بدء تكرار الثانية يوم 2 بعد الإجراء المبين في يوم 1 لتكرار 1 (2،2 حتي 2،13).
- بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن، ونقل لوحات من تكرار 1 في بيئة معقمة إلى محطة عمل نقص الأكسجة وضعت في 1٪ من الأكسجين ويترك لمدة 24 ساعة للحث على مراسل تعليم حقوق الإنسان.
ملاحظة: الخطوات التالية 2،16-2،20 ينبغي الاضطلاع بها في اليوم 3. - بدء تكرار الثالث، في أعقاب الإجراء المبين في يوم 1 لتكرار 1 (2،2 حتي 2،13).
- بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن، ونقل لوحات من تكرار 2 في بيئة معقمة إلى محطة عمل نقص الأكسجة وضعت في 1٪ من الأكسجين ويترك لمدة 24 ساعة للحث على مراسل تعليم حقوق الإنسان.
- قبل ساعتين من تكرار 1 لوحات هي المراد إزالتها من محطة العمل نقص الأكسجة، وإعداد 200 مل من العازلة 2X luciferase المراسل تحلل / الفحص كما هو موضح في 1.6. ملاحظة: هذا الحجم فيcludes على 20 مل إضافية لضمان بقاء الخزان العازلة مغطاة جيدا.
- إزالة تكرار 1 لوحات مقايسة من محطة العمل نقص الأكسجة بعد التعرض 24 ساعة نقص الأكسجة وباستخدام موزع السائل الآلي، وإضافة 100 ميكرولتر من العازلة 2X luciferase المراسل تحلل / الفحص لفحص كل لوحة، وتغطي مع الفيلم واضحة.
- يهز لوحات على شاكر خلية لمدة 10 دقيقة في 500 دورة في الدقيقة لليز بدقة الخلايا. نقل كل لوحة بدوره إلى قارئ لوحة luminometer وسجل التلألؤ كما هو موضح في الخطوة 1.8.
ملاحظة: الخطوات التالية 2،21-2،22 ينبغي الاضطلاع بها في يوم 4. - بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن، ونقل لوحات من تكرار 3 في بيئة معقمة إلى محطة عمل نقص الأكسجة وضعت في 1٪ من الأكسجين ويترك لمدة 24 ساعة للحث على مراسل تعليم حقوق الإنسان.
- تكرار قراءة لوحات 2 بواسطة الخطوات التالية 2،18-2،20 تستخدم لتكرار 1.
ملاحظة: يجب أن تتم الخطوة التالية 2.23 من يوم 5. - قراءة تكرار 3 لوحات باتباعالخطوة 2،18-2،20 تستخدم لتكرار 1.
- تجميع جميع مكررات 3 من الشاشة الرئيسية، وحساب معامل Z لكل لوحة باستخدام الصيغة الواردة في 1.12. ملاحظة: إن وجدت لوحة لديه عامل Z أقل من 0.5، والنظر في تكرار هذه اللوحة لتحسين نوعية البيانات.
- حساب معامل التباين (CV) للارتفاع والضوابط المنخفضة باستخدام الصيغة التالية: 100 × الانحراف المعياري السيطرة / متوسط نطاق السيطرة. ملاحظة: يجب أن تكون السيرة الذاتية عند أدنى مستوى ممكن، فمن المعقول أن نتوقع الاختلاف 10-15٪. إذا الاختلاف هو أعلى بكثير، والنظر في تكرار لوحة.
- تفعيل حساب في المئة من كل سيرنا في لوحة باستخدام الصيغة التالية: [(يعني من السيطرة على ارتفاع - درجة سيرنا) / (يعني السيطرة عالية - متوسط تحكم منخفضة)] × 100 بالإضافة إلى ذلك، وحساب غير المستهدفة (NT. ) أضعاف من كل سيرنا باستخدام الصيغة [نموذج البيانات / متوسط NT]. لكلا التنشيط في المئة وNT أضعاف، وحساب متوسط مماثلة من ثلاثةآتش وتجميع القيم.
