Introduction
أن تكون قادرة على تحديد وقياس مستويات البروتين التعبير هو أسلوب القياسية لالحيواني والتجارب القائمة على الخلية. ومع ذلك، على الرغم من الفائدة في وقت مبكر الجنينية تطوير صمام القلب، وتقييم البروتين التعبير في هذا النسيج محددة خلال تطوير يقتصر حاليا على المناعية في كل من الفرخ والفأر 1،2 طويل الأمد. جزء من صعوبة تحديد كمية البروتين التعبير في صمامات تطوير معظم الكائنات نموذج (مثل الفرخ والفأر) هو صغر حجم الصمامات، مما يحد من كمية البروتين التي يمكن الحصول عليها. وهكذا، على التحليلات الكمية، يعتمد الباحثون عادة على استخراج الحمض النووي الريبي والتضخيم PCR الكمي لاحقة أو تحليل ميكروأري 2-5. ومع ذلك، RNA والبروتين مستويات التعبير ليست المترابطة 6 بالكامل، بحيث يمكن التركيز على التعبير RNA لا توفر حساب دقيق للتغيرات العديدة التي تحدث في أي إشارات معينةالمسار في أوقات مختلفة خلال التطورات. واستنادا إلى هذا الحد في المنهجية المتاحة حاليا، وكان الهدف من هذا الإجراء لوضع بروتوكول للحصول موثوق كميات كافية من البروتين من الفأر الجنينية المناطق صمام القلب النامية من أجل التحليل الكمي للتغيرات التي تحدث في مختلف مسارات الإشارات التي تعتبر مهمة في نضوج هذا النسيج.
وبالفعل تشريح الصمامات عادة من الفئران الجنينية لعزل الحمض النووي الريبي وتحليل الجينات لاحق التعبير 2-5. ولكن هذه الدراسات اقتصرت على استخدام التعبير الجيني باعتبارها من قراءة إشارات من تفعيل المسار، والتي لا تسمح للكشف عن الكشف عن تعديلات البروتين بعد متعدية التي قد تؤثر إشارات المصب. باستخدام تقنيات العزل RNA كنقطة انطلاق، بدأنا مع تشريح المناطق ذات الأهمية. لأن مصلحتنا تم الكشف عن البروتينات فسفرته التي كانت مؤشرا يدل باتالنشاط hway خلال فترة محددة من تطوير الصمام الأورطي (E13.5-14.5)، أجرينا كل تشريح خالية من الفوسفات في تريس العازلة وجمع الصمامات في تحلل العازلة على أساس تريس، مع الفوسفاتيز ومثبطات الأنزيم البروتيني. في حالتنا هذه، تم جمع المناطق صمام الأبهري فقط، ولكن يمكن بسهولة الحصول عليها المنطقة صمام رئوي في نفس الوقت. كانت المناطق صمام ثم متجانسة وجنبا إلى جنب مع عينة العازلة التي تستخدم حاليا لدراسة التعبير البروتين في صمامات القلب الكبار 7. باستخدام وحدات التخزين عينة صغيرة (على سبيل المثال، 2 ميكرولتر) وتجميع صمام المناطق من أجنة بنفس النمط الجيني، تمكنا من الكشف عن بروتينات فسفرته وnonphosphorylated في اليوم الجنينية 13.5 8. لأن المناطق صمام يمكن تجميدها وتخزينها في المخزن تحلل، يمكن التنميط الجيني لأجنة إذا لزم الأمر قبل تجميع.
هذه التقنية يوسع مجموعة من الأدوات المتوفرة لتقييم signalin خليةز مسارات خلال تطوير وتقدم مجاملة الكمية لالمناعية، وتحديدا لصمامات القلب النامية. وينبغي أن يكون هذا الأسلوب مفيدا ليس فقط لأطباء القلب التنموية ولكن أيضا لجميع علماء البيولوجيا التطورية الذين يعملون مع الأجنة مرحلة مبكرة يرغبون في المناطق التي تحتوي على الأنسجة محدودة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة كارولينا الشمالية في تشابل هيل.
1. المكوس الصمام الأبهري
- باستخدام تقنية القتل الرحيم المعتمدة للمرحلة الجنينية من الفائدة، الموت ببطء ماوس حاملا مع الجراء في اليوم الجنينية المطلوب (E) للتنمية.
- استخدام الايثانول 70٪ لتعقيم البطن للإناث الحوامل. رفع الجلد وعضلات أسفل البطن وحتى بعيدا عن الأعضاء الداخلية، وتشريح تجويف أسفل البطن مفتوحة الأنثى للسماح بالوصول إلى قرن الرحم.
- لاسترداد قرن الرحم، عنق الرحم عقد مع ملقط وقطع بعناية الذيلية إلى ملقط. رفع قرن الرحم، وقطع أي نوع من الأنسجة الضامة التي تحافظ على القرن في مكان، وإتمام إزالة بقطع تقاطع قرن الرحم مع قناة البيض.
- وضