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Biology

संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में जैविक रास्ते की Ubiquitin और ubiquitin की तरह सिस्टम नियामकों की पहचान siRNA स्क्रीनिंग

Published: May 24, 2014 doi: 10.3791/51572
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, College of Life Sciences, University of Dundee, 2Centre for Gene Regulation and Expression, College of Life Sciences, University of Dundee

Summary

यहाँ, हम हाइपोक्सिया के लिए HIF1A की मध्यस्थता सेलुलर प्रतिक्रिया के उपन्यास ubiquitin और ubiquitin की तरह नियामकों की पहचान करने के लिए एक लक्षित siRNA "ubiquitome" स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए एक पद्धति का वर्णन. इस संवाददाता गतिविधि के बाहर एक मजबूत पढ़ें उपलब्ध है, जहां किसी भी जैविक मार्ग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Abstract

Ubiquitin और ubiquitin की तरह अणुओं (UBLs) के साथ प्रोटीन की बाद translational संशोधन हाइपोक्सिया प्रतिक्रिया, Proteostasis, डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया और प्रतिलेखन सहित विविध जैविक रास्ते को नियंत्रित करता है कि एक गतिशील सेलुलर संकेत नेटवर्क के रूप में उभर रहा है. बेहतर UBLs मानव रोग के लिए प्रासंगिक रास्ते को विनियमित कैसे समझते हैं, हम एक मानव siRNA संकलित किया है "ubiquitome" सभी ज्ञात और UBL प्रणाली रास्ते के घटकों की भविष्यवाणी को लक्षित 1,186 siRNA द्वैध पूल से मिलकर पुस्तकालय. इस पुस्तकालय UBL घटकों प्रश्न में मार्ग की सकारात्मक या नकारात्मक नियामकों के रूप में कार्य है, जो निर्धारित करने के लिए विविध जैविक रास्ते के संवाददाताओं व्यक्त सेल लाइनों की एक श्रृंखला के खिलाफ जांच की जा सकती है. यहाँ, हम एक प्रतिलेखन आधारित luciferase संवाददाता का उपयोग हाइपोक्सिया के लिए HIF1A की मध्यस्थता सेलुलर प्रतिक्रिया की ubiquitome-नियामकों की पहचान करने के लिए इस पुस्तकालय का उपयोग एक प्रोटोकॉल का वर्णन. एक प्रारंभिक परख विकास मंचप्राथमिक, माध्यमिक और तृतीयक / deconvolution स्क्रीनिंग: तीन चरणों में स्क्रीन प्रदर्शन से पहले सेल लाइन का उपयुक्त स्क्रीनिंग मापदंडों को स्थापित करने के लिए किया जाता है. यह केवल जांचकर्ताओं सबसे रुचि रखते हैं, जिसके साथ मार्ग के सदस्यों पर रिपोर्टिंग का लाभ प्रदान करता है के रूप में पूरे जीनोम siRNA पुस्तकालयों पर लक्षित का उपयोग तेजी से लोकप्रिय होता जा रहा है. SiRNA स्क्रीनिंग के निहित सीमाओं के बावजूद, विशेष रूप से झूठी सकारात्मक siRNA बंद लक्ष्य प्रभाव की वजह से, प्रश्न में रास्ते के असली उपन्यास नियामकों की पहचान सावधानी से किए गए नियंत्रण प्रयोगों की एक श्रृंखला के प्रदर्शन से दूर किया जा सकता है, जो इन कमियों, पल्ला झुकना.

Introduction

Ubiquitin और ubiquitin की तरह अणुओं (UBLs) के साथ प्रोटीन का संशोधन विविध जैविक रास्ते और तनाव प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करता है कि एक विशाल जैव रासायनिक प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है. उनके लक्ष्य प्रोटीन के लिए UBLs के सहसंयोजक लगाव स्थिरता, स्थानीयकरण, समारोह या सब्सट्रेट 1 की interactome के विनियमन के विभिन्न परिणामों हो सकता है. UBL संशोधन अंतर्निहित एंजाइमी कदम पहले ubiquitin के लिए स्थापित किया गया है, और अब सूमो, NEDD8, ISG15 और FAT10 सहित ज्यादातर UBLs, साथ संशोधन के लिए एक प्रतिमान के रूप में काम कर रहे थे. संशोधन के लिए होते हैं, UBL diglycine मूल भाव के कार्बोक्सिलेट समूह पहले एक E2 conjugating एंजाइम सक्रिय साइट सिस्टीन को सौंप दिया है कि एक उच्च ऊर्जा thiol के लिए फार्म एक E1 को सक्रिय एंजाइम से सक्रिय है. E2 तो (आमतौर पर) एक branched श्रृंखला (isopeptide) बनाने के लिए एक लक्ष्य लाइसिन अवशेषों से उठाना 2 पर UBL के हस्तांतरण के लिए मध्यस्थता करने के लिए एक सब्सट्रेट बाध्य E3 ligase के साथ सूचना का आदान प्रदान. संशोधन के बाद के दौर रैखिक ubiquitin चेन बनाने के लिए ubiquitin के लिए अपने सात lysines के किसी भी माध्यम से हो सकता है, जो सब्सट्रेट, पर या अपनी एन टर्मिनल methionine के माध्यम से isopeptide चेन का निर्माण करने के लिए हो सकता है. इन संशोधनों के ऐसे पूर्व विशेषज्ञ proteases से UBL हटाने के लिए नई बातचीत रूपांकनों बनाने और गिरावट के लिए प्रोटीन का लक्ष्य के रूप में विविध उद्देश्यों के साथ असतत टोपोलॉजी के रूप में. Ubiquitin के मामले में दो E1 एंजाइमों, 30-40 E2 conjugating एंजाइमों, कम से कम 600 E3 ligases और लगभग 100 deubiquitylating एंजाइमों (बताती) कर रहे हैं. रास्ते अन्य 10 या तो UBLs के लिए कम प्रशस्त कर रहे हैं, समग्र ubiquitome जटिलता एक विशेष UBL संशोधन की जैविक परिणाम में विशाल विविधता देता है. UBL जीव विज्ञान में प्रमुख अग्रिमों किए गए हैं, जबकि हालांकि, इन ubiquitome घटकों के बहुमत के सटीक सेलुलर भूमिकाओं अनजान रहते हैं.

