siRNA Screening för att identifiera Ubiquitin och Ubiquitin-liknande system Regulatorer av biologiska banor i odlade däggdjursceller

Summary

Här beskriver vi en metod för att utföra en riktad siRNA "ubiquitome" skärmen för att identifiera nya ubikitin och ubiquitin-liknande regulatorer av HIF1A förmedlade cellulära svaret på hypoxi. Detta kan anpassas till varje biologisk reaktionsväg där en robust läsning av reporteraktivitet är tillgänglig.

Abstract

Post-translationell modifiering av proteiner med ubiquitin och ubiquitin-liknande molekyler (UBLs) framstår som en dynamisk mobilnät signalering som reglerar olika biologiska banor inklusive hypoxi svar proteostasis, DNA-skador svar och transkription. För att bättre förstå hur UBLs reglerar vägar relevanta för mänskliga sjukdomar, har vi sammanställt en mänsklig siRNA "ubiquitome" bibliotek som består av 1,186 siRNA duplex pooler riktar alla kända och förutsedda komponenter i UBL systemet vägar. Detta bibliotek kan screenas mot ett antal cellinjer som uttrycker reportrar med olika biologiska reaktionsvägar för att bestämma vilka Ubl komponenter fungerar som positiva eller negativa regulatorer av vägen i fråga. Här beskriver vi ett protokoll som använder detta bibliotek för att identifiera ubiquitome-regulatorer av HIF1A förmedlade cellulära svaret på hypoxi med användning av en transkriptionsbaserad luciferas-reporter. En initial analys utvecklingsstadietutförs för att fastställa lämpliga screeningparametrar för cellinje innan du utför skärmen i tre stadier: primär, sekundär och tertiär / deconvolution screening. Användningen av riktade över hela bibliotek genom siRNA blir alltmer populärt eftersom det ger fördelen att rapportera endast om medlemmar av vägen med vilken utredarna är mest intresserade. Trots inneboende begränsningar av siRNA screening, särskilt falskt positiva som orsakas av siRNA ej åsyftade effekter, identifiering av äkta nya regulatorer av banorna i fråga uppväger dessa brister, som kan övervinnas genom att utföra en serie av noggrant genomförs kontrollexperiment.

Introduction

Modifiering av proteiner med ubiquitin och ubiquitin-liknande molekyler (UBLs) representerar en expansiv biokemiska system som reglerar olika biologiska vägar och stressreaktioner. Den kovalenta bindningen av UBLs till sina målproteiner kan ha olika utfall reglerar stabilitet, lokalisering, funktion eller interactome av substratet ^1. De enzymatiska steg bakom UBL modifiering fastställdes första gången för ubiquitin, och nu fungerar som ett paradigm för modifiering med de flesta UBLs, inklusive SUMO, NEDD8, ISG15 och FAT10. För modifiering inträffa, är karboxylatgruppen i BV diglycin motivet först aktiveras av en E1 aktiverande enzym för att bilda en hög energi tiol som överförs till den aktiva plats cystein av en E2 konjugera enzym. Den E2 interagerar sedan med ett substrat-bundet E3 ligas att medla överföring i BV på (oftast) ett mål lysinenhet skapa en förgrenad kedja (isopeptide) länk ². Successiva rundor av modifiering kan förekomma för att bygga isopeptide kedjor på substratet, vilket för ubikitin kan ske genom någon av dess sju lysiner eller via dess N-terminal metionin för att skapa linjära ubiquitin kedjor. Dessa modifieringar bildar diskreta topologier med olika syften såsom att skapa nya interaktions motiv och inriktning proteiner för nedbrytning före UBL borttagning av specialiserade proteaser. I fallet med ubikvitin finns två E1 enzymer, 30-40 E2 konjugera enzymer, åtminstone 600 E3-ligaser och cirka 100 deubiquitylating enzymer (DUBS). Även om banorna är mindre expansiv för de andra 10 eller så UBLs, ger den totala ubiquitome komplexitet enorm mångfald i den biologiska utfallet av en viss UBL modifiering. Men medan stora framsteg inom UBL biologi har gjorts, de exakta cellulära roller de flesta av dessa ubiquitome komponenter förblir okända.

