Summary
Burada, hipoksiye HIF1A aracılı hücresel tepkinin yeni ubikitin ve ubikitin benzeri regülatörleri belirlemek için bir hedef siRNA "ubiquitome" ekranı gerçekleştirmek için bir yöntem tarif eder. Bu raportör etkinliğinin üzerinden sağlam bir okuma kullanılabilir herhangi bir biyolojik yoluna uyarlanabilir.
Abstract
Ubikitin ve ubikitin benzeri moleküller (ubl'ler) proteinlerin post-translasyonel modifikasyon hipoksi yanıt proteostasis, DNA hasarı tepkisi ve transkripsiyon da dahil olmak üzere çeşitli biyolojik yollar regüle eden bir dinamik bir hücresel sinyal ağı olarak ortaya çıkmaktadır. Daha iyi ubl'ler insan hastalığı ile ilgili yolları düzenleyen nasıl anlamak için, bir insan siRNA'yı derledik "ubiquitome" tüm bilinen ve UBL sistem yolların bileşenlerini tahmin hedefleme 1186 siRNA'nın dubleks havuzlarından oluşan kütüphanesi. Bu kütüphane UBL bileşenler, söz konusu yolun pozitif veya negatif düzenleyici olarak hareket belirlemek için çeşitli biyolojik yolların muhabir ifade eden hücre hatları, bir dizi karşı taranabilir. Burada, bir transkripsiyon tabanlı bir lusiferaz raportör kullanılarak hipoksiye HIF1A aracılı hücresel tepkinin ubiquitome-regülatörleri tanımlamak için bu kütüphane kullanan bir protokol açıklar. Bir ilk tahlil geliştirme aşamasıbirincil, ikincil ve üçüncül / ters evrişim tarama: üç aşamada ekranı gerçekleştirmeden önce hücre çizgisinin, uygun tarama parametrelerini elde etmek için gerçekleştirilir. Sadece araştırmacılar en çok ilgilenen hangi ile yolun üyelerinin raporlama avantajı sunuyor tüm genom SiRNA kütüphaneler üzerine hedeflenmiş kullanımının giderek daha popüler hale gelmektedir. SiRNA tarama doğal kısıtlamalara rağmen, özellikle yanlış pozitif siRNA hedef dışı etkilerinin neden olduğu, söz konusu yollarının gerçek yeni düzenleyici kimlik dikkatli bir şekilde yapılan kontrol deneyleri bir dizi performans ile aşılabilir bu eksiklikleri, ağır basmaktadır.
Introduction
Ubikuitin ve ubikuitin benzeri moleküller (ubl'ler) ile proteinlerin modifikasyonu çeşitli biyolojik yollar ve stres yanıtlarını düzenleyen geniş bir biyokimyasal sistemini temsil eder. Hedef proteinlerine ubl'ler arasında kovalent bağlanması kararlılık, lokalizasyon, fonksiyon ya da alt tabaka 1 arasında interactome düzenleyen çeşitli çıktılarına sahip olabilir. UBL değişiklik yatan enzimatik adımlar İlk Ubiquitinle için kurulan ve şimdi SUMO, NEDD8, ISG15 ve FAT10 dahil olmak üzere çoğu ubl'ler ile değişiklik için bir paradigma olarak hizmet edilmiştir. Modifikasyonu oluştuğu için, UBL diglisin motifinin karboksilat grubu, ilk olarak bir E2 konjuge enzimin aktif yer sistein aktarılır yüksek enerjili bir tiol oluşturulması için bir E1 aktifleştirici enzim tarafından aktive edilir. E2 sonra (genellikle) bir dallı zincir (isopeptide) oluşturarak, bir hedef lizin tortusu bağlantı 2 üzerine ubl transferine vasıta olan bir alt-tabaka bağlı E3 ligaz ile etkileşime. Modifikasyon ardışık mermi doğrusal ubiquitin zincirleri oluşturmak için ubikuitin için yedi lisin herhangi biri aracılığıyla oluşabilir alt-tabaka, üstüne ya da N-terminal metionin ile isopeptide zincirleri oluşturmak için oluşabilir. Bu değişiklikler, önceden uzman proteazlar tarafından UBL kaldırılması için yeni etkileşim motifleri oluşturmak ve bozulması için proteinleri hedefleme gibi çeşitli amaçlar ile ayrık topolojilerini oluştururlar. Ubikitin durumunda iki E1 enzim, 30-40 E2 konjuge enzimler, en azından 600 E3 ligaz ve yaklaşık 100 deubiquitylating enzimler (seslendirmeler) vardır. Diğer yollar 10 kadar ubl'ler daha az geniş olsa da, genel olarak, belirli bir ubiquitome karmaşıklığı UBL modifikasyonu biyolojik sonucu olarak çok büyük bir çeşitlilik elde edilir. UBL biyoloji büyük ilerlemeler yapılmış iken Ancak, bu ubiquitome bileşenlerin çoğunluğunun hassas hücresel rolleri bilinmemektedir.