- باستخدام البيانات الخام، وحساب سبيرمان في الترتيب معامل ارتباط (SRCC) لتحديد كيفية ربط وثيق لوحات ثلاثة تكرار باستخدام الصيغة:
حيث r = SRCC؛ د = الفرق بين العددين في كل زوج من صفوف وn = عدد أزواج من البيانات. ملاحظة: سوف ارتباط جيد بين مكررات لوحة تعطي القيم مقربة إلى 1 إذا تبين تكرار واحد SRCC منخفضة مقابل 2 لوحات أخرى، مواصلة التحقيق والنظر في تكرار أن لوحة. - تقرر أي الرناوات siRNAs تهم كافية لفحص الثانوية (تصل إلى 80). توظيف خفض العرضية المعرفة من قبل المستخدم (على سبيل المثال اختيار جميع الرناوات siRNAs تظهر أقل من 5٪ أو أكثر من 95٪ تفعيل المئة، أي أقل من 0.5 NT أضعاف أو أكثر من 1.5 أضعاف NT) أو تطبيق المعلوماتية الحيوية أو المنطق القائم على المعرفة للبحث عن مجموعات من يضرب تقع ضمن نفس المسار أسامة بن لادن. ملاحظة:عادة، وهو مزيج من هذين النهجين يحدد التي تؤخذ سيرنا في فحص الثانوية.
3. الشاشة الثانوية
ملاحظة: يتم شاشة ثانوية توكيدية استند إلى الحد الأقصى من 80 الرناوات siRNAs من الاهتمام من الشاشة الرئيسية. هذا العدد يمكن أن يتم ملائم للخروج مع كل تكرار مطلي على واحد 96 لوحة جيدا مع الضوابط الكاملة وفقا الشاشة الرئيسية (انظر 2.2). ومن المفيد جدا للتأكد من أن المنظمين المحددة في الشاشة الرئيسية انتزاع بتكاثر نفس النمط الظاهري، وهذا سيساعد في صقل قرارات الفرز ينبغي أن يتم من خلال لنهائي الشاشة العالي / deconvolution الذي يضرب.
- تنمو 1 × 75 سم 2 قارورة من الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان إلى 80-90٪ التقاء في DMEM مع FBS 10٪.
- ملاحظة رقم لوحة وموقع الفعالية الشاشة الرئيسية، وتخطيط موقعها الجديد على شاشة الكرز الثانوية اختار لوحة رئيسية، وترك الأعمدة 1 لد 12 حرة لعناصر. إعداد لوحة التحكم الرئيسية كما هو الحال في 1.9 ولكن مع إجمالي حجم كل عنصر من 50 ميكرولتر.
- ذوبان الجليد سلسلة التخفيف الثاني من المكتبة ubiquitome (وضعت جانبا لبرك سيرنا الفردية قطف الكرز) مدة لا تقل عن 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لوحات (1 دقيقة في 2،000 x ج) ثم إضافة 50 ميكرولتر من الرناوات siRNAs الشاشة الثانوية إلى مواقع جديدة على لوحة الكرز التقطت لوحة رئيسية.
- تنفيذ الشاشة الثانوية باستخدام نفس البروتوكول الأساسية المبينة للشاشة الأساسي مع التعديلات التالية: (أ) تشغيل كافة مكررات ثلاثة في اليوم نفسه في أحد وحة فحص في تكرار و (ب) ضبط كميات من الكواشف وفقا لذلك.
4. العالي / Deconvolution الشاشة
ملاحظة: يتم تنفيذ الفحص العالي أو deconvolution على الحد الأقصى من 20 الرناوات siRNAs من الشاشة الثانوية. هذه الخطوة هو دراسة تأثير استخدام كل ضربة قاضية سيرنا الفردية من براز الأصليلتر من أربعة. عادة، يجب أن لا يقل عن اثنين الدوبلكس سيرنا الفردية من كل تجمع غير المشروعة نفس النمط الظاهري أن يكون على درجة معقولة من الثقة أن النمط الظاهري لوحظ ليس بسبب سيرنا خارج الهدف الآثار. لزيادة الثقة في هذه المرحلة، الدوبلكس سيرنا الفردية إضافية استهداف الجينات في السؤال ويمكن تصميم واختبار لقدرتها على انتزاع النمط الظاهري معينة. ومن ثم يمكن استخدام النتائج من هذه التجارب لحساب النتيجة H، H = 0.6 حيث أو أكثر يعتبر (أي حيث لا يقل عن 3 من أصل 5 الرناوات siRNAs الفردية انتزاع النمط الظاهري) مقبول 6.