Användningen av korta interfering ribonukleinsyra (siRNA) har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg i omvänd genetik på grund av möjligheten av siRNA att särskilt inrikta cellulära mRNA för destruktion, vilket gör rollen av enskilda gener som skall undersökas i olika biologiska sammanhang ^3. Hela genom skärmar har använts för att identifiera och validera nya regulatorer av många cellulära processer, och har skapat en uppsjö av användbara data tillgängliga för breda vetenskapliga kretsar. Men medan hela genom skärmar har visat sig extremt användbart, är riktade skärmar blir allt populärare eftersom de är billigare, snabbare, innebär mindre hantering och rapporten uppgifter endast om medlemmar i genomet där utredaren är mest intresserade. Därför, för att bättre förstå vilka cellulära processer ubl familje komponenter är involverade i, har vi sammanställt en människa siRNA bibliotek riktar alla kända och förutsedda komponenter i ubiquitome. Detta inkluderar UBLs, E1 aktiverande enzymer, E2 konjugerandeenzymer, E3-ligaser, ubiquitin-bindande domän (UBD)-innehållande proteiner och dubbar. Detta bibliotek kan användas för skydd mot ett brett spektrum av reporter cellinjer av distinkta biologiska problem, vilket gör det ideal identifiering av nya Ubl komponenter för dessa vägar.

Följande protokoll beskriver hur man utför en rigorös riktade siRNA ubiquitome skärmen för att identifiera nya regulatorer av HIF1A beroende svar på hypoxi. Vid normal syrespänning, är HIF1A föremål för prolyl hydroxylering som får den att kännas igen och riktade för nedbrytning av von Hippel Lindau (VHL) E3 ligas komplex ^4. Hypoxi inhiberar prolyl hydroxylering som leder till en stabilisering av HIF1A och dess efterföljande bindning till hypoxisvarselement (HRES) för att driva genuttryck. Här beskriver vi en skärm med användning av U20S osteosarkomceller stabilt uttrycker luciferas från eldfluga under kontroll av tre tandemkopior av Hypoxia Response Element (U20S-HRE celler) ^5. Detta protokoll kan anpassas för varje biologisk bana om en robust avläsning av reporter aktivitet är möjligt och kan kopplas med lämpliga positiva och negativa kontroller.

Protocol

1. Assay Development Stage

Anm: före initiering av siRNA skärmen är en analys utvecklingsstadiet kritisk att fastställa viktiga parametrar för att screena med reportern cellinjen. Det är viktigt att investera betydande insats i detta skede eftersom detta kommer att ligga till grund för framtida framgång på skärmen.