Kısa int kullanımıerfering ribonükleik asit (siRNA'lar), ayrı ayrı genlerin biyolojik rolü farklı bağlamlarda 3 incelenecek sağlayan nedeniyle özel olarak yok edilmesi için hücresel mRNA hedef siRNA'lar yeteneği ters genetik olarak güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Tüm genom ekranlar birçok hücresel süreçlerin yeni regülatörleri belirlemek ve doğrulamak için kullanılan olmuştur ve daha geniş bilimsel topluluk için erişilebilir kullanışlı bir veri zenginlik yaratmıştır. Tüm genom ekranlar son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır iken Ancak, hedeflenen ekranlar onlar daha ucuz olarak giderek daha popüler hale geliyor, daha hızlı, sadece araştırmacı en ilgi olduğu genomunun üyeleri üzerinde daha az veri yönetimi ve rapor içerir. Bu nedenle, daha iyi hücresel süreçleri UBL aile bileşenleri dahil hangi anlamak için, biz tüm bilinen ve ubiquitome bileşenleri tahmin hedefleyen bir insan siRNA kütüphane derledik. Bu ubl'ler, E1 aktifleştirici enzimler, E2 içeren konjugeenzimler, E3 ligaz, ubikuitin-bağlama alanı (UBD) ihtiva eden proteinler ve takar. Bu kütüphane, böylece bu yollar düzenleyen yeni UBL bileşenlerin ilgili teşhisine izin veren, farklı biyolojik sorunların raportör hücre hatlarının geniş bir karşı ekran kullanılabilir.
Aşağıdaki protokol titiz bir hedef siRNA hipoksi HIF1A bağımlı yanıtı yeni regülatörleri belirlemek için ubiquitome ekranını nasıl gerçekleştirileceği açıklanır. Normal oksijen basıncı altında, HIF1A bu Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligaz 4 tarafından tanınan karmaşık ve bozulma için hedef yol açar prolil hidroksilasyon tabidir. Hipoksi HIF1A stabilizasyonuna neden prolil hidroksilasyon inhibe eder ve bunun daha sonraki hipoksi karşılık elemanları (HRE'ler) bağlanma gen ekspresyonunu tahrik etmek için. Burada, stabil bir şekilde Hy üç tandem kopya kontrolü altında ateş böceği lusiferazı ifade eden U20S osteosarkoma hücreleri kullanılarak bir ekran tanımlamakpoxia yanıt elementi (HRE-U20S hücreleri) 5. Raportör etkinliğinin güçlü bir-okuma elde edilebilir ve uygun bir pozitif ve negatif kontroller ile birlikte alınabilir, bu protokol, herhangi bir biyolojik bir yol için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Testi Geliştirme Safhası
Not: önce siRNA ekran başlatılması için, bir deney geliştirme aşaması, raportör hücre hattı ile taranması için önemli parametrelerini ayarlamak için çok önemlidir. Bu ekranın gelecekteki başarısını destekleyecek olarak bu aşamada önemli çaba yatırım esastır.
- U20S-HRE raportör hücre hattının hipoksiyaya tepki karakterize etmek için,% 10 FBS ile takviye edilmiş Eagle Medium (DMEM) Dulbeccos Modified içinde% 80-90 birlikte akması için 2 x 75 cm-HRE U20S hücreleri 2 şişeler büyür.
- Aspire hücre bir şişe ortam, 10 ml PBS ile iki kez yıkama ve 2 ml% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ilave edildikten ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilerek hücreleri ayırmak. 8 ml DMEM, homojen bir hücre süspansiyonu oluşturmak için yukarı ve aşağı% 10 FBS ve pipet içinde süspanse edin hücreleri.
- Pipet 20 çift olarak bir hücre sayım bölmesi süspansiyonun ul, ve otomatik bir hücre kurs içine yerleştirin bölmeyiGünter. Hücre sayacı yazılımı "Ekran Görüntüsü" tıklayın ve hücreler odak sağlamak. "Kont" tıklayın ve hücre yoğunluğu not edin. Diğer nüsha için bunu tekrarlayın ve ortalama hücre yoğunluğunu hesaplamak. 60,000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar DMEM,% 10 FBS ile hücreleri seyreltin.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak, aynı üç sütun (örneğin A5-H5, H6 ve A6-A7-H7) 5 steril beyaz duvarlı 96 oyuklu deney plakaları, ve transfer etmek için seyreltilmiş hücre 100 ul (6.000 hücre) ekleyin gece boyunca,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi. Not: 0 saat, 2 saat, 6 saat, 10 saat ve 24 saat: Bu plakalar hipoksi maruziyetin bir dizi için hipoksiyaya bağımlı bir lusiferaz üretimini belirlemek için kullanılacaktır.
- Ertesi gün sonunda, zaman zaman not ve% 1 oksijen hipoksi iş istasyonu seti 24 saat hipoksi plaka ekleyin. 24 saat plaka fr kaldırılması nedeniyle önce Sonraki sabah, süresi 10 saat, 6 saat ve 2 saat hesaplamakhipoksi iş istasyonu om. Bu zamanlarda, hipoksi iş istasyonu için 10 saat, 6 saat ve 2 saat tabak ekleyin.
- 16 mM MgCl2;, 2 mM DTT, 2% Triton-X-100,% 30 gliserol, 1 mM ATP, 1% BSA, 0.25 mM 2x Birleştirilen lusiferaz lizis / deney tamponu içinde 30 ml (50 mM Tris pH 7.8 fosfat hazırlanması lusiferin ve 8 mcM Na 4 P 2 O 7). Not: listelenen sırada bileşenler eklemek ve BSA, en az 30 dakika luciferase ve Na 4 P 2 O 7 eklenmesinden önce çözünmesi için izin verir.