- تنمو واحدة 75 سم 2 قارورة من الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان إلى 80-90٪ التقاء في DMEM مع FBS 10٪.
- إنشاء خريطة لوحة للعرض على الشاشة التعليم العالي من خلال التخطيط موقع الأربعة الدوبلكس سيرنا الفردية لكل ضرب على لوحة رئيسية شاشة العالي، وترك الأعمدة 1 و 12 حرة لعناصر. إعداد لوحة التحكم الرئيسية كما هو الحال في 1.9 ولكن مع ما مجموعهحجم كل عنصر من 50 ميكرولتر.
- ذوبان الجليد لوحات deconvolution / سيرنا الفردية وإضافة 50 ميكرولتر من الرناوات siRNAs الفردية (200 نانومتر) في كل بئر من لوحة رئيسية الشاشة التعليم العالي وفقا لخريطة لوحة (4.2) للسماح لمدة ثلاثة مكررات × 10 ميكرولتر ومريحة 20 ميكرولتر الزائدة .
- تنفيذ الشاشة العالي باستخدام نفس البروتوكول الأساسية المبينة للشاشة الأساسي مع التعديلات التالية: (أ) تشغيل كافة مكررات ثلاثة في اليوم نفسه في أحد وحة فحص في تكرار و (ب) ضبط كميات من الكواشف وفقا لذلك
ملاحظة: من الناحية المثالية يجب أن يتم تعيين عتبة الدوبلكس سيرنا الفردية في نفس الصرامة وقف انتاج المواد الانشطارية بالنسبة للتجمع. ومع ذلك، فإنه قد يكون مقبولا للاسترخاء عتبة بنسبة 10-20٪ لالرناوات siRNAs الفردية، وخصوصا حيث يقع على الوجهين واحد على الأقل الأخرى داخل مجموعة عتبة. فمن المجدي تحمل في الاعتبار أن تأثير الفرد من الرناوات siRNAs قد يكون أقل منتجمع، وعلى العكس، في بعض الحالات الفردية الرناوات siRNAs قد تظهر تأثير أقوى على النمط الظاهري الخلوية في عزلة مما كانت عليه عندما كان موجودا في تجمع (حتى عندما يتم احتساب تركيز ل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قبل الفحص، يتم تأسيس نقص الأكسجة، استجابة الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان. الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان تعبر عن بناء مراسل تتكون من يراعة luciferase تنصهر المصب من ثلاث نسخ جنبا إلى جنب من العنصر استجابة نقص الأكسجة، والتي لا بد من مغاير HIF1A/HIF1B عند التعرض لنقص الأكسجة (الشكل 1A). وتوضع الخلايا في محطة عمل نقص الأكسجة لمجموعة من الأوقات إلى إنشاء التي تنتج من التعرض نقص الأكسجة الاستجابة الأكثر فعالية لفرزها. الخلايا U20S التعبير عن مستويات منخفضة من HIF2A، وبالتالي القراءات luciferase المراسل تعتمد إلى حد كبير على الاستقرار HIF1A بوساطة نقص الأكسجة 7. تعرض الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان لنقص الأكسجين ل0 ساعة، 2 ساعة، 4 ساعة، 6 ساعة و 24 ساعة في النتائج التي تعتمد على تحريض نقص الأكسجة من luciferase النشاط (الشكل 1B). تعرض الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان لنقص الأكسجين لمدة 24 ساعة في نتائج الاستقراء ~ 10 أضعاف النشاط (الشكل 1B)، وبالتالي يمثل هذان استجابة ممتازة لفحص سيرنا.
لوضع ضوابط مناسبة العالية والمنخفضة، وتستخدم لالرناوات siRNAs HIF1A وFIH1 لعكس بالنقل الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان. و transfected الخلايا مع الضوابط لمدة 24 ساعة ويتعرض لنقص الأكسجين عن 24 ساعة أخرى قبل يتم تنفيذ المقايسات luciferase المراسل. HIF1A سيرنا يقلل من نقص الأكسجة إشارة إلى حوالي 10٪ في حين أن FIH1 سيرنا يعزز إشارة إلى نقص الأكسجة حوالي 170٪ بالنسبة لغير المستهدفة سيرنا (الشكل 2). هذه الضوابط ينتج في المتوسط Z عامل من 0.8، والتي هي على درجة ممتازة للفحص. وقد أنشئت حتى الآن المعلمات الفحص بنجاح لشاشة قوية.