कम INT का उपयोगerfering ribonucleic एसिड (siRNAs) व्यक्तिगत जीन की भूमिका अलग अलग जैविक संदर्भों 3 में जांच करने की अनुमति के कारण विशेष रूप से विनाश के लिए सेलुलर mRNAs लक्षित करने के लिए siRNAs की क्षमता को रिवर्स आनुवंशिकी में एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है. पूरे जीनोम स्क्रीन कई सेलुलर प्रक्रियाओं के नए नियामकों की पहचान करने और मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और व्यापक वैज्ञानिक समुदाय के लिए सुलभ उपयोगी डेटा का खजाना बनाया है. पूरे जीनोम स्क्रीन अत्यंत उपयोगी सिद्ध कर दिया है हालांकि, जबकि लक्षित स्क्रीन वे सस्ते हैं के रूप में तेजी से लोकप्रिय होते जा रहे हैं, तेज, केवल अन्वेषक सबसे अधिक दिलचस्पी है जिसमें जीनोम के सदस्यों पर कम डेटा प्रबंधन और रिपोर्ट शामिल है. इसलिए, बेहतर सेलुलर प्रक्रियाओं UBL परिवार घटकों में शामिल हैं जो समझते हैं, हम सभी ज्ञात और ubiquitome के घटकों की भविष्यवाणी को लक्षित एक मानव siRNA पुस्तकालय संकलित किया है. इस UBLs, E1 को सक्रिय एंजाइमों, E2 conjugating शामिलएंजाइमों, E3 ligases, ubiquitin बाध्यकारी डोमेन (UBD) युक्त प्रोटीन और बताती है. इस पुस्तकालय इस प्रकार इन रास्ते गवर्निंग उपन्यास UBL घटकों की निष्पक्ष पहचान की अनुमति, विशिष्ट जैविक समस्याओं के संवाददाता सेल लाइनों की एक विस्तृत श्रृंखला के खिलाफ स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक कठोर लक्षित siRNA हाइपोक्सिया के लिए HIF1A निर्भर प्रतिक्रिया के उपन्यास नियामकों की पहचान ubiquitome स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए कैसे करें. सामान्य ऑक्सीजन तनाव के तहत, HIF1A यह वॉन Hippel Lindau (VHL) E3 ligase परिसर 4 से मान्यता प्राप्त है और गिरावट के लिए लक्षित होने का कारण बनता है कि prolyl hydroxylation के अधीन है. हाइपोक्सिया HIF1A के स्थिरीकरण के लिए अग्रणी prolyl hydroxylation को रोकता है और इसके बाद के हाइपोक्सिया प्रतिक्रिया तत्वों (hres) के लिए बाध्य जीन अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए. यहाँ, हम stably हरियाणा के तीन संगठनों ने मिलकर प्रतियों के नियंत्रण में जुगनू luciferase व्यक्त U20S osteosarcoma कोशिकाओं का उपयोग कर एक स्क्रीन का वर्णनpoxia रिस्पांस तत्व (U20S-HRE कोशिकाओं) 5. संवाददाता गतिविधि का एक मजबूत पढ़ने के लिए बाहर प्राप्त है और उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ मिलकर किया जा सकता है अगर यह प्रोटोकॉल किसी भी जैविक मार्ग के लिए अनुकूलित किया जा सकता.

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Protocol

1. परख विकास मंच

नोट: पूर्व siRNA स्क्रीन की शुरुआत करने के लिए, एक परख विकास मंच संवाददाता सेल लाइन के साथ स्क्रीनिंग के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों बाहर स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह इस स्क्रीन के भविष्य की सफलता होगा पिन के रूप में इस स्तर पर महत्वपूर्ण प्रयास निवेश करने के लिए आवश्यक है.