- Uygun zamanda hipoksi iş istasyonundan tüm plakaları çıkarın. Tahlil plakasının uygun oyuklarına 2x lusiferaz lizis / deney tamponu içinde 100 ul ilave edin ve berrak bir film ile kapatın. İyice, hücreleri parçalamak için 500 rpm'de 10 dakika boyunca, bir plaka karıştırıcısı üzerinde çalkalayın plakaları.
- Otomatik bir 96 plaka Lüminometre rafa plaka yığını aktarın. "Protokoller" menüsü altında, "abs 595" seçin ve tüm wel vurgulayınls "iyi seçim" menüsü altında ekran plaka haritasında okunacak. Iyi o zaman her plaka ortalama okuma hesaplamak her lüminesans ölçmek için "Çalıştır" a tıklayın. Normoksiyada (0 saat hipoksi) kontrol plakası ortalama okuma her hipoksi plakanın ortalama bir değer bölünmesiyle raportör aktivitesinin hipoksiyaya bağımlı kat artış hesaplanır. Not: Bu tarama için uygun olacak olan, sağlam bir hipoksiyaya bağımlı bir lusiferaz yanıtı izlemek için gereklidir. Raportör aktivitesinde bir beş-on kat daha iyi olarak kabul edilir.
- Dört yüksek kontrolü (HIF1A siRNA) replika (kuyu A1-D1), (FIH1 siRNA) (kuyular A12-D12) çoğaltır, dört düşük kontrol içeren bir ana kontrol levhası oluşturmak, dört tampon sadece çoğaltır (kuyu E1-H1) kontrol ve dört Tüm siRNA havuzlar 200 nM 'lik bir konsantrasyonda olduğu hedef dışı kontrol siRNA replika (E12-H12). Not: Yüksek ve düşük denetimleri artırmak ve decr bilinen yolu düzenleyiciler göre belirlenmiştirsırasıyla hipoksi tepkisini hafifletmek. Seçenek olarak ise, bir alt kütüphane kullanılarak tahlil geliştirme uygun kontroller belirlemek için kullanılabilir.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak, steril beyaz duvarlı bir deney plakası için her kontrol siRNA 10 ul transfer. 10 ul 0.1 ul transfeksiyon reaktifi transfeksiyon karışımı hazırlayın düşük serum ortamında (1:100) her kontrol için iyi ve transfer transfeksiyon karışımı 10 ul başına. Pipet ve aşağı yukarı karıştırmak için kısaca, ve transfeksiyon kompleksi oluşumunu sağlamak için 20-60 dakika dinlenmeye bırakın plaka.
- U20S-HRE hücrelerin ikinci bir şişe ile 75,000 hücre / ml 'lik bir hücre süspansiyonu hazırlanır. Bir çok kanallı pipet kullanarak, her bir transfeksiyon karışımı hücre süspansiyonu, 80 ul (6.000 hücre) ekleyin. 24 saat boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C inkübatöre plaka aktarın, sonra ilave bir 24 saat için hipoksi bir iş istasyonuna aktarmak ve adımlarda açıklandığı gibi lusiferaz tahlilleri yerine 1,6-1.8.
- [3 x (yüksekten kontrol + düşük kontrolünün standart sapma standart sapma) / (yüksek kontrol demek - - düşük kontrol ortalamasını)] = 1 formülü Z kullanarak, yüksek ve düşük kontrolleri için Z-faktör hesaplayın. Not: 0,5-1 arası bir değer mükemmel bir deneyi gösterir ve için gayret edilmelidir.
2.. Birincil Ekran
Not: deney gelişme aşamasından, bu temel koşulların yerine bir kez, birincil ekranı, aşağıdaki protokol kullanılarak 96 kuyulu bir levha formatında üç kopya halinde gerçekleştirilebilir.
- DMEM içinde% 80-90 birlikte akması için 7 x 75 cm-HRE U20S hücreleri 2 şişeler büyümek,% 10 v ile takviye / h cenin sığır serumu (FCS).
Not: Aşağıdaki 2,2-2,13 Gün 1 yapılmalıdır adımları. - Adım 1.9 ve çözülmeye dışarı SiRNA ubiquitome l bir seyreltme dizi açıklandığı gibi her denetimin 200 ul içeren bir ana kontrol levhası hazırlayarak çoğaltmak 1 başlatın30 dakika içinde en az ibrary. Not: her bir kontrol için, boş kalan sütun 1 ve 12 ile 17 x 96 oyuklu plakalar içinde monte 4 siRNA'lar havuzu içerir.
- Bir laminar akış başlığı içinde, etiket (ya da bar-kod) sayı 1-17 ikinci kapak 17 steril beyaz duvarlı deney plakaları, siRNA kütüphane serinin her bir plakaya tekabül etmektedir.
- Ana kontrol plaka Santrifüj ve siRNA tüm siRNAs kuyunun dibinde birikir sağlamak için kütüphane kısaca (2,000 x g'de 1 dk) ubiquitome.
- Her plaka için aynı 96-iyi ucu yığınını kullanarak, 17 tahlil plakaları üzerine bir otomatik sıvı dağıtıcı robot gibi "pul" ana kontrol plakadan her denetimin 10 ul kullanın.