1. För att karakterisera den hypoxi-responsen i U20S-HRE reporter cellinje växa 2 x 75 cm ² kolvar av U20S-HRE celler till 80-90% konfluens i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% FBS.
2. Aspirera medium från en kolv med celler tvättas två gånger med 10 ml PBS och lösgöra cellerna genom tillsats av 2 ml 0,05% trypsin-EDTA-lösning och inkubering vid 37 ° C under 5 min. Återsuspendera cellerna i 8 ml DMEM 10% FBS och pipett upp och ned för att skapa en homogen cellsuspension.
3. Pipettera 20 ìl av suspensionen till en cellräkning kammare, i två exemplar, och sätt in i kammaren i en automatiserad cell counter. Klicka på "Visa bild" på cellräknare programvara och se till att cellerna är i fokus. Klicka på "Count" och notera celltätheten. Upprepa detta för den andra dubbletter och beräkna den genomsnittliga celltäthet. Späd cellerna med DMEM 10% FBS till en koncentration av 60000 celler / ml.
4. Med hjälp av en flerkanalig pipett, tillsätt 100 l (6000 celler) av de utspädda cellerna till samma tre kolumner (t.ex. A5-H5, A6-H6 och A7-H7) av 5 sterila vita väggar 96-brunnars analysplattor, och överföring till en befuktad 37 ° C inkubator vid 5% _CO2 över natten. Notera: dessa plattor kommer att användas för att bestämma den hypoxi-beroende luciferas-utgång för ett intervall av hypoxiexponeringar: 0 timmar, 2 timmar, 6 timmar, 10 timmar och 24 timmar.
5. Vid slutet av följande dag, notera tiden och tillsätt 24 tim hypoxi plattan för att ställa in hypoxi arbetsstation till 1% syre. Följande morgon, beräkna tiden 10 timmar, 6 timmar och 2 timmar innan den 24 hr plattan beror på att tas bort frOMs hypoxi arbetsstation. Vid dessa tillfällen, tillsätt 10 timmar, 6 timmar och 2 hr plattor till hypoxi arbetsstation.
6. Bered 30 ml av 2x kombinerad luciferas lys / assay-buffert (50 mM Tris-fosfat, pH 7,8, 16 mM _MgCl2, 2 mM DTT, 2% Triton-X-100, 30% glycerol, 1 mM ATP, 1% BSA, 0,25 mM luciferin och 8 ^ M Na ₄ P ₂ O _7). Notera: lägg komponenterna i angiven ordning och låta BSA minst 30 min för att lösa upp före tillsättning av luciferin och Na ₄ P ₂ O _7.
7. Ta bort alla plattor från hypoxi arbetsstation vid den lämpliga tidpunkten. Tillsätt 100 l av 2x luciferas lys / analysbuffert till lämpliga brunnar i analysplattan och täck med tydliga film. Skaka plattorna på en plattskakanordning under 10 minuter vid 500 rpm för att grundligt lysera cellerna.
8. Överför plattstapeln till en automatiserad 96-brunnsplatta luminometer rack. Under menyn "Protokoll", välj "abs 595" och markera alla wells att läsas på skärmen tallrik kartan under menyn "bra val". Klicka på "Kör" för att mäta ljusflöde av varje brunn sedan beräkna medelvärdet för varje platta. Beräkna hypoxi beroende fold-ökning med reporter aktivitet genom att dividera medelvärdet för varje hypoxi platta av medelvärdet av normoxia (0 tim hypoxi) kontrollplatta. OBS: Det är viktigt att observera en robust hypoxi-beroende luciferas svar för att vara lämplig för screening. En 5-10 faldig ökning av reporter verksamhet anses vara utmärkt.
9. Skapa en mästare kontrollplatta som innehåller fyra hög kontroll (HIF1A siRNA) replikat (brunnar A1-D1), fyra låg kontroll (FIH1 siRNA) replikerar (brunnar A12-D12), bara fyra buffert kontroll replikat (brunnar E1-H1) och fyra icke-mål siRNA kontroll replikat (E12-H12), där alla siRNA pooler är vid en koncentration av 200 nM. Notera: Höga och låga kontroller fastställs utifrån kända pathway regulatorer som ökar och Decrlätta hypoxi svar respektive. Alternativt kan analysutveckling med hjälp av en underuppsättning av biblioteket användas för att identifiera lämpliga kontroller.
10. Med hjälp av en flerkanalig pipett, överför 10 l av varje kontroll siRNA till en steril vit muromgärdad analysplatta. Förbered transfektion mix av 0,1 pl transfektion reagens i 10 fil reducerat serummedium (1:100) per brunn, och överföra 10 ìl av transfektion mix till varje kontroll väl. Pipettera upp och ner en kort stund för att blanda, och låt plattan vila i 20-60 minuter för att tillåta transfektion komplexbildning.
11. Bered en cellsuspension på 75.000 celler / ml med den andra kolven av U20S-HRE celler. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 80 | il (6000 celler) av cellsuspensionen till varje transfektion mix. För över plattan till en fuktig 37 ° C inkubator med 5% _CO2 under 24 timmar, sedan överföra till en hypoxi arbetsstation under ytterligare 24 timmar och utför luciferasanalyser som beskrivs i steg 1,6-1,8.
12. Beräkna Z-faktorn för de höga och låga kontroller med formeln Z = 1 - [3 x (standardavvikelse av hög kontroll + standardavvikelse av låg kontroll) / (medelvärde hög kontroll - medelvärdet av låg kontroll)]. Obs: ett värde på mellan 0,5-1 indikerar en utmärkt analys och bör eftersträvas.

2. Primary Screen

OBS: när dessa grundläggande villkor från analys utvecklingsfasen är på plats, kan den primära skärmen utföras i tre exemplar i 96 väl-platta format med hjälp av följande protokoll.