  1. U20S-HRE संवाददाता सेल लाइन की हाइपोक्सिया प्रतिक्रिया के लिए चिह्नित करने के लिए, 10% FBS के साथ पूरक ईगल मध्यम (DMEM) संशोधित Dulbeccos में 80-90% संगम को 2 एक्स 75 सेमी U20S-HRE कोशिकाओं के 2 बोतल बढ़ता है.
  2. महाप्राण कोशिकाओं की एक कुप्पी से मीडिया, 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ दो बार धोने और 2 मिलीलीटर 0.05% trypsin EDTA समाधान जोड़ने और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा कोशिकाओं को अलग. 8 मिलीलीटर DMEM एक समरूप सेल निलंबन बनाने के लिए ऊपर और नीचे 10% FBS और पिपेट में Resuspend कोशिकाओं.
  3. पिपेट 20 प्रतियों में एक सेल गिनती चैम्बर के निलंबन की μl, और एक स्वचालित सेल cou में कक्ष सम्मिलितnter. सेल काउंटर सॉफ्टवेयर पर "प्रदर्शन छवि" पर क्लिक करें और कोशिकाओं ध्यान में हैं सुनिश्चित करते हैं. "गणना" पर क्लिक करें और सेल घनत्व के एक नोट करें. अन्य डुप्लिकेट के लिए इस दोहराएँ और औसत सेल घनत्व की गणना. 60,000 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता के लिए DMEM 10% FBS के साथ कोशिकाओं पतला.
  4. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, एक ही तीन स्तंभों (जैसे A5-H5, ए 6-H6 और A7-H7) 5 बाँझ सफेद दीवारों 96 अच्छी तरह से परख प्लेटों की, और हस्तांतरण करने के लिए पतला कोशिकाओं के 100 μl (6,000 कोशिकाओं) जोड़ रातोंरात 5% सीओ 2 पर एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर. नोट: 0 घंटा, 2 घंटा, 6 घंटा, 10 घंटा और 24 घंटे: इन प्लेटों हाइपोक्सिया जोखिम की एक श्रृंखला के लिए हाइपोक्सिया निर्भर luciferase उत्पादन निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  5. अगले दिन के अंत में, समय ध्यान दें और 1% ऑक्सीजन को हाइपोक्सिया वर्कस्टेशन सेट करने के लिए 24 घंटे हाइपोक्सिया थाली जोड़ें. 24 घंटा प्लेट fr हटाया होने की वजह से पहले निम्नलिखित सुबह, समय 10 घंटा, 6 घंटा और 2 घंटे की गणनाहाइपोक्सिया वर्कस्टेशन ओम. इन समय में, हाइपोक्सिया कार्य केंद्र के लिए 10 घंटे, 6 घंटा और 2 घंटा प्लेटें जोड़ें.
  6. 16 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी डीटीटी, 2% ट्राइटन-X-100, 30% ग्लिसरॉल, 1 मिमी एटीपी, 1% BSA, 0.25 मिमी 2x संयुक्त luciferase सेल / परख बफर के 30 मिलीलीटर (50 मिमी Tris फास्फेट पीएच 7.8 की तैयारी luciferin और 8 माइक्रोन ना 4 पी 2 ओ 7). नोट: सूचीबद्ध क्रम में घटकों को जोड़ने और बीएसए कम से कम 30 मिनट luciferin और ना 4 पी ओ 2 7 के अलावा पहले भंग करने की अनुमति.
  7. उचित समय पर हाइपोक्सिया कार्य केंद्र से सभी प्लेटों निकालें. परख थाली का उचित वेल्स को 2x luciferase सेल / परख बफर के 100 μl जोड़ें और स्पष्ट फिल्म के साथ कवर किया. अच्छी तरह से कोशिकाओं lyse करने के लिए 500 rpm पर 10 मिनट के लिए एक थाली प्रकार के बरतन पर प्लेटें हिलाएँ.
  8. एक स्वचालित 96 अच्छी तरह से थाली luminometer रैक करने के लिए थाली पर ढेर स्थानांतरण. "प्रोटोकॉल" मेनू के तहत, "ABS 595" का चयन और सब wel के उजागररास "अच्छी तरह से चयन" मेनू के तहत परदे पर थाली मानचित्र में पढ़ा जा सके. वैसे तो प्रत्येक प्लेट की औसत पढ़ने की गणना प्रत्येक की luminescence मापने के लिए "रन" पर क्लिक करें. Normoxia (0 घंटा हाइपोक्सिया) नियंत्रण प्लेट की औसत पढ़ने से प्रत्येक हाइपोक्सिया प्लेट की औसत पढ़ने विभाजित करके संवाददाता गतिविधि का हाइपोक्सिया निर्भर गुना वृद्धि की गणना. नोट: यह स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त होने के लिए एक मजबूत हाइपोक्सिया निर्भर luciferase प्रतिक्रिया का पालन करने के लिए आवश्यक है. संवाददाता गतिविधि में पांच दस गुना वृद्धि उत्कृष्ट माना जाता है.
  9. चार उच्च नियंत्रण (HIF1A siRNA) प्रतिकृति (कुओं A1 डी 1), (FIH1 siRNA) (कुओं A12-D12) replicates चार कम नियंत्रण होता है कि एक मास्टर नियंत्रण प्लेट बनाएँ, चार बफर केवल replicates (कुओं E1-एच 1) नियंत्रण और चार सभी siRNA पूल 200 एनएम के एक एकाग्रता में हैं जहां गैर लक्ष्य siRNA नियंत्रण replicates (E12-H12),. नोट: उच्च और कम नियंत्रण बढ़ाने के लिए और decr ज्ञात है कि मार्ग नियामकों के आधार पर स्थापित कर रहे हैंक्रमशः हाइपोक्सिया प्रतिक्रिया को कम. वैकल्पिक रूप से, पुस्तकालय का एक सबसेट का उपयोग परख विकास उपयुक्त नियंत्रण की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  10. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, एक बाँझ सफेद दीवारों परख थाली करने के लिए प्रत्येक नियंत्रण siRNA के 10 μl हस्तांतरण. 10 μl में 0.1 μl अभिकर्मक अभिकर्मक के अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें कम सीरम मध्यम (1:100) अच्छी तरह से प्रत्येक नियंत्रण करने के लिए अच्छी तरह से, और हस्तांतरण अभिकर्मक मिश्रण की 10 μl प्रति. ऊपर पिपेट और नीचे मिश्रण करने के लिए संक्षेप में, और अभिकर्मक जटिल गठन की अनुमति के लिए 20-60 मिनट के लिए आराम करने के लिए थाली छोड़ दें.
  11. U20S-HRE कोशिकाओं की दूसरी कुप्पी के साथ 75,000 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल निलंबन की तैयारी. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, प्रत्येक अभिकर्मक मिश्रण करने के लिए सेल निलंबन के 80 μl (6,000 कोशिकाओं) जोड़ने. 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट हस्तांतरण, तो एक और 24 घंटे के लिए एक हाइपोक्सिया कार्य केंद्र के लिए स्थानांतरण और कदम के रूप में वर्णित luciferase assays के प्रदर्शन 1.61.8.
  12. [3 एक्स (उच्च नियंत्रण + कम नियंत्रण के मानक विचलन के मानक विचलन) / (उच्च नियंत्रण का मतलब है - - कम नियंत्रण के माध्य)] = 1 सूत्र जेड का उपयोग उच्च और कम नियंत्रण के लिए Z-पहलू की गणना. नोट: 0.5-1 के बीच के एक मूल्य के लिए एक शानदार परख इंगित करता है और के लिए प्रयासरत होना चाहिए.

2. प्राथमिक स्क्रीन

नोट: परख विकास मंच से इन बुनियादी शर्तों जगह में हैं, एक बार प्राथमिक स्क्रीन निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया जा सकता है.