- Kütüphane 17 plakalarının her biri için yeni bir 96 oyuklu ucu yığını, transfer her biri 10 ul kullanılarak otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanılarak, karşılık gelen deney plakasına siRNA ubiquitome.
- Bu oran es kullanarak 17 deney plakası için 40 ml transfeksiyon reaktifi hazırlayın1.10 olarak kurulmuş. Not: Bu hücre dağıtıcı içinde "ölü hacim" hesaba katmak için, ilave bir 20 ml içerir. "Ölü hacim" hücre dağıtıcı içinde boru ağı içinde sürekli olarak mevcut sıvı hacmine ifade eder.
- 17 deney plakalarının her oyuğa transfeksiyon tepkin maddesi 10 ul transfer etmek için bir otomatik hücre dağıtıcı kullanın. Transfeksiyon reaktifi kompleks oluşumu: kısa bir süre sonra siRNA izin vermek için 20-60 dakika için oda sıcaklığında bırakın yine, siRNA ve transfeksiyon reaktifi tamamen karışmasını sağlamak için, bir çalkalayıcı (500 rpm'de 1 dakika) üzerinde deney plakaları sallayın.
- 10 ml PBS ile iki kez, iki 75 cm U20S hücreleri HRE-2 şişeler yıkanır ve 5 dakika boyunca 37 ° C 'de 2 ml tripsin-EDTA ile ayırmak. Bir homojen hücre süspansiyonu oluşturmak için yukarı ve aşağı her balona ve pipet 8 ml DMEM'de birkaç kez% 10 FBS ekleyin. Her iki şişelerinden hücreler birleştirilir ve steril bir 50 ml plastik tüpe aktarın.
- Pipetleme hücre konsantrasyonunu hesaplayın20 ul hücre sayım bölmesi için iki kez hücre ve aşama 1.3 'de tarif edildiği gibi otomatik bir hücre sayacı iki okumalardan ortalama hücre konsantrasyonunu hesaplamak.
- Steril plastik bir kap içinde, ml başına 75.000 hücre konsantrasyonuna DMEM,% 10 FBS ile inceltilir hücre süspansiyonunun 155 ml hazırlayın. Not: Bu birim 17 tabak için yeterlidir ve hücre dağıtıcı içinde ölü hacim için ilave bir 25 ml içerir.
- Hücre topaklanma sınırlamak için laminar akış başlığı içinde kurulmuş bir karıştırıcı üzerinde hücre süspansiyonu ve yere bir steril manyetik karıştırıcı ekleyin. Hücre süspansiyonu ile otomatik hücre dağıtıcı dengeye ve oyuk başına hücre 80 ul (6.000 hücre) dağıtmak için ayarlayın.
- Otomatik hücre dağıtıcı üzerine, sırayla, 17 plakalarının her biri koyun ve hücreleri dağıtmak. 5 grupları olarak zaman ve yığın kaydedin plakaları daha sonra 24 saat boyunca% 5 CO2 ile nemli bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde yığınları yerleştirin. Not: nihai konsantrasyon bölgesininSiRNA havuzu 100 ul toplam hacmi 20 nM olacak.
Not: Aşağıdaki 2,14-2,15 2. Gün yapılmalıdır adımları. - Tekrarında 1 (2,2-2,13) için Gün 1 'de tarif edilen prosedür takip edilerek 2 gün ikinci deney başlatın.
- Transfeksiyondan 24 saat sonra, hipoksi iş istasyonu için, steril bir ortamda suret 1 ila transfer plakaları% 1 oksijen ayarlanır ve HRE raportör uyarılması için 24 saat boyunca bekletin.
Not: Aşağıdaki 2,16-2,20 Gün 3 yapılmalıdır adımları. - Tekrarında 1 (2,2-2,13) için Gün 1 'de belirtilen prosedür takip edilerek, üçüncü, kopya başlatın.
- Transfeksiyondan 24 saat sonra, hipoksi iş istasyonu için, steril bir ortamda suret 2 transfer plakalar% 1 oksijen ayarlanır ve HRE raportör uyarılması için 24 saat boyunca bekletin.
- Iki saat önce, 1 plakalar hipoksi iş istasyonundan kaldırılacak çoğaltmak 1.6 de tarif edildiği gibi 2x lusiferaz lizis / deney tamponu içinde 200 ml hazırlar. Not: Bu hacim içindetampon haznesi kapalı kalmasını sağlamak için, ilave bir 20 ml cludes.
- , 24 saat hipoksi pozlama ve otomatik sıvı dağıtıcı kullandıktan sonra hipoksi iş istasyonundan 1 tahlil plakaları çoğaltmak her tahlil plakasına 2x lusiferaz lizis / deney tamponu 100 ul ekleyin ve net film ile kaplayın çıkarın.
- İyice, hücreleri parçalamak için 500 rpm'de 10 dakika için bir hücre çalkalayıcıda plakaları çalkalayın. Adım 1.8 'de tarif edildiği gibi bir luminometre plaka okuyucu ve kayıt lüminesans sırayla her bir plak aktarın.
Not: Aşağıdaki 2.21-2.22 4. gün yapılmalıdır adımları. - Transfeksiyondan 24 saat sonra, hipoksi iş istasyonu için, steril bir ortamda 3 suret transfer plakalar% 1 oksijen ayarlanır ve HRE raportör uyarılması için 24 saat boyunca bekletin.