ويتم الشاشة الرئيسية في شكل لوحة 96 جيدا باستخدام سير العمل موضح في الشكل 3. يتم ختمها تحكم والرناوات siRNAs مكتبة على لوحات مقايسة (الشكل 3A)، وو transfected الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان العكسي ثم طncubated عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. ثم يتعرض لوحات مقايسة لنقص الأكسجين لمدة 24 ساعة (الشكل 3B) قبل أن يتم إجراء فحوصات luciferase المراسل وتحليل البيانات (الشكل 3C). يتضمن تحليل ومراقبة الجودة من الشاشة تحديد عامل Z لكل لوحة، حيث عامل Z 0.5 أعلاه هو مرغوب فيه 8 و 9. يتم احتساب عامل Z لكل لوحة من الشاشة الرئيسية باستخدام ثلاث نسخ الصيغة في الشكل 4A. وتصور العوامل Z لكل لوحة باستخدام مؤامرة مبعثر، حيث يمكن أن ينظر إليه كل لوحة لديه عامل Z أكبر من 0.5 (الشكل 4B). حساب معامل Z هو مهم، لأنها تقارير حول كيفية جيدة جود إطار الفصل بين الضوابط ويمكن تسليط الضوء على المشاكل المحتملة مع لوحات مقايسة الشاشة الفردية. وتحسب أيضا السيرة الذاتية للضوابط العالية والمنخفضة، والمتوسطات هي 5.95٪ + / - 0.4٪ و8.04 + / - 1.2 على التوالي. الشاشة الرئيسيةالنتائج في توزيع الدوبلكس سيرنا تشكيل سلسلة متصلة بين الضوابط المنخفضة والعالية. عادة، سوف يكون هناك عدد متساو تقريبا من المنظمين الإيجابية والسلبية، مع غالبية الرناوات siRNAs وجود أي تأثير على مراسل (الشكل 5). تؤخذ المنظمين من الفائدة من خلال لفحص الثانوي ثم العالي لوضع قائمة من المنظمين ثقة مرتفعة للتحليل المتابعة والتحقق من الصحة.
الشكل 1. يدفع التعرض نقص الأكسجة U20S-تعليم حقوق الإنسان مراسل luciferase. (A) تخطيطي يمثل بناء مراسل نقص الأكسجين في الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان تستخدم لسيرنا الفرز. ثلاث نسخ جنبا إلى جنب من العنصر استجابة نقص الأكسجة (تعليم حقوق الإنسان) لا بد من HIF1A/HIF1B مغاير لدفع هxpression من يراعة luciferase. (ب) زيادة التعرض للخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان إلى 2 ساعة، 6 ساعة، 10 ساعة و 24 ساعة إلى نتائج نقص الأكسجة في كميات متزايدة من luciferase النشاط المراسل. 24 ساعة نقص الأكسجة نتائج التعرض في ~ 10 أضعاف الزيادة في luciferase النشاط بالمقارنة مع السيطرة 0 ساعة (normoxia). أشرطة النطاق تمثل الخطأ المعياري للمتوسط.
الشكل 2. وضع ضوابط العالية والمنخفضة سيرنا لفرزها. الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان عكس transfected مع سيرنا إلى HIF1A (تحكم منخفضة) وFIH1 (مراقبة عالية) النقص وزيادة استجابة لنقص الأكسجة 24 ساعة من التعرض التوالي. هذه الضوابط إعطاء عامل Z من 0.8، والتي تعتبر على درجة ممتازة للفحص. يظهر تأثير غير المستهدفة (NT) سيرنا لالمقارنة. أشرطة الخطأ تمثل الأخطاء المعياري للمتوسط.