  1. DMEM में 80-90% संगम को 7 एक्स 75 सेमी U20S-HRE कोशिकाओं के 2 बोतल ग्रो 10% वी के साथ पूरक / वी भ्रूण गोजातीय सीरम (एफसीएस).
    नोट: निम्न 2.2-2.13 दिवस 1 पर बाहर किया जाना चाहिए कदम.
  2. कदम 1.9 और विगलन बाहर siRNA ubiquitome एल के एक कमजोर पड़ने श्रृंखला में वर्णित के रूप में प्रत्येक नियंत्रण के 200 μl युक्त एक मास्टर नियंत्रण थाली तैयारी से दोहराने 1 आरंभ30 मिनट की एक न्यूनतम के लिए ibrary. नोट: प्रत्येक अच्छी तरह से नियंत्रण के लिए खाली छोड़ दिया कॉलम 1 और 12 के साथ 17 x 96 अच्छी तरह प्लेटें में इकट्ठे 4 siRNAs की एक पूल शामिल हैं.
  3. एक लामिना का प्रवाह हुड में, लेबल (या बार कोड) की संख्या 1-17 से lids के साथ 17 बाँझ सफेद दीवारों परख प्लेटें, siRNA पुस्तकालय श्रृंखला की एक थाली के लिए इसी.
  4. मास्टर नियंत्रण थाली अपकेंद्रित्र और siRNA सभी siRNAs अच्छी तरह से नीचे पर जमा करने के लिए सुनिश्चित पुस्तकालय संक्षिप्त (2,000 XG पर 1 मिनट) ubiquitome.
  5. प्रत्येक थाली में वही 96 अच्छी तरह से टिप ढेर का उपयोग कर, 17 परख प्लेटों पर एक स्वचालित तरल निकालने की मशीन के लिए रोबोट "टिकट" मास्टर नियंत्रण थाली से प्रत्येक नियंत्रण के 10 μl का प्रयोग करें.
  6. 17 पुस्तकालय प्लेटों में से प्रत्येक के लिए एक ताजा 96 अच्छी तरह से टिप पर ढेर, स्थानांतरण प्रत्येक के 10 μl का प्रयोग एक स्वचालित तरल निकालने की मशीन का उपयोग कर अपनी इसी परख थाली को siRNA ubiquitome.
  7. अनुपात तों का उपयोग कर 17 परख प्लेटों के लिए 40 मिलीलीटर अभिकर्मक अभिकर्मक की तैयारी1.10 में tablished. नोट: इस सेल निकालने की मशीन में "मृत मात्रा" के लिए खाते में एक अतिरिक्त 20 मिलीग्राम शामिल हैं. "मृत मात्रा" सेल निकालने की मशीन में ट्यूबिंग नेटवर्क के भीतर लगातार मौजूद तरल पदार्थ की मात्रा को दर्शाता है.
  8. 17 परख प्लेटें में अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक के 10 μl हस्तांतरण करने के लिए एक स्वचालित सेल निकालने की मशीन का प्रयोग करें. अभिकर्मक अभिकर्मक जटिल गठन: संक्षेप में तो siRNA अनुमति देने के लिए 20-60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अभी भी छोड़ देते हैं, siRNA और अभिकर्मक अभिकर्मक की पूरी तरह से मिश्रण की अनुमति के लिए एक प्रकार के बरतन (500 rpm पर 1 मिनट) पर परख प्लेटें हिला.
  9. 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ दो बार दो 75 सेमी U20S-HRE कोशिकाओं के 2 बोतल धो लें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिलीलीटर trypsin-EDTA के साथ अलग. एक समरूप सेल निलंबन बनाने के लिए ऊपर और नीचे प्रत्येक फ्लास्क और पिपेट को 8 मिलीलीटर DMEM कई बार 10% FBS जोड़ें. दोनों बोतल से कोशिकाओं का मिश्रण है और एक बाँझ 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब को हस्तांतरण.
  10. Pipetting द्वारा सेल एकाग्रता की गणना20 μl एक सेल गिनती चैम्बर के लिए दो प्रतियों में कोशिकाओं और 1.3 चरण में वर्णित के रूप में एक स्वचालित सेल काउंटर की दो रीडिंग से औसत सेल एकाग्रता की गणना.
  11. एक बाँझ प्लास्टिक कंटेनर में मिलीलीटर प्रति 75,000 कोशिकाओं के एक एकाग्रता के लिए DMEM 10% FBS के साथ गिराए द्वारा सेल निलंबन की 155 मिलीलीटर की तैयारी. नोट: यह मात्रा 17 प्लेटों के लिए पर्याप्त है और सेल निकालने की मशीन में मृत मात्रा के लिए एक अतिरिक्त 25 एमएल में शामिल हैं.
  12. सेल clumping को सीमित करने के लिए लामिना का प्रवाह हुड के अंदर स्थापित एक दोषी पर सेल निलंबन और जगह पर एक बाँझ चुंबकीय दोषी जोड़ें. सेल निलंबन के साथ स्वचालित सेल निकालने की मशीन संतुलित और अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं के 80 μl (6,000 कोशिकाओं) वितरित करने के लिए निर्धारित किया है.
  13. स्वचालित सेल निकालने की मशीन पर, बारी में, 17 प्लेटों की हर जगह और कोशिकाओं बांटना. 5 के समूह में समय और ढेर प्लेटें रिकॉर्ड तो 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 पर एक नम 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ढेर जगह है. नोट: अंतिम एकाग्रता कीsiRNA पूल 100 μl कुल मात्रा में 20 एनएम हो जाएगा.
    नोट: निम्न 2.14-2.15 दिवस 2 पर बाहर किया जाना चाहिए कदम.
  14. दोहराने 1 (2.2-2.13) के लिए दिन 1 में उल्लिखित प्रक्रिया के बाद, दिन 2 पर दूसरे को दोहराने का आरंभ.
  15. अभिकर्मक के 24 घंटे के बाद, एक हाइपोक्सिया कार्य केंद्र के लिए एक बाँझ वातावरण में दोहराने 1 से स्थानांतरण प्लेटें 1% ऑक्सीजन पर सेट और HRE संवाददाता प्रेरित करने के लिए 24 घंटे के लिए छोड़ दें.
    नोट: निम्न 2.16-2.20 3 दिन पर बाहर किया जाना चाहिए कदम.
  16. दोहराने 1 (2.2-2.13) के लिए दिन 1 में उल्लिखित प्रक्रिया के बाद तीसरे दोहराने आरंभ करें.
  17. अभिकर्मक के 24 घंटे के बाद, एक हाइपोक्सिया कार्य केंद्र के लिए एक बाँझ वातावरण में दोहराने 2 से हस्तांतरण प्लेटें 1% ऑक्सीजन पर सेट और HRE संवाददाता प्रेरित करने के लिए 24 घंटे के लिए छोड़ दें.
  18. दो घंटे पहले, 1 प्लेटों हाइपोक्सिया कार्य केंद्र से हटाया जा सके हैं दोहराने 1.6 में वर्णित के रूप में 2x luciferase सेल / परख बफर के 200 मिलीलीटर तैयार करते हैं. नोट: इस खंड मेंबफर जलाशय अच्छी तरह से कवर रहता है यह सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त 20 मिलीलीटर cludes.
  19. , 24 घंटा हाइपोक्सिया जोखिम और एक स्वचालित तरल निकालने की मशीन के उपयोग के बाद हाइपोक्सिया कार्य केंद्र से 1 परख प्लेटें दोहराने प्रत्येक परख की थाली के लिए 2x luciferase सेल / परख बफर के 100 μl जोड़ने के लिए और स्पष्ट फिल्म के साथ कवर निकालें.
  20. अच्छी तरह से कोशिकाओं lyse करने के लिए 500 rpm पर 10 मिनट के लिए एक सेल प्रकार के बरतन पर प्लेटें हिलाएँ. कदम 1.8 में वर्णित के रूप में एक luminometer प्लेट रीडर और रिकॉर्ड luminescence के लिए बदले में प्रत्येक प्लेट हस्तांतरण.
    नोट: निम्न 2.21-2.22 4 दिन पर बाहर किया जाना चाहिए कदम.
  21. अभिकर्मक के 24 घंटे के बाद, एक हाइपोक्सिया कार्य केंद्र के लिए एक बाँझ वातावरण में दोहराने 3 से स्थानांतरण प्लेटें 1% ऑक्सीजन पर सेट और HRE संवाददाता प्रेरित करने के लिए 24 घंटे के लिए छोड़ दें.
  22. दोहराने 1 के लिए इस्तेमाल निम्नलिखित कदम 2.18-2.20 से दोहराने 2 प्लेटें पढ़ें.
    नोट: निम्नलिखित कदम 2.23 5 दिवस पर बाहर किया जाना चाहिए.
  23. निम्न से दोहराने 3 प्लेटें पढ़ेंदोहराने 1 के लिए इस्तेमाल किया 2.18-2.20 कदम.
  24. प्राथमिक स्क्रीन के सभी 3 replicates संकलित करें, और 1.12 में दिए गए सूत्र का उपयोग कर एक थाली के लिए जेड पहलू की गणना. नोट: किसी भी थाली में कम से कम 0.5 की एक जेड कारक है, तो डेटा की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए इस थाली को दोहरा पर विचार करें.
  25. निम्न सूत्र का उपयोग करके उच्च और कम नियंत्रण के लिए विचरण (सीवी) के गुणांक की गणना: नियंत्रण के नियंत्रण / औसत से 100 एक्स मानक विचलन. नोट: सीवी यथासंभव कम किया जाना चाहिए, यह 10-15% भिन्नता उम्मीद करना उचित है. विभिन्नता में काफी अधिक है, तो थाली दोहरा विचार करें.
  26. . एक्स 100 इसके अलावा, गैर लक्ष्य की गणना (NT [- - / (उच्च नियंत्रण का मतलब है कम नियंत्रण के माध्य) (siRNA स्कोर उच्च नियंत्रण का मतलब है)]: निम्न सूत्र का उपयोग करके प्लेट प्रति प्रत्येक siRNA के प्रतिशत सक्रियण की गणना सूत्र [एनटी का नमूना डेटा / मतलब] का उपयोग करके प्रत्येक siRNA के) गुना. प्रतिशत सक्रियण और NT गुना दोनों के लिए, तीन replic के औसत की गणनाAtes और मूल्यों संकलन.
  27. कच्चे डेटा का उपयोग करना, तीन को दोहराने प्लेटें सूत्र का उपयोग सहसंबंधी बारीकी से कैसे निर्धारित करने के लिए स्पीयरमैन की रैंक सहसंबंध गुणांक (एसआरसीसी) की गणना:

    जहां आर = एसआरसीसी; डी = प्रत्येक रैंकों की जोड़ी और डेटा के जोड़े के एन = संख्या में दो संख्याओं के बीच का अंतर. नोट:. एक दोहराने अन्य 2 प्लेटों के खिलाफ कम एसआरसीसी से पता चलता है, तो थाली प्रतिकृति के बीच एक अच्छे संबंध के लिए 1 करीब मूल्यों दे देंगे, आगे की जांच और उस प्लेट को दोहरा पर विचार करें.
  28. (80 तक) माध्यमिक स्क्रीनिंग के लिए पर्याप्त रुचि के हैं जो siRNAs फैसला. (उदाहरण के लिए कम से कम 5% या अधिक 95% प्रतिशत सक्रियण, या कम से कम 0.5 NT गुना या अधिक 1.5 NT गुना दिखा सब siRNAs चयन) उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित कटौती नापसंद को रोजगार या के समूहों के लिए खोज करने के लिए जैव सूचना विज्ञान या ज्ञान आधारित तर्क लागू एक ही UBL मार्ग के भीतर गिरने हिट. नोट:सामान्य रूप से, इन तरीकों का एक संयोजन siRNA माध्यमिक स्क्रीनिंग में रखा जाता है, जो निर्धारित करता है.

3. माध्यमिक स्क्रीन

नोट: एक पुष्टि माध्यमिक स्क्रीन प्राथमिक स्क्रीन से ब्याज का 80 siRNAs की एक अधिकतम के आधार पर किया जाता है. यह संख्या सर्वाधिक प्राथमिक स्क्रीन के अनुसार पूर्ण नियंत्रण के साथ एक एकल 96 अच्छी तरह से थाली पर चढ़ाया प्रत्येक दोहराने (2.2 देखें) के साथ किया जा सकता है. यह प्राथमिक स्क्रीन में पहचान नियामकों reproducibly एक ही phenotype प्रकाश में लाना है, और यह अंतिम तृतीयक / deconvolution स्क्रीन के माध्यम से किया जाना चाहिए हिट जिस पर ट्राइएज निर्णयों को परिष्कृत करने में सहायता करेंगे कि पुष्टि करने के लिए बहुत उपयोगी है.

  1. 10% FBS के साथ DMEM में 80-90% संगम को 1 एक्स 75 सेमी U20S-HRE कोशिकाओं के 2 फ्लास्क आगे बढ़ें.
  2. प्लेट नंबर और प्राथमिक स्क्रीन हिट की स्थिति पर ध्यान दें, और एक कॉलम 1 छोड़ने, माध्यमिक स्क्रीन चेरी मास्टर प्लेट उठाया पर अपने नए स्थान की योजनाडी नियंत्रण के लिए नि: शुल्क 12. 1.9 में के रूप में लेकिन 50 μl के प्रत्येक नियंत्रण की कुल मात्रा के साथ नियंत्रण मास्टर थाली तैयार है.
  3. 30 मिनट की एक न्यूनतम के लिए ubiquitome पुस्तकालय के एक दूसरे के कमजोर पड़ने श्रृंखला (चेरी उठा व्यक्ति siRNA पूल के लिए अलग सेट) पिघलना. प्लेटें संक्षिप्त (2,000 XG पर 1 मिनट) अपकेंद्रित्र तो चेरी पर अपने नए प्लेट स्थानों के लिए माध्यमिक स्क्रीन siRNAs के 50 μl जोड़ने मास्टर प्लेट उठाया.
  4. निम्नलिखित संशोधनों के साथ प्राथमिक स्क्रीन के लिए उल्लिखित एक ही बुनियादी प्रोटोकॉल का उपयोग माध्यमिक स्क्रीन ले: (एक) को दोहराने के प्रति एक परख थाली में एक ही दिन में सभी तीन replicates चलाने के लिए और (ख) के हिसाब से अभिकर्मकों की मात्रा समायोजित करें.