- Replika 1 için kullanılan aşağıdaki adımları 2,18-2,20 tarafından Replicate 2 tabak okuyun.
Not: Aşağıdaki adım 2.23 5. günde yapılmalıdır. - Takip ederek suret 3 tabak Okureplika 1 için kullanılan 2,18-2,20 adım.
- Birincil ekranın 3 suret derlemek ve 1.12 'de verilen formül kullanılarak her plaka için Z faktörünün hesaplanması. Not: Herhangi bir tabak az 0.5 Z faktörü varsa, veri kalitesini artırmak için bu plakayı tekrar düşünün.
- Aşağıdaki formül kullanılarak, yüksek ve alçak kontroller için varyans (CV) katsayısını hesaplayın: kontrolü kontrol / ortalamasının 100 x standart sapma. Not: CV mümkün olduğunca düşük olmalı,% 10-15 varyasyon beklemek mantıklıdır. Değişim önemli ölçüde daha yüksek olması durumunda, plaka tekrar göz önünde bulundurun.
- . X 100 Buna ek olarak, hedef olmayan hesaplamak (NT [- / - (yüksek denetim ortalama düşük kontrolü ortalama) (siRNA puanı yüksek kontrolü ortalama)]: Aşağıdaki formül kullanılarak plaka başına her siRNA'nın yüzde aktivasyonunu hesaplayın formülü [NT Örnek veri / ortalama] kullanarak her siRNA'nın) kat. Yüzde aktivasyonu ve NT-kat ikisi için, üç Replic ortalamasını hesaplamakates ve değerlerini derlemek.
- Ham verileri kullanılarak, üç suret tabak formülü kullanarak ilişkilendirmek ne kadar yakından belirlemek için Spearman Sıra Korelasyon Katsayısı (SRCC) hesaplamak:
burada r = SRCC; d = Her rütbeleri çifti ve veri çiftleri n = sayısında iki sayı arasındaki fark. Not:. Bir suret, diğer 2 tabak karşı düşük SRCC gösteriyorsa plakası suretin arasında iyi bir korelasyon 1 yakın değerler verecektir, daha fazla araştırmak ve bu plaka tekrar düşünün. - (80 kadar) ikincil taraması için yeterli ilgi hangi siRNAs karar verin. (Örn. az 5 veya% 95 üzerinde% yüzde aktivasyonunu ya da az 0,5 NT-kat veya 1.5 üzerinden NT-kat gösteren tüm siRNA'lara seçerek) kullanıcı-tanımlı kesme off istihdam veya kümeleri aramak için biyoinformatik veya bilgiye dayalı muhakeme Aynı UBL yol içinde düşen vurur. Not:normal olarak, bu yaklaşımların bir kombinasyonu siRNA ikinci tarama alınır belirler.
3.. İkincil Ekran
Not: doğrulayıcı ikinci ekran birincil ekranından ilgi 80 siRNA'lar maksimum göre gerçekleştirilir. Bu numara, uygun birincil ekran başına tam olarak kontrol ile tek bir 96 yuvalı plaka üzerine kaplama her tekrarında (2.2) ile gerçekleştirilebilir. Bu primer elemede tanımlanan düzenleyiciler yeniden üretilebilir aynı fenotip ortaya çıkarmak, ve bu da son üçüncül / ters evrişim ekrana ile yapılmalıdır edecek üzerinde triyaj kararları rafine yardımcı onaylamak için çok yararlıdır.
- ,% 10 FBS'li DMEM içinde% 80-90 birlikte akması için 1 x 75 cm U20S hücreleri HRE-2 balon büyütün.
- Plaka numarası ve birincil ekran hitlerinden konumunu not alın ve bir kolonlara 1 bırakarak, ikincil ekran kiraz ana plakayı aldım üzerinde yeni bir konum planıd kontrolleri için ücretsiz 12. 1.9 de olduğu gibi, ancak 50 | il her bir kontrol toplam hacmi ile kontrol ana plaka hazırlayın.
- 30 dakika içinde en az ubiquitome kitaplığının ikinci seyreltme serisini (kiraz toplama tek siRNA havuzları için bir kenara) çözülme. Plakalar kısaca (2,000 xg 1 dakika) santrifüj sonra kiraz yeni plaka yerlere ikincil ekran siRNA'ların 50 ul ekleyin usta plakasını aldı.
- Şu değişiklikler ile birinci ekran için belirtilen aynı temel protokolü kullanılarak ikinci ekran yapınız: (a) her tekrar için bir deney plakası aynı günde üç kez tekrarlanmalıdır ve (b) uygun şekilde reaktiflerin hacimleri ayarlayın.
4. Tersiyer / Dekonvolüsyon Ekran
Not: üçüncül veya Dekonvolüsyonun tarama ikincil ekranından 20 siRNA'ların maksimum gerçekleştirilir. Bu adım, orijinal poo her birey siRNA'yı kullanarak Nakavt etkisini incelemek içindört l. Normal olarak, her bir havuz en az iki ayrı siRNA dubleks gözlenen fenotipin siRNA hedef dışı etkiler nedeniyle değil güven makul bir derecesine sahip olması ile aynı fenotip kural dışı gerekir. Bundan başka, bu aşamada güven artırmak için, söz konusu hedef gen, ek tek siRNA dubleks tasarlanmış ve verilen fenotip ortaya etme kabiliyetleri açısından test edilebilir. Bu deneylerden elde edilen sonuçlar daha sonra, H = 0.6, ya da üzerinde (yani, 5 ayrı siRNA'lar üzerinden en az 3 fenotip temin eder) 6 olarak kabul edilebilir olarak kabul edilir, H skoru hesaplamak için kullanılabilir.