الرقم 3. سير العمل فحص لتحديد المنظمين للاستجابة HIF1A نقص الأكسجة. (A) ترتيب 96 لوحات جيدة لسيرنا الفرز. وختم الرناوات siRNAs السيطرة على الأعمدة خارج كما هو مبين ويتم ختم مكتبة سيرنا ubiquitome على أعمدة داخلية، موزعة على 17 لوحات. الخلايا U20S-تعليم حقوق الإنسان وعكس transfected وحضنت في normoxia لمدة 24 ساعة. يتم نقل (B) أكوام من لوحات مقايسة في بيئة معقمة إلى محطة عمل نقص الأكسجة وضعت في 1٪ من الأكسجين لمدة 24 ساعة. تتم إزالة (C) لوحات من محطة العمل ونقص الأكسجة luciferase النشاط يتم تنفيذ المقايسات على جميع لوحات الفحص. التلألؤ هوسجلت على luminometer وإجراء تحليل البيانات لتحديد النشاط مراسل الخلايا transfected مع كل مكتبة سيرنا.
يتم تنفيذ الشكل 4. مراقبة الجودة عن طريق حساب عامل Z من كل لوحة. (A) ويتم احتساب عامل Z لكل لوحة باستخدام صيغة معينة، حيث ق يمثل الانحراف المعياري، م يمثل نفسه، ص السيطرة الإيجابية ون سيطرة سلبية. (B) مؤامرة مبعثر عرض Z عامل يحسب من كل لوحة من ثلاثة مكررات من الشاشة ubiquitome. يتم تطبيق وقف انتاج المواد الانشطارية من 0.5، وفي هذه الحالة عرض جميع لوحات عاملا Z> 0.5، وبالتالي تمرير مراقبة الجودة.
الرقم 5. بيانيا يبين توزيع مكتبة سيرنا. الرسم البياني عرض وتيرة الرناوات siRNAs من ثلاث نسخ ubiquitome الشاشة سيرنا التي تؤدي إلى تنشيط المناظرة في المئة. يتم تعيين الضوابط المنخفضة والعالية إلى 0٪ و 100٪ على التوالي. يتم توزيع مكتبة سيرنا بالتساوي بين السيطرة العالية والمنخفضة، حيث الغالبية من الرناوات siRNAs ليس لها أي تأثير على النمط الظاهري الخلوية. ويلاحظ أن نسبة صغيرة من الرناوات siRNAs لزيادة وإنقاص ردا على ذلك، وبالتالي تمثل المنظمين رواية المحتملة للمسار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أثبت استخدام شاشات سيرنا على نطاق الجينوم في خلايا الثدييات أن تكون قيمة للغاية في تحديد المنظمين رواية من المسارات البيولوجية متميزة. هنا، ونحن قد وصفت استخدام شاشة ubiquitome سيرنا المستهدفة لتحديد المنظمين للاستجابة بوساطة HIF1A الخلوية لنقص الأكسجة. شاشات المستهدفة أصبحت جذابة على نحو متزايد لأنها عادة ما تكون أرخص وأسرع وأسهل للإدارة والتقرير فقط على مكونات المسار الذي المحققين مهتمون 7، 10، 11.
فمن الأهمية بمكان أن يضع جهدا كبيرا في مرحلة التطوير الفحص لضمان مراسل الخلية الأساسية هي مناسبة للفحص، ويمكن أن يتحقق ذلك استنساخ والتباين المنخفض. من المهم أيضا لتحديد الضوابط الإيجابية والسلبية قوية لإنشاء إطار الفصل خلاله المنظمين مكتبة ستسقط. بالإضافة إلى ذلك، هذه بمثابة الرقابة الداخلية في كل لوحة من مقايسةشاشة السماح لتحديد السريع لأي مشاكل مع لوحات فردية.
مشكلة واحدة مشتركة في ارتفاع الفرز الإنتاجية هو وقوع آثار لوحة حافة، والتي يمكن أن تنجم عن الفرق المحلية في الرطوبة في الآبار خارج لوحة المتعلقة الآبار الداخلية. يمكن وجود الضوابط المناسبة في المكان وخلق خريطة الحرارة من إخراج لوحة تساعد على تحديد هذه المشكلة. لقد وجدنا أن آثار الحافة يمكن التغلب عليها باستخدام المناديل الورقية الرطبة في قاعدة لوحات، ووضع قاسية، وكيس من البلاستيك الشفاف على كومة من لوحات لجعل المكروية من كل لوحة داخل الحاضنة أكثر من ذلك.