4. तृतीयक / Deconvolution स्क्रीन

नोट: तृतीयक या deconvolution स्क्रीनिंग माध्यमिक स्क्रीन से 20 siRNAs की एक अधिकतम पर किया जाता है. यह कदम मूल पू से प्रत्येक व्यक्ति siRNA का उपयोग पछाड़ना के प्रभाव की जांच करने के लिए हैचार के एल. आम तौर पर, प्रत्येक पूल से कम से कम दो व्यक्ति siRNA duplexes मनाया phenotype siRNA बंद लक्ष्य प्रभाव के कारण नहीं है कि विश्वास की एक उचित डिग्री के लिए एक ही phenotype अवैध चाहिए. आगे इस स्तर पर आत्मविश्वास बढ़ाने के लिए, प्रश्न में जीन को लक्षित अतिरिक्त व्यक्तिगत siRNA duplexes बनाया गया है और दिया फेनोटाइप प्रकाश में लाना करने की क्षमता के लिए परीक्षण किया जा सकता है. इन प्रयोगों से परिणाम तो एच = 0.6 या अधिक (यानी 5 व्यक्ति siRNAs के बाहर कम से कम 3 फेनोटाइप बटोर जहाँ) 6 स्वीकार्य माना जाता है, जहां एच स्कोर की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. 10% FBS के साथ DMEM में 80-90% संगम को एक 75 सेमी U20S-HRE कोशिकाओं के 2 फ्लास्क आगे बढ़ें.
  2. नियंत्रण के लिए नि: शुल्क कॉलम 1 और 12 छोड़ने, तृतीयक स्क्रीन मास्टर प्लेट पर प्रत्येक हिट के चार व्यक्ति siRNA duplexes के स्थान की योजना बना द्वारा तृतीयक स्क्रीन के लिए एक थाली नक्शा बनाएँ. 1.9 में के रूप में लेकिन कुल के साथ नियंत्रण मास्टर थाली तैयार50 μl के प्रत्येक नियंत्रण की मात्रा.
  3. Deconvolution / व्यक्ति siRNA प्लेटें पिघलना और तीन एक्स 10 μl replicates और एक आरामदायक 20 μl अतिरिक्त के लिए अनुमति देने के लिए थाली मानचित्र (4.2) के अनुसार तृतीयक स्क्रीन मास्टर थाली के प्रत्येक कुएं में व्यक्ति siRNAs (200 एनएम) के 50 μl जोड़ने .
  4. (एक) को दोहराने के प्रति एक परख थाली में एक ही दिन में सभी तीन replicates चलाने के लिए और (ख) के हिसाब से अभिकर्मकों की मात्रा को समायोजित: निम्नलिखित संशोधनों के साथ प्राथमिक स्क्रीन के लिए उल्लिखित एक ही बुनियादी प्रोटोकॉल का उपयोग तृतीयक स्क्रीन से बाहर ले जाने

नोट: आदर्श व्यक्ति siRNA duplexes के लिए सीमा एक ही तंगी में स्थापित किया जाना चाहिए कट ऑफ पूल के लिए के रूप में. हालांकि, यह कम से कम एक अन्य द्वैध निर्धारित सीमा के भीतर गिर जाता है, खासकर जहां व्यक्तिगत siRNAs के लिए 10-20% की सीमा से आराम करने के लिए स्वीकार्य हो सकता है. यह siRNAs के व्यक्तिगत प्रभाव की तुलना में कम हो सकता है कि मन में सार्थक असर हैइसके विपरीत पूल, और कुछ मामलों में व्यक्ति siRNAs यह (एकाग्रता के लिए जिम्मेदार है, तब भी जब) पूल में मौजूद है जब से अलगाव में सेलुलर phenotype पर एक मजबूत प्रभाव दिखा सकते हैं.

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Representative Results

पिछले स्क्रीनिंग के लिए, U20S-HRE कोशिकाओं की हाइपोक्सिया प्रतिक्रिया की स्थापना की है. U20S-HRE कोशिकाओं नीचे की ओर हाइपोक्सिया के लिए जोखिम (चित्रा 1 ए) पर HIF1A/HIF1B heterodimer से बाध्य है जो हाइपोक्सिया प्रतिक्रिया तत्व के तीन संगठनों ने मिलकर प्रतियां, के जुड़े हुए जुगनू luciferase से मिलकर एक संवाददाता निर्माण व्यक्त करते हैं. प्रकोष्ठों हाइपोक्सिया जोखिम स्क्रीनिंग के लिए सबसे प्रभावी प्रतिक्रिया पैदा करता है जो स्थापित करने के लिए समय की एक श्रृंखला के लिए एक हाइपोक्सिया कार्य केंद्र में रखा जाता है. U20S कोशिकाओं इसलिए luciferase रीडिंग हाइपोक्सिया की मध्यस्थता HIF1A स्थिरीकरण 7 पर काफी हद तक निर्भर कर रहे हैं, HIF2A के निम्न स्तर व्यक्त करते हैं. 0 घंटा, 2 घंटा, 4 घंटा, 6 घंटा और luciferase गतिविधि का एक हाइपोक्सिया निर्भर प्रेरण (चित्रा 1 बी) में 24 घंटा परिणामों के लिए hypoxia के लिए U20S-HRE कोशिकाओं के संपर्क में. गतिविधि का एक ~ 10 गुना प्रेरण (चित्रा 1 बी) में 24 घंटा परिणामों के लिए hypoxia के लिए U20S-HRE कोशिकाओं का एक्सपोजर, इसलिए यह एक प्रतिनिधित्व करता हैn siRNA स्क्रीनिंग के लिए उत्कृष्ट प्रतिक्रिया.

उपयुक्त उच्च और निम्न नियंत्रण स्थापित करने के लिए, HIF1A और FIH1 को siRNAs transfect U20S-HRE कोशिकाओं को उल्टा करने के लिए उपयोग किया जाता है. प्रकोष्ठों 24 घंटे के लिए नियंत्रण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और luciferase assays के प्रदर्शन कर रहे हैं इससे पहले एक और 24 घंटे के लिए हाइपोक्सिया के संपर्क में हैं. FIH1 siRNA गैर लक्ष्य siRNA करने के लिए करीब 170% सापेक्ष (चित्रा 2) के लिए हाइपोक्सिया संकेत बढ़ाता है, जबकि HIF1A siRNA लगभग 10% करने के लिए हाइपोक्सिया संकेत कम हो. ये नियंत्रण स्क्रीनिंग के लिए एक शानदार स्कोर है जो 0.8 के एक औसत जेड कारक, में परिणाम. स्क्रीनिंग मापदंडों अब सफलतापूर्वक एक मजबूत स्क्रीन के लिए स्थापित किया गया है.