- ,% 10 FBS'li DMEM içinde% 80-90 birlikte akması için bir 75 cm'lik U20S hücreleri HRE-2 balon büyütün.
- Denetimler için ücretsiz sütunları 1 ve 12 bırakarak, üçüncül ekran ana plaka üzerindeki her hit dört ayrı SiRNA dubleksler yerini planlama tarafından üçüncül ekran için bir tabak haritası oluşturun. 1.9 gibi ama toplamda kontrol ana tabak hazırlayın50 ul her bir kontrol hacmi.
- Ters evrişim / birey siRNA plakaları çözülme ve üç x 10 ul tekrarlanmış ve rahat bir 20 ul fazla olanak sağlamak için plaka haritada (4,2) 'e göre üçüncü ekran ana plakanın her oyuğuna ayrı ayrı siRNA'lar (200 nM) 50 ul ekle .
- (A) her tekrar için bir deney plakası aynı günde üç kez tekrarlanmalıdır ve (b) uygun şekilde reaktiflerin seviyesini ayarlamak: şu değişiklikler ile birincil ekran için belirtilen aynı temel protokol kullanılarak tersiyer ekran yürütmek
Not: İdeal bireysel SiRNA dublekslerden için eşik aynı stringensi'de ayarlanmış olmalıdır kesme havuz gibi. Ancak, en az bir diğer dubleks belirlenen eşiğin içinde kalan, özellikle burada, bireysel SiRNA'lar için% 10-20 barajını dinlenmek için kabul edilebilir. Bu siRNA'ların bireysel etkisi daha az olabilir akılda değerli yataktıraksine havuz ve bazı durumlarda bireysel siRNAs o (konsantrasyon sorumluydu bile) havuzda var olduğunda daha izolasyon hücresel fenotipi üzerinde güçlü bir etki gösterebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önceki tarama, U20S-HRE hücrelerin hipoksiyaya tepki kurulur. U20S hücreleri, alt-HRE hipoksiye maruz kalma (Şekil 1A) üzerine HIF1A/HIF1B heterodimer ile bağlı olduğu hipoksi karşılık elemanı, üç tandem kopya, bir kaynaşık ateşböceği lusiferaz oluşan bir raportör yapıyı ifade eder. Hücreler, hipoksi maruz tarama için en etkili tepki üreten kurmak için birkaç kez bir dizi için bir iş istasyonu hipoksi yerleştirilir. U20S hücreleri bu nedenle lusiferaz okumalar hipoksi-aracılı HIF1A istikrar 7 büyük ölçüde bağımlı olan, HIF2A düşük seviyelerde ifade eder. 0 saat, 2 saat, 4 saat, 6 saat ve lusiferaz aktivitesinin hipoksiyaya bağımlı bir endüksiyon (Şekil 1 B) içinde 24 saat için sonuçları hipoksiye U20S-HRE hücrelerin maruz kalması. Aktivite ~ 10 kat indüksiyonu (Şekil 1 B) 24 saat için sonuçları hipoksiye U20S-HRE hücrelerin maruz, bu nedenle bu, bir temsil edern siRNA tarama için mükemmel bir tepki.
Uygun yüksek ve düşük kontroller olarak belirlemek için, HIF1A ve FIH1 siRNA'lar için transfect U20S hücreleri HRE-ters için kullanılır. Hücreler, 24 saat boyunca kontrol ile transfekte edilmiş ve lusiferaz tahlilleri gerçekleştirilir önce, ilave bir 24 saat için hipoksi maruz kalmaktadır. FIH1 siRNA hedef olmayan SiRNA yaklaşık 170% bağıl (Şekil 2) hipoksi sinyalini artırır oysa HIF1A SiRNA% 10 civarında hipoksi sinyali azalır. Bu kontroller, tarama için mükemmel bir puan 0.8 arasında bir ortalama Z faktörü ile sonuçlanır. Tarama parametreleri artık başarılı sağlam bir ekran için kurulmuştur.
Birincil ekran, Şekil 3'te gösterilen bir iş akışı kullanarak 96-kuyucuklu bir plaka biçiminde gerçekleştirilir. Kontrol ve kütüphane siRNA'lar deney plakası (Şekil 3A) üzerine kaplanır, ve U20S hücreleri, bir ters-HRE transfekte daha sonra i24 saat boyunca 37 ° C'de ncubated. Lusiferaz deneyleri gerçekleştirilmiştir ve veri (Şekil 3C) analiz edilmeden önce deneyi Plakalar daha sonra 24 saat (Şekil 3B) için hipoksiye maruz bırakılır. Ekranın kalite kontrol analizi 0.5 üzerinde bir Z faktörü 8, 9, arzu edilen her plaka için Z faktörü tespitini içerir. Z faktör Şekil 4A'daki formülü kullanarak üç kopya birincil ekranın her plaka için hesaplanır. Her bir plaka için Z faktör, her bir plaka 0.5 'den daha büyük olan bir Z faktörü (Şekil 4B) sahiptir görülebilir bir dağılım grafiği kullanılarak görünür hale getirilir. Bir ayrılık pencere kontrolleri arasında var ne kadar iyi raporlar ve bireysel ekran tahlil plakaları ile olası sorunları vurgulamak gibi Z faktörünün hesaplanması önemlidir. Yüksek ve düşük kontrol CV de hesaplanır ve ortalama% 5.95 + / vardır - 0.4 ve% 8.04 + / - 1.2 sırasıyla. Birincil ekrandüşük ve yüksek kontroller arasında bir süreklilik oluşturan siRNA dubleksler bir dağılımı sonuçları. Tipik haliyle, siRNA'lar muhabir üzerinde bir etkisi (Şekil 5) sahip olan bir çoğunluğu ile, pozitif ve negatif düzenleyicilerinin, yaklaşık olarak eşit sayıda olacaktır. Ilgi regülatörler takip analiz ve doğrulama için yüksek güven regülatörlerin bir listesini oluşturmak için ikincil üçüncül sonra tarama yoluyla alınır.