1. Grow 7 x 75 cm ² kolvar med U20S-HRE celler till 80-90% konfluens i DMEM kompletterat med 10% volym / volym fetalt bovint serum (FCS).
   OBS: Följande steg 2,2-2,13 bör göras på dag 1.
2. Initiera replikera 1 genom att förbereda en mästare kontrollplatta som innehåller 200 l av varje kontroll som beskrivs i steg 1,9 och upptining ut en spädningsserie av siRNA ubiquitome library i minst 30 minuter. Obs: varje brunn innehåller en pool av 4 siRNA samlade i 17 x 96-brunnars plattor med kolumnerna 1 och 12 lämnas tomma för kontroller.
3. I ett laminärt flöde huva, etikett (eller bar-code) 17 sterila vita väggar analysplattor med lock från nummer 1 till 17, vilket motsvarar varje platta av siRNA biblioteks serien.
4. Centrifugera masterstyrplattan och siRNA ubiquitome bibliotek kort (1 min vid 2000 x g) för att säkerställa alla siRNAs ansamlas i botten av brunnen.
5. Använd en automatiserad vätskedispenser till robotically "stämpel" 10 | il av varje kontroll från masterstyrplattan på 17 analysplattor, med användning av samma 96-brunnars spets stack för varje platta.
6. Med användning av en färsk 96-brunnars dricks stacken för var och en av de 17 biblioteksplattorna, överföra 10 fil av varje ubiquitome siRNA till dess motsvarande analysplatta med användning av ett automatiserat vätskedispenser.
7. Förbered 40 ml transfektion reagens för de 17 analysplåtarna med förhållande esblerat i 1.10. OBS: detta inkluderar ytterligare 20 ml för att stå för den "döda volymen" i cellen dispenser. Den "död volym" avser den vätskevolym kontinuerligt närvarande inuti slangen nätverket i cellen dispensern.
8. Använd en automatiserad cell dispenser för att överföra 10 | il av transfektion reagens till varje brunn i 17 analysplattor. Skaka korthet analysplattorna på en skakanordning (1 min vid 500 varv per minut) för att medge grundlig blandning av siRNA och transfektion reagens, sedan lämna stilla vid rumstemperatur under 20-60 min för att tillåta siRNA: transfektionsreagens komplexbildning.
9. Tvätta två 75 cm ² kolvar av U20S-HRE cellerna två gånger med 10 ml PBS och lösgöra med 2 ml trypsin-EDTA vid 37 ° C under 5 min. Lägg till 8 ml DMEM 10% FBS till varje kolv och pipett upp och ned flera gånger för att skapa en homogen cellsuspension. Kombinera celler från båda flaskorna och för över till en steril 50 ml plaströr.
10. Beräkna cellkoncentrationen genom att pipettera20 | il celler i duplikat till en cellräkningskammare och beräkna den genomsnittliga cellkoncentration från två avläsningar av en automatiserad cellräknare såsom beskrivs i steg 1,3.
11. Bered 155 ml av en cellsuspension genom spädning med DMEM 10% FBS till en koncentration av 75.000 celler per ml i en steril plastbehållare. Notera: denna volym är tillräcklig för 17 plåtar och innefattar ytterligare 25 ml för dödvolymen i cellen dispensern.
12. Lägg till en steril magnetomrörare till cellsuspensionen och placera på en omrörare ställa upp inne i laminärt flöde huva för att begränsa cellklumpning. Jämvikta den automatiserade cellen dispenser med cellsuspensionen och ställa in den att dosera 80 l av celler per brunn (6000 celler).
13. Placera varje av de 17 plattorna i sin tur på den automatiserade cell dispenser och dispensera celler. Registrera tiden och stapla plattorna i grupper om 5 sedan placera travar i en fuktig 37 ° C inkubator vid 5% _CO2 under 24 timmar. Anmärkning: den slutliga koncentrationen avsiRNA pool kommer att vara 20 nM i 100 l total volym.
    OBS: Följande steg från 2,14 till 2,15 bör genomföras på Dag 2.
14. Initiera den andra replikera på dag 2, enligt det förfarande som anges i dag 1 för replikat 1 (2,2-2,13).
15. Efter 24 timmar av transfektion, överföringsplattor från replikat 1 i en steril miljö till en hypoxi arbetsstation satt till 1% syre och låt stå i 24 timmar för att inducera HRE reporter.
    OBS: Följande steg från 2,16 till 2,20 bör genomföras på dag 3.
16. Initiera den tredje replikera, enligt det förfarande som beskrivs i dag 1 för replikat 1 (2,2-2,13).
17. Efter 24 timmar av transfektion, överföringsplattor från replikat 2 i en steril miljö till en hypoxi arbetsstation satt till 1% syre och låt stå i 24 timmar för att inducera HRE reporter.
18. Två timmar innan replikera ett plattorna skall kunna avlägsnas från den hypoxi arbetsstation bereda 200 ml av 2x luciferas lys / assay-buffert såsom beskrivits i 1.6. Obs: denna volym icludes ytterligare 20 ml för att säkerställa att buffertbehållaren förblir väl täckta.
19. Ta replikera en analysplattor från hypoxi arbetsstation efter 24 timmar hypoxi exponering och med hjälp av en automatiserad flytande dispenser, tillsätt 100 ìl av 2x luciferas lys / analysbuffert till varje analysplattan och täck med tydliga film.
20. Skaka plattorna på en cell-skakanordning under 10 minuter vid 500 rpm för att grundligt lysera cellerna. Överför varje platta i sin tur till en luminometer plattläsare och spela luminiscens som beskrivs i steg 1,8.
    OBS: Följande steg från 2,21 till 2,22 bör genomföras på Dag 4.
21. Efter 24 timmar av transfektion, överföringsplattor från replikat 3 i en steril miljö till en hypoxi arbetsstation satt till 1% syre och låt stå i 24 timmar för att inducera HRE reporter.
22. Läs replikera 2 plattor genom följande steg från 2,18 till 2,20 används för replikat 1.
    OBS: Följande steg 2.23 bör utföras på Dag 5.
23. Läs likadana 3 plattor genom att följasteg 2,18-2,20 användas för replikat 1.
24. Sammanställ alla 3 replikat av den primära skärmen, och beräkna Z-faktorn för varje platta med hjälp av formeln i 1.12. Obs: om någon platta har en Z-faktor på mindre än 0,5, överväga att upprepa denna platta för att förbättra datakvaliteten.
25. Beräkna variationskoefficient (CV) för den höga och den låga kontroller genom användning av följande formel: 100 x standardavvikelsen för styrning / medelvärde av kontroll. OBS: CV bör vara så låg som möjligt, är det rimligt att förvänta sig 10-15% variation. Om variationen är betydligt högre, överväga att upprepa plattan.
26. Beräkna procent aktivering av varje siRNA per platta med hjälp av följande formel: [(medelvärde av hög kontroll - siRNA poäng) / (medelvärde av hög kontroll - medelvärdet av låg kontroll)] x 100 dessutom beräkna den icke-mål (NT. ) gånger på varje siRNA med hjälp av formeln [Prov data / medelvärde NT]. För både procent aktivering och NT-faldigt, beräkna genomsnittet för de tre replicates och sammanställa värdena.
27. Med hjälp av rådata, beräkna Spearmans rangkorrelationskoefficient (SRCC) för att avgöra hur nära de tre parallella plattor korrelerar med hjälp av formeln:
    