प्राथमिक स्क्रीन चित्रा 3 में प्रदर्शन कार्यप्रवाह का उपयोग 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में किया जाता है. नियंत्रण और पुस्तकालय siRNAs परख प्लेट (चित्रा 3) पर मुहर लगाई जाती है, और U20S-HRE कोशिकाओं रिवर्स ट्रांसफ़ेक्ट हैं तो मैं24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ncubated. Luciferase assays प्रदर्शन किया और डेटा (चित्रा -3 सी) विश्लेषण कर रहे हैं पहले परख प्लेटें फिर 24 घंटा (3B चित्रा) के लिए हाइपोक्सिया के संपर्क में हैं. स्क्रीन की गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण 0.5 ऊपर एक Z कारक 8, 9 वांछनीय है जहां प्रत्येक थाली के लिए जेड कारक, का निर्धारण भी शामिल है. जेड कारक चित्रा -4 ए में सूत्र का उपयोग कर तीन प्रतियों प्राथमिक स्क्रीन के प्रत्येक थाली के लिए गणना की है. प्रत्येक थाली के लिए जेड कारकों यह प्रत्येक थाली 0.5 की तुलना में अधिक से अधिक एक जेड कारक (चित्रा 4 बी) है देखा जा सकता है जहां एक तितर बितर साजिश, का उपयोग कल्पना कर रहे हैं. यह एक अलग विंडो नियंत्रण के बीच मौजूद है कितना अच्छा है पर रिपोर्ट और व्यक्तिगत स्क्रीन परख प्लेटों के साथ संभावित समस्याओं को उजागर कर सकते हैं के रूप में जेड कारक की गणना करना महत्वपूर्ण है. उच्च और कम नियंत्रण के CV भी गणना, और औसत 5.95% + / हैं - 0.4 और 8.04% + / - 1.2 क्रमशः. प्राथमिक स्क्रीननिम्न और उच्च नियंत्रण के बीच एक निरंतरता बनाने siRNA duplexes की एक वितरण में परिणाम है. आमतौर पर, siRNAs रिपोर्टर पर कोई प्रभाव नहीं (चित्रा 5) होने के बहुमत के साथ सकारात्मक और नकारात्मक नियामकों की संख्या लगभग बराबर हो जाएगा. ब्याज के नियामकों अनुवर्ती विश्लेषण और सत्यापन के लिए उच्च आत्मविश्वास नियामकों की एक सूची की स्थापना के लिए माध्यमिक तब तृतीयक स्क्रीनिंग के माध्यम से लिया जाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Hypoxia जोखिम U20S-HRE luciferase संवाददाता लाती है. SiRNA स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल U20S-HRE कोशिकाओं में हाइपोक्सिया संवाददाता निर्माण का प्रतिनिधित्व (ए) योजनाबद्ध. हाइपोक्सिया प्रतिक्रिया तत्व (HRE) के तीन संगठनों ने मिलकर प्रतियां ई ड्राइव करने HIF1A/HIF1B heterodimer से बंधे हुए हैंजुगनू luciferase की है xpression. (बी) के संवाददाता luciferase गतिविधि की मात्रा बढ़ाने में 2 घंटा, 6 घंटा, 10 घंटा और हाइपोक्सिया परिणाम के लिए 24 घंटे के लिए U20S-HRE कोशिकाओं का जोखिम बढ़ रही है. Luciferase गतिविधि में 10 गुना वृद्धि हुई है ~ में 24 घंटा हाइपोक्सिया जोखिम परिणाम 0 घंटा नियंत्रण (normoxia) की तुलना में. स्केल सलाखों मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. जांच के लिए उच्च और निम्न siRNA नियंत्रण स्थापित करना. U20S-HRE कोशिकाओं HIF1A (कम नियंत्रण) और FIH1 (उच्च नियंत्रण) में कमी करने के लिए siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट और क्रमशः 24 घंटा हाइपोक्सिया प्रदर्शन के जवाब में वृद्धि उल्टा. ये नियंत्रण स्क्रीनिंग के लिए एक शानदार स्कोर माना जाता है, जो 0.8 का एक जेड कारक, दे. गैर लक्ष्य (एनटी) siRNA के प्रभाव के लिए दिखाया गया हैतुलना. त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 3
SiRNA स्क्रीनिंग के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों के चित्रा 3. स्क्रीनिंग कार्यप्रवाह HIF1A हाइपोक्सिया प्रतिक्रिया के नियामकों की पहचान करने के लिए. (ए) व्यवस्था. नियंत्रण siRNAs संकेत और ubiquitome siRNA पुस्तकालय 17 प्लेटों में फैला आंतरिक स्तंभों, पर मुहर लगी है के रूप में बाहर स्तंभों पर मुहर लगाई जाती है. U20S-HRE कोशिकाओं रिवर्स ट्रांसफ़ेक्ट और 24 घंटे के लिए normoxia में incubated हैं. परख प्लेटें (बी) के ढेर में 24 घंटे के लिए 1% ऑक्सीजन पर सेट एक हाइपोक्सिया कार्य केंद्र के लिए एक बाँझ वातावरण में स्थानांतरित कर रहे हैं. (सी) प्लेट्स assays के सभी परख प्लेटों पर प्रदर्शन कर रहे हैं हाइपोक्सिया कार्य केंद्र और luciferase गतिविधि से हटा रहे हैं. Luminescence हैएक luminometer पर दर्ज की गई और डेटा विश्लेषण प्रत्येक पुस्तकालय siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के रिपोर्टर गतिविधि स्थापित करने के लिए प्रदर्शन किया.

चित्रा 4
चित्रा 4. गुणवत्ता नियंत्रण प्रत्येक थाली के Z कारक की गणना के द्वारा किया जाता है. (ए) प्रत्येक थाली के लिए जेड कारक है मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है जहां दिए गए सूत्र का उपयोग कर की गणना है, एम मतलब, पी सकारात्मक नियंत्रण और एन का प्रतिनिधित्व करता है नकारात्मक नियंत्रण. (बी) ubiquitome स्क्रीन के तीन replicates से प्रत्येक प्लेट की गणना की जेड कारक प्रदर्शित तितर बितर साजिश. 0.5 की एक कट ऑफ लागू है, और इस मामले में सभी प्लेटें एक जेड कारक> 0.5 प्रदर्शित करने और इसलिए गुणवत्ता नियंत्रण पारित किया जाता है.

चित्रा 5. SiRNA पुस्तकालय का वितरण दिखा चार्ट. इसी प्रतिशत सक्रियण में होने वाली तीन प्रतियों ubiquitome siRNA स्क्रीन से siRNAs की आवृत्ति प्रदर्शित चार्ट. निम्न और उच्च नियंत्रण क्रमश 0% और 100% के लिए सेट कर रहे हैं. siRNAs के बहुमत सेलुलर phenotype पर कोई प्रभाव नहीं है जिससे siRNA पुस्तकालय, उच्च और कम नियंत्रण के बीच समान रूप से वितरित किया जाता है. SiRNAs के एक छोटे से अनुपात में वृद्धि और कमी प्रतिक्रिया, और इसलिए मार्ग की संभावित उपन्यास नियामकों का प्रतिनिधित्व करने के लिए मनाया जाता है.

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Discussion

स्तनधारी कोशिकाओं में जीनोम चौड़ा siRNA स्क्रीन का उपयोग अलग जैविक रास्ते के उपन्यास नियामकों की पहचान करने में अत्यंत मूल्यवान साबित हो गया है. यहाँ, हम हाइपोक्सिया के लिए HIF1A की मध्यस्थता सेलुलर प्रतिक्रिया के नियामकों की पहचान करने के लिए एक लक्षित ubiquitome siRNA स्क्रीन के उपयोग का वर्णन किया है. वे आम तौर पर, सस्ता तेज, प्रबंधन आसान और केवल जांचकर्ताओं 7, 10, 11 में रुचि रखते हैं, जिसमें मार्ग घटकों पर रिपोर्ट कर रहे हैं के रूप में लक्षित स्क्रीन तेजी से आकर्षक होते जा रहे हैं.