Şekil 1. Hipoksi maruz U20S HRE-lusiferaz reporter neden olur. SiRNA taranması için de kullanılabilir U20S-HRE hücrelerinde hipoksi raportör yapıyı temsil eden (A) şematik. Hipoksi karşılık elemanının (HRE) üç tandem kopyalar e sürmek için HIF1A/HIF1B heterodimer ile bağlıdırlarateşböceği lusiferaz XPression. (B) raportör, lusiferaz aktivitesi artan miktarlarda, 2 saat, 6 saat, 10 saat ve hipoksi ile 24 saat için U20S-HRE hücrelerin maruz artırılması. Lusiferaz aktivitesinde 10 kat bir artış ~ 24 saat hipoksiyaya maruz kalma sonucu 0 saat kontrol (normoksi) ile karşılaştırıldığında. Ölçek çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder.
Şekil 2.. Taraması için yüksek ve düşük siRNA kontrolleri oluşturulması. U20S-HRE hücreleri HIF1A (düşük kontrol) ve FIH1 (yüksek denetim) Azalış siRNA transfekte ve sırasıyla 24 saat hipoksi maruz kalma yanıt artırabilir ters. Bu kontroller tarama için mükemmel bir puan kabul edilir 0.8 Z faktörü vermek. Hedef olmayan (NT) siRNA etkisi için gösterilirkarşılaştırması. Hata çubukları ortalamanın standart hatalarını temsil etmektedir.
SiRNA elenmesi için 96 kuyulu plakaların Şekil 3,. Tarama akışı HIF1A hipoksi tepkisinin regülatörleri tespit etmek. (A) bir aranjman. Kontrol siRNA'lar belirtilen ve ubiquitome siRNA kütüphane 17 plakalar yayılmış, iç sütunlar, üzerine damgalanır gibi dış sütunlar üzerine damgalanır. U20S hücreleri HRE-ters-transfekte edilmiş ve 24 saat boyunca normoksiyada inkübe edilir. Tahlil plakaları (B) Yığınlar, 24 saat boyunca% 1 oksijen ayarlanmış bir hipoksi iş istasyonu için, steril bir ortamda aktarılır. (C) levhalar deneyler, her deney plakası üzerinde gerçekleştirilen hipoksi iş istasyonu ve lusiferaz aktivitesi kaldırılır. Lüminesans olduğunubir luminometre üzerinde kaydedildi ve veri analizi her bir kütüphane siRNA ile transfekte edilmiş hücrelerin, raportör aktivitesini belirlemek için kullanılmıştır.
Şekil 4,. Kalite kontrolü her plakanın Z faktörünün hesaplanması ile gerçekleştirilir. (A) her bir plaka için Z faktörü s, standart sapmayı temsil verilen formül kullanılarak hesaplanır, m ortalama, s, pozitif kontrol ve n'nin Negatif kontrol. (B) ubiquitome ekranın üç kez tekrarlanmış olan her plakanın hesaplanan Z faktörünü gösteren saçılma grafiğidir. 0.5 'lik bir kesme uygulanmış, ve bu durumda, tüm plakalar, bir Z faktörü> 0.5 göstermek ve bu nedenle de kalite kontrol geçmektedir.
Şekil 5. SiRNA kütüphanenin dağılımını gösteren Grafik. Gelen yüzde aktivasyonuna neden üçlü ubiquitome SiRNA ekranından siRNA'ların frekansı gösteren Grafik. Alçak ve yüksek kontrolleri sırasıyla% 0 ve% 100 olarak ayarlanır. SiRNA'lar çoğunluğu hücresel fenotipi üzerinde hiçbir etkisi yoktur ve böylece siRNA kütüphane, yüksek ve düşük kontrol arasında eşit olarak dağıtılır. SiRNA'lar küçük bir kısmı artış ve azalma tepki ve bu nedenle yolun potansiyel yeni regülatörleri temsil etmek için gözlenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Memeli hücrelerinde genom siRNA ekranların kullanılması ayrı biyolojik yollar ait yeni regülatörleri belirlenmesinde çok değerli olduğu kanıtlanmıştır. Burada, hipoksiye HIF1A aracılı hücresel tepkinin regülatörleri belirlemek için bir hedef ubiquitome siRNA ekranın kullanımını tarif etmişlerdir. Genellikle, daha ucuz, daha hızlı, daha kolay yönetmek için ve sadece araştırmacılar 7, 10, 11 ilgilendikleri yolu bileşenleri raporu olarak hedeflenen ekranlar giderek daha çekici hale gelmektedir.