    där r = SRCC; d = skillnad mellan de två talen i varje par av leden och n = antalet par av data. Obs: en god korrelation mellan platt replikat ger värden nära 1 Om ett replikat visar låg SRCC mot de andra 2 plattor, ytterligare utreda och överväga att upprepa att plattan..
28. Bestäm vilka siRNA är av tillräckligt intresse för sekundär screening (upp till 80). Anställa användardefinierade cut off (t.ex. välja alla siRNA som visar mindre än 5% eller över 95% procent aktivering, eller mindre än 0,5 NT-faldigt eller över 1,5 NT-faldig) eller tillämpa bioinformatik eller kunskapsbaserade resonemang för att söka efter grupper av hits som omfattas av samma UBL väg. Notera:normalt, bestämmer en kombination av dessa metoder som siRNA tas i sekundär screening.

3. Sekundär skärm

Obs: en bekräftande sekundär skärm utförs baserat på maximalt 80 siRNA av intresse från den primära skärmen. Detta antal kan enkelt utföras med varje replikat pläterade på en enda 96-brunnsplatta med full kontroll enligt det primära skärmen (se 2.2). Det är mycket användbart för att bekräfta att de tillsynsmyndigheter som identifieras i den primära skärmen reproducerbart framkalla samma fenotyp, och detta kommer att hjälpa till att förfina triagebeslut om vilka träffar bör ske genom att den slutliga tertiära / deconvolution skärm.

1. Odla 1 x 75 cm ^2-kolv av U20S-HRE celler till 80-90% konfluens i DMEM med 10% FBS.
2. Anteckna registreringsnummer och placering av de primära skärm hits, och planera sin nya plats på den sekundära skärmen körsbär plockade mästare tallrik och lämnar pelare 1 ettd 12 gratis för kontroller. Bered referensmasterplåt som i 1,9, men med en total volym av varje styrning av 50 | il.
3. Tina en andra spädningsserie av ubiquitome biblioteket (avsatt för cherry-picking enskilda siRNA pooler) i minst 30 minuter. Centrifugera plattorna kort (1 min vid 2000 xg) sedan 50 l av den sekundära skärmen siRNA till deras nya platta platser på körsbär plockade huvudplatta.
4. Utför den sekundära skärmen med samma grundläggande protokoll som beskrivs för den primära skärmen med följande ändringar: (a) kör alla tre replikat på samma dag i en analysplatta per replikat och (b) justera volymer av reagens i enlighet därmed.