यह बुनियादी सेल संवाददाता स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है यह सुनिश्चित करने के लिए परख के विकास के चरण में एक प्रमुख प्रयास करना महत्वपूर्ण है, और कि reproducibility और कम परिवर्तनशीलता प्राप्त किया जा सकता है. यह पुस्तकालय नियामकों गिर जाएगी जो भीतर जुदाई की एक खिड़की बनाने के लिए मजबूत सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का चयन करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, इनमें से प्रत्येक परख थाली में एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्यव्यक्तिगत प्लेटों के साथ किसी भी समस्याओं का तेजी से पहचान के लिए अनुमति देता है स्क्रीन.

उच्च throughput स्क्रीनिंग में एक आम समस्या आंतरिक वेल्स को थाली रिश्तेदार के बाहर कुओं में नमी में एक स्थानीय अंतर के कारण हो सकता है जो प्लेट बढ़त प्रभाव की घटना है. जगह में उचित नियंत्रण होने और प्लेट उत्पादन की गर्मी नक्शा बनाने से इस समस्या की पहचान करने में मदद कर सकते हैं. हम बढ़त प्रभाव प्लेटों के आधार पर नम टिशू पेपर का उपयोग, और अधिक भी इनक्यूबेटर अंदर प्रत्येक थाली का microenvironment बनाने के लिए प्लेटों के ढेर पर एक कड़ा, पारदर्शी प्लास्टिक बैग रखकर दूर किया जा सकता है कि मिल गया है.

SiRNA स्क्रीनिंग की एक सीमा है कि झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी की उपस्थिति है. झूठी नकारात्मक कारण अपर्याप्त इसी mRNA की पछाड़ना, या पर्याप्त अधिनियम का उत्पादन करने के लिए अवशिष्ट mRNA की क्षमता सहित कारकों की एक संख्या के कारण हो सकता हैकुशलता से अपने कार्य को करने के लिए प्रोटीन ive. वे एक अन्वेषक वास्तव में सवाल में मार्ग को नियंत्रित नहीं कर सकते हैं कि एक हिट निम्नलिखित महत्वपूर्ण समय निवेश करने के लिए पैदा कर सकता है के रूप में झूठी सकारात्मक, अधिक समस्याग्रस्त हैं. झूठी सकारात्मक siRNA के माध्यम से बंद लक्ष्य प्रभाव सहित तंत्र के एक नंबर के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है. SiRNA प्रश्न में नीचे न केवल mRNA दस्तक देता है लेकिन सच मार्ग नियामकों 12, 13 कर रहे हैं कि यह भी अन्य, अज्ञात लक्ष्यों. दृष्टिकोण की संख्या अधिक देखी फेनोटाइप दस्तक के लिए एक सच्चे परिणाम है कि इस्तेमाल किया और पुष्टि के रूप में स्वीकार कर रहे हैं, जहां यह है प्रश्न 14 में लक्ष्य जीन नीचे. उदाहरण के लिए, बंद लक्ष्य प्रभाव की समस्या चार एक ही बंद लक्ष्य प्रभाव होने की प्रारंभिक पूल से एक से अधिक व्यक्ति siRNA की संभावना कम हो जाती है जिससे तृतीयक स्क्रीनिंग, के हिस्से में दूर किया जा सकता है. इसके अलावा, सफलतापूर्वक siRNA प्रतिरोधी के साथ बचाव प्रयोगों प्रदर्शनहिट करने के लिए इसी cDNAs भी बंद लक्ष्य प्रभाव बाहर शासन होगा. यह अपने आप में इस दृष्टिकोण उदाहरण के लिए exogenously overexpressed प्रोटीन जरूरी वजह से प्रासंगिक परिसरों की बदल stoichiometry अंतर्जात समकक्ष को हूबहू कार्य या आदि बाद translational संशोधनों परेशान नहीं करेगा, निरंतर के बिना नहीं है कि ध्यान दिया जाना चाहिए मान्यता हिट करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण इसलिए उत्पन्न या पीटकर अधिग्रहण या तोड़े में हिट करने के लिए इसी सेल लाइनों, और इन सेल लाइनों siRNA पछाड़ना रूप में एक ही phenotype प्रदर्शित निर्धारित करने के लिए है. इस प्रकार, siRNA स्क्रीनिंग की सीमाओं सावधान प्रयोगात्मक अनुवर्ती के साथ दूर किया जा सकता है. इसके अलावा, अब तक संभावित झूठी सकारात्मक पहचान के साथ जुड़ी समस्याओं outweighs जांच के दायरे में रास्ते की वास्तविक संशोधक की निष्पक्ष पहचान.

संक्षेप में, एक लक्षित "ubiquitome" siRNA पुस्तकालय के साथ siRNA स्क्रीनिंग एक powerf हैubiquitin के उपन्यास सदस्यों और विशिष्ट जैविक रास्ते को विनियमित करने ubiquitin की तरह संशोधक की पहचान करने के लिए उल विधि. संवाददाता गतिविधि का एक मजबूत पढ़ने के लिए बाहर अगर वहाँ यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल किसी भी जैविक समस्या को लागू किया जा सकता है. उच्च आत्मविश्वास की अंतिम सूची स्क्रीन से हिट प्रत्येक हिट प्रश्न में मार्ग को नियंत्रित कैसे की यंत्रवत आधार स्थापित करने के लिए जहां से प्रारंभिक बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है. अंत में, इस ubiquitin और ubiquitin की तरह संशोधक अलग जैविक रास्ते को विनियमित कैसे की बढ़ती ज्ञान को जोड़ना होगा.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम वेलकम ट्रस्ट, ग्लैक्सोस्मिथक्लाइन (जीएसके) और सेल सिग्नलिंग के लिए स्कॉटिश संस्थान (एमआरसी प्रोटीन phosphorylation और ubiquitylation इकाई का अब हिस्सा) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated Liquid Dispenser Fluid-X XPP-721 http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html
White Walled Assay Plate Greiner Bio One 655083 http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/
Clear Plate Film Perkin Elmer 1450-461 http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461
siRNA library Thermo Scientific On-Target Plus http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/
Transfection reagent Invitrogen Lipofectamine RNAimax http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html
Reduced Serum Medium Invitrogen Optimem http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product
DMEM Invitrogen 41965-039 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#
FBS Invitrogen 16000-044 https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#
Tryspin-EDTA Invitrogen 25300-054 https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#

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References

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संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में जैविक रास्ते की Ubiquitin और ubiquitin की तरह सिस्टम नियामकों की पहचान siRNA स्क्रीनिंग
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Bett, J. S., Ibrahim, A. F. M.,… More

Bett, J. S., Ibrahim, A. F. M., Garg, A. K., Rocha, S., Hay, R. T. siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (87), e51572, doi:10.3791/51572 (2014).

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