Bu temel hücre raportör taraması için uygun olduğundan emin olmak için, tahlil geliştirme aşamasında içine büyük bir çaba için kritik olduğunu ve tekrarlanabilirlik ve düşük değişkenlik elde edilebilir. Bu kütüphane düzenleyiciler düşecek, içinde ayrılık bir pencere oluşturmak için güçlü bir pozitif ve negatif kontrolleri seçmek için de önemlidir. Buna ek olarak, bunların her bir deney plakası bir iç kontrol olarak harekettek plakalı bir sorunların hızlı tespit edilmesi için izin ekran.
Yüksek verimli tarama teknikleri de yaygın bir problem, iç gözeneklere plaka nisbetle dış kuyularında nem yerel bir fark neden olabilir levha kenar etkilerin oluşumu vardır. Yerinde uygun kontrolleri olan ve plaka çıktı bir ısı haritası oluşturarak bu sorunu tanımlamak için yardımcı olabilir. Biz, kenar etkileri levhaların tabanında nemli doku kağıdı kullanılarak, ve daha az inkübatör içindeki her plakanın mikro yapmak için plâkalar istifi üzerinde bir sert, şeffaf bir plastik torba yerleştirme aşılabilir bulduk.
SiRNA tarama bir sınırlama yanlış pozitif ve yanlış negatif varlığıdır. Yanlış negatif yetersiz karşılık gelen mRNA devirme ya da yeterince hareket üretmek için kalıntı mRNA yeteneği de dahil olmak üzere bir dizi faktöre oluşabilirverimli bir işlevi gerçekleştirmek için protein ive. Onlar bir araştırmacı aslında söz konusu yolu yöneten değil bir hit takip önemli bir zaman yatırım neden olabilir gibi yanlış-pozitif, daha sorunlu. Yanlış-pozitif SiRNA yoluyla hedef dışı etkileri de dahil bir dizi mekanizma yoluyla oluşturulabilir. SiRNA söz konusu aşağı sadece mRNA darbelere ama gerçek yol düzenleyiciler, 12, 13 vardır, diğer çok tanımlanmamış hedefler. Bir kısım yaklaşımlar, yaygın olarak gözlenen fenotipin vurma gerçek bir sonucu olduğunu kullanılmış ve onay olarak kabul edilir budur Söz 14'te, hedef genin aşağı. Örneğin, hedef dışı etkileri problem dört, aynı hedef dışı bir etkiye sahip başlangıç havuzundan birden fazla bireysel siRNA olasılığı azaltılır, böylece üçüncü tarama, kısmen aşılabilir. Buna ek olarak, başarılı bir şekilde siRNA dayanıklı ile kurtarma deneylerhit ilgili cDNAlar da hedef dışı etkileri ekarte edecek. Bu tek başına, bu yaklaşım, örneğin, dışsal olarak aşın protein zorunlu nedeniyle ilgili kompleksleri değiştirilmiş stokiyometrisi için endojen muadili aynı etki, vs post-translasyonel modifikasyonlar tedirgin olmaz, uyarılar olmadan olmadığı not edilmelidir doğrulamayı vurmak için alternatif bir yaklaşım Bu nedenle oluşturmak veya nakavt kazanmak veya knock-in itibaren tekabül eden hücre çizgileri ve bu hücre çizgileri siRNA demonte ile aynı fenotip göstermeyen olmadığını belirlemektir. Böylece, siRNA tarama sınırlamaları dikkatli deneysel takibi ile aşılabilir. Ayrıca, çok potansiyel yanlış pozitif belirlenmesi ile ilgili sorunlar daha ağır basar inceleme altında yolların gerçek düzenleyiciler tarafsız tanımlama.
Özetle, bir hedef "ubiquitome" SiRNA kütüphanesi ile siRNA tarama bir powerf olduğunuubikitin yeni üyeleri ve farklı biyolojik yollarını düzenlemeye ubikitin benzeri değiştiriciler tespit etmek ul yöntemi. Raportör etkinliğinin güçlü bir-okuma olup burada açıklanan protokol herhangi bir biyolojik probleme uygulanabilir. Yüksek güven nihai liste ekranından vurur her hit söz yolu yöneten nasıl mekanistik temeli kurmak için yerden başlangıç noktasını temsil eder. Sonuçta, bu ubikuitin ve ubikuitin gibi modifiye farklı biyolojik yolları düzenleyen nasıl artan bilgi katacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Wellcome Trust, GlaxoSmithKline (GSK) ve Hücre Sinyalizasyon için İskoç Enstitüsü (MRC Protein fosforilasyonu ve Ubiquitylation birimin parçası) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
References
- Hochstrasser, M.
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).
- Siomi, H., Siomi, M. C. On the road to reading the RNA-interference code. Nature. 457, 396-404 (2009).
- Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 30, 393-402 (2008).
- Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH. Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).
- Bhinder, B., Djaballah, H. A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the "H Score" for hit nomination & gene prioritization. Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).
- Bett, J. S., et al. The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability. Biochem J. 451, 185-194 (2013).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Stagg, H. R., et al. The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER. J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).
- Zhang, Y., et al. RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling. Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).
- Jackson, A. L., et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Birmingham, A., et al. 3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods. 3, 199-204 (2006).