4. Tertiär / Deconvolution Screen

OBS: tertiär eller deconvolution screening utförs på högst 20 siRNA från den sekundära skärmen. Detta steg är att undersöka effekten av knockdown använder varje enskild siRNA från den ursprungliga bajsll fyra. Normalt bör minst två individuella siRNA duplex från varje pool illegal samma fenotyp att ha en rimlig grad av förtroende för att den observerade fenotypen inte beror på siRNA ej åsyftade effekter. För att ytterligare öka förtroendet i detta skede, kan ytterligare enskilda siRNA duplex riktade genen i fråga utformas och testas för sin förmåga att framkalla den givna fenotypen. Resultaten från dessa experiment kan sedan användas för att beräkna H-poäng, där H = 0,6 eller över (dvs. där minst 3 av 5 individuella siRNA framkalla fenotypen) anses godtagbart ^6.

1. Odla en 75 cm ^2-kolv av U20S-HRE celler till 80-90% konfluens i DMEM med 10% FBS.
2. Skapa en platta kartan för den tertiära skärm genom att planera placeringen av de fyra individuella siRNA-duplex av varje träff på den tertiära skärm masterplåt som lämnar kolonnerna 1 och 12 fria för kontroller. Bered referenshuvudplattan som i 1.9 men med en totalvolymen för varje kontroll av 50 pl.
3. Tina avfaltning / individ siRNA plattorna och tillsätt 50 pl av de individuella siRNAs (200 nM) i varje brunn i den tertiära skärm masterplåt enligt tallriks map (4,2) för att medge tre x 10 | il replikat och en bekväm 20 pl överskott .
4. Utför tertiära skärmen med samma grundläggande protokoll som beskrivs för den primära skärmen med följande ändringar: (a) kör alla tre replikat på samma dag i en analysplatta per replikat och (b) justera volymer av reagens i enlighet därmed

OBS: Helst tröskeln för enskilda siRNA duplex bör fastställas på samma stringens cut-off som för poolen. Dock kan det vara acceptabelt att koppla tröskeln med 10-20% för enskilda siRNA, särskilt när minst en annan duplex faller inom det inställda gränsvärdet. Det är värt med tanke på att den enskilda effekten av siRNA kan vara mindre än den hospoolen, och omvänt, i vissa fall enskilda siRNA kan vara starkare effekt på cellulär fenotyp isolerat än när den finns i poolen (även om koncentrationen redovisas).

Representative Results

Före screening är hypoxi-lyhördhet U20S-HRE celler etablerade. U20S-HRE celler uttrycker en reporter konstruktion bestående av eldflugeluciferas smält nedströms tre tandemkopior av hypoxi svarselement, som är bundna av HIF1A/HIF1B heterodimeren vid exponering för hypoxi (Figur 1A). Cellerna placeras i en hypoxi arbetsstation för en rad gånger för att fastställa vilken hypoxi exponering ger det mest effektiva insatser för screening. U20S celler uttrycker låga nivåer av HIF2A, därför luciferas läsningar är till stor del beroende av hypoxi-medierad HIF1A stabilisering ^7. Exponering av U20S-HRE celler till hypoxi för 0 tim, 2 tim, 4 timmar, 6 timmar och 24 tim ger en hypoxi-beroende induktion av luciferasaktivitet (Figur 1B). Exponering av U20S-HRE celler till hypoxi för 24 h resulterar i en ~ 10-faldig induktion av aktivitet (Figur 1B), därför detta är enn utmärkt respons för siRNA screening.

Att etablera lämpliga höga och låga kontroller, siRNA till HIF1A och FIH1 används för att vända transfektera U20S-HRE celler. Celler transfekteras med kontrollerna under 24 timmar och exponerades för hypoxi under ytterligare 24 h före luciferasanalyser utförs. HIF1A siRNA minskar hypoxi signalen till ca 10% medan FIH1 siRNA ökar hypoxi signalen till ca 170% i förhållande till icke-mål-siRNA (Figur 2). Dessa kontroller leda till en genomsnittlig Z faktor 0,8, vilket är en utmärkt poäng vid screening. De screeningparametrar har nu framgångsrikt etablerat en robust skärm.