وجود قيود على سيرنا الفحص هو وجود ايجابيات وسلبيات كاذبة كاذبة. يمكن أن يحدث السلبيات كاذبة بسبب وجود عدد من العوامل بما في ذلك ضربة قاضية كافية من مرنا المقابلة، أو قدرة مرنا المتبقية لإنتاج ما يكفي من الفعلإيف البروتين على أداء وظيفتها بكفاءة. ايجابيات كاذبة هي أكثر إشكالية، لأنها يمكن أن تسبب محقق للاستثمار وقتا كبيرا متابعة ضربة التي قد لا يحكم فعليا المسار في السؤال. يمكن أن تتولد ايجابيات كاذبة من خلال عدد من الآليات بما في ذلك عن طريق سيرنا خارج الهدف الآثار. هذا هو المكان الذي يقرع أسفل سيرنا ليس فقط مرنا في السؤال ولكن الآخر أيضا، أهدافا مجهولة التي هي المنظمين المسار الحقيقي 12، 13. عدد من النهوج تستخدم عادة ويقبل منها التأكيد على أن النمط الظاهري هو نتيجة لوحظ الحقيقي لليطرق أسفل الجينات المستهدفة في السؤال 14. على سبيل المثال، يمكن التغلب على مشكلة آثار خارج الهدف في جزء من الفحص العالي، حيث يتم تقليل احتمال سيرنا أكثر من فرد من تجمع ابتداء من أربعة لها نفس تأثير خارج الهدف. بالإضافة إلى ذلك، بنجاح إجراء التجارب الإنقاذ مع المقاوم للسيرناسوف cDNAs المقابلة لضرب حكم أيضا إلى خارج الهدف الآثار. تجدر الإشارة إلى أن هذا النهج في حد ذاته لا يخلو من المحاذير، على سبيل المثال سوف البروتينات بإفراط (overexpressed) خارجيا لا تعمل بالضرورة مطابقة لنظيرتها المحلية بسبب العناصر المتفاعلة غيرت من المجمعات ذات الصلة أو مضطرب التعديلات بعد متعدية الخ وثمة نهج بديل لتصل إلى التحقق من صحة وبالتالي هو لتوليد أو الحصول على خروج المغلوب أو الضربة القاضية في خطوط الخلايا المقابلة لإصابات، وتحديد ما إذا كان عرض هذه خطوط الخلايا نفس النمط الظاهري مثل ضربة قاضية سيرنا. وبالتالي، قيود سيرنا الفحص يمكن التغلب عليها مع الحرص على المتابعة التجريبية. وعلاوة على ذلك، وتحديد موضوعية حول معدلات الحقيقية للمسارات تحت المجهر تفوق بكثير المشاكل المرتبطة يحتمل تحديد ايجابيات كاذبة.
باختصار، سيرنا الفحص مع "ubiquitome" مكتبة سيرنا المستهدفة هي powerfطريقة المجاهدين لتحديد أعضاء رواية اليوبيكويتين والمعدلات مثل اليوبيكويتين تنظيم مسارات بيولوجية متميزة. بروتوكول الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على أي مشكلة البيولوجية إذا كان هناك قراءة قوية من النشاط الصحفي. القائمة النهائية للثقة عالية يضرب من الشاشة تمثل نقطة البداية من حيث وضع أساس الآلية لكيفية ضرب كل من يحكم المسار في السؤال. في نهاية المطاف، وهذا سوف تضيف إلى المعرفة المتنامية لكيفية اليوبيكويتين ومثل اليوبيكويتين معدلات تنظيم مسارات بيولوجية متميزة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل ويلكوم ترست وجلاكسو سميث كلاين (GSK) والمعهد الاسكتلندي للتشوير الخليوي (وهي الآن جزء من الفسفرة البروتين MRC وحدة Ubiquitylation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
References
- Hochstrasser, M.
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).
- Siomi, H., Siomi, M. C. On the road to reading the RNA-interference code. Nature. 457, 396-404 (2009).
- Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 30, 393-402 (2008).
- Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH. Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).
- Bhinder, B., Djaballah, H. A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the "H Score" for hit nomination & gene prioritization. Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).
- Bett, J. S., et al. The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability. Biochem J. 451, 185-194 (2013).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Stagg, H. R., et al. The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER. J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).
- Zhang, Y., et al. RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling. Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).
- Jackson, A. L., et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Birmingham, A., et al. 3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods. 3, 199-204 (2006).