Den primära skärmen utförs i 96-brunnar format med arbetsflödet visas i figur 3. Styr-och biblioteks siRNA är stämplade på analysplattor (Figur 3A), och U20S-HRE celler omvänt transfekterade då jagncubated vid 37 ° C under 24 timmar. Analysplattor exponeras sedan för hypoxi under 24 timmar (Figur 3B) innan luciferasanalyser utförs och data analyseras (figur 3C). Kvalitetskontroll analys av skärmen innefattar bestämning av Z-faktorn för varje platta, där en Z-faktor över 0,5 är önskvärt ^{8, 9.} The Z Faktorn beräknas för varje platta i tre exemplar primära screeningen med användning av formeln i figur 4A. Z-faktorer för varje plattan framkallas med användning av ett punktdiagram, där det kan ses varje platta har ett Z faktor större än 0,5 (fig 4B). Beräkning av Z-faktorn är viktig eftersom den rapporterar om hur bra ett separations fönster finns mellan kontrollerna och kan belysa eventuella problem med individuell skärm analysplattor. Meritförteckning för de höga och låga kontroller beräknas också, och medelvärdena är 5,95% + / - 0,4 och 8,04% + / - 1,2 respektive. Den primära skärmenresulterar i en fördelning av siRNA duplex bildar ett kontinuum mellan de låga och höga kontrollerna. Vanligtvis kommer det att finnas ungefär lika antal positiva och negativa regulatorer, med majoriteten av siRNA som inte har någon effekt på reportern (figur 5). Regulatorer av intresse tas genom till sekundärt sedan tertiär screening för att upprätta en förteckning över hög förtroenderegulatorer för uppföljande analys och validering.

Figur 1. Hypoxi exponering framkallar U20S-HRE luciferas reporter. (A) Schematisk representerar hypoxi reporterkonstruktionen i U20S-HRE celler som används för siRNA screening. Tre tandemkopior av den hypoxi-svarselement (HRE) är bundna av HIF1A/HIF1B heterodimeren för att driva eXpression av eldfluga luciferas. (B) Ökad exponering av U20S-HRE celler till 2 timmar, 6 timmar, 10 timmar och 24 timmar till hypoxi leder till ökande mängder av reporter luciferasaktivitet. 24 tim hypoxi exponering resulterar i ~ 10-faldig ökning av luciferasaktivitet jämfört med 0 tim kontroll (normoxia). Skala stapel avser standardavvikelsen för medelvärdet.

Figur 2. Etablera höga och låga siRNA kontroller för screening. U20S-HRE celler omvänt transfekterade med siRNA till HIF1A (låg kontroll) och FIH1 (hög kontroll) minskning respektive öka svaret på 24 hr hypoxiexponering. Dessa kontroller ger en Z-faktor av 0,8, vilket anses vara en utmärkt Poängen för screening. Effekten av icke-mål (NT) siRNA visas förjämförelse. Felstaplar representerar standardfel av medelvärdet.

Figur 3. Screening arbetsflöde för att identifiera regulatorer av HIF1A hypoxi svar. (A) Arrangemang av 96 brunnar för siRNA screening. Kontroll siRNA stämplas på utsidan kolumner som anges och ubiquitome siRNA-biblioteket är stämplat på de inre kolonnerna, spridda över 17 plattor. U20S-HRE celler omvänd-transfekterade och inkuberades vid normoxi för 24 timmar. (B) Staplar av analysplattor överförs i en steril miljö till en hypoxi arbetsstation satt till 1% syrgas under 24 timmar. (C) Plattorna avlägsnades från hypoxi arbetsstation och luciferasaktivitet analyser utförs på alla analysplattor. Luminescence ärinspelad på en luminometer och dataanalys utförts för att fastställa reportern aktiviteten av celler transfekterade med varje bibliotek siRNA.

Kvalitetskontroll Figur 4. Utförs genom beräkning av Z faktor på varje platta. (A) Z-faktorn för varje platta beräknas med användning av den formel som ges, där S representerar standardavvikelsen, m representerar medelvärdet, s. den positiva kontrollen och n den negativa kontrollen. (B) Punktdiagram som visar den beräknade Z-faktor av varje platta från tre replikat av ubiquitome skärmen. En cut-off på 0,5 tillämpas, och i detta fall alla plåtar visa ett Z faktor> 0,5 och därmed passera kvalitetskontrollen.

Figur 5. Diagram som visar fördelningen av siRNA-biblioteket. Diagram som visar frekvensen av siRNA från triplikat ubiquitome siRNA skärm som resulterar i den motsvarande procent aktivering. Låga och höga kontroller är satt till 0% och 100% respektive. SiRNA bibliotek distribueras jämnt mellan de höga och låga kontroll, varvid majoriteten av siRNAs har ingen effekt på den cellulära fenotypen. En liten andel av siRNA observeras att öka och minska det svar, och därför representerar de potentiella nya regulatorer av reaktionsvägen.

Discussion

Användningen av genomet hela siRNA skärmar i däggdjursceller har visat sig vara mycket värdefull för att identifiera nya regulatorer av olika biologiska banor. Här har vi beskrivit användningen av en riktad ubiquitome siRNA skärmen för att identifiera regulatorer av HIF1A förmedlade cellulära svaret på hypoxi. Riktade skärmarna blir alltmer attraktiva som de är i allmänhet billigare, snabbare, enklare att hantera och rapportera endast om de pathway komponenter där utredarna är intresserade ^{7, 10, 11.}

Det är viktigt att sätta en stor insats i analysutvecklingsstadiet för att säkerställa en grundcell reportern är lämplig för screening, och kan uppnås att reproducerbarhet och låg variabilitet. Det är också viktigt att välja robusta positiva och negativa kontroller för att skapa ett fönster av separation inom vilken biblioteket regulatorer kommer att falla. Dessutom är dessa fungera som en intern kontroll i varje analysplatta avskärmen gör det möjligt att snabbt identifiera eventuella problem med enskilda plattor.

Ett vanligt problem i high throughput screening är förekomsten av platta kanteffekter, som kan orsakas av en lokal skillnad i fuktighet vid utanför brunnarna i plattan i förhållande till de inre brunnarna. Att ha lämpliga kontroller på plats och skapar en värmekarta över plattan utgång kan hjälpa till att identifiera problemet. Vi har funnit att kanteffekter kan övervinnas med hjälp av fuktigt mjukpapper vid basen av plattorna, och placera en styv, genomskinlig plastpåse över trave tallrikar för att göra mikromiljön för varje platta inne i inkubatorn jämnare.

En begränsning av siRNA screening är förekomsten av falskt positiva och falskt negativa. Falska negativa resultat kan förekomma på grund av ett antal faktorer, inklusive otillräcklig knockdown av den motsvarande mRNA eller förmågan hos resterande mRNA för att producera tillräckligt aktive protein för att effektivt utföra sin funktion. Falskt positiva är mer problematiska, eftersom de kan orsaka en utredare att investera mycket tid att följa upp en träff som inte kan faktiskt styra vägen i fråga. Falskt positiva kan genereras genom ett antal mekanismer, inklusive via siRNA ej åsyftade effekter. Det är där siRNA slår ner inte bara mRNA i fråga utan även andra, oidentifierade mål som är de sanna pathway regulatorer ^{12, 13.} Ett antal metoder används ofta och accepteras som en bekräftelse på att den observerade fenotypen är ett riktigt resultat av att knacka ner målgenen i fråga ^14. Till exempel kan problemet med ej åsyftade effekter övervinnas delvis genom tertiär screening, varigenom sannolikheten för att mer än en individ siRNA från utgångspoolen av fyra med samma off-target effekt minskas. Dessutom framgångsrikt utföra räddningsförsök med siRNA-resistentacDNA motsvarar träffen kommer också utesluta ej åsyftade effekter. Det bör påpekas att detta tillvägagångssätt i sig självt inte är utan förbehåll, t.ex. exogent överuttryckta proteiner inte nödvändigtvis kommer att fungera identiskt med endogen motpart pga förändrad stökiometrin för de relevanta komplex eller störs posttranslationella modifikationer etc. En alternativ metod för att träffa validering därför är att skapa eller förvärva knockout eller knock-i cellinjer som motsvarar de träffar, och avgöra om dessa cellinjer visar samma fenotyp som siRNA knockdown. Sålunda kan begränsningar av siRNA screening övervinnas med noggrann experimentell uppföljning. Dessutom objektiv identifiering av äkta modifierare av banorna granskade långt större än de problem som förknippas med potentiellt identifiera falska positiva.

Sammanfattningsvis är siRNA screening med en riktad "ubiquitome" siRNA biblioteket en powerful metod för att identifiera nya medlemmar i ubiquitin och ubiquitin-liknande modifierare reglerar olika biologiska banor. Det protokoll som beskrivs här kan tillämpas på alla biologiska problem om det är en robust avläsning av reporteraktivitet. Den slutliga listan över höga förtroende träffar från skärmen representerar startpunkten varifrån att fastställa den mekanistiska grunden för hur varje träff styr vägen i fråga. I slutändan kommer detta att lägga till den växande kunskapen om hur ubiquitin och ubiquitin-liknande modifierare reglerar olika biologiska banor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated Liquid Dispenser	Fluid-X	XPP-721	http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html
White Walled Assay Plate	Greiner Bio One	655083	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/
Clear Plate Film	Perkin Elmer	1450-461	http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461
siRNA library	Thermo Scientific	On-Target Plus	http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/
Transfection reagent	Invitrogen	Lipofectamine RNAimax	http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html
Reduced Serum Medium	Invitrogen	Optimem	http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product
DMEM	Invitrogen	41965-039	http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#
FBS	Invitrogen	16000-044	https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#
Tryspin-EDTA	Invitrogen	25300-054	https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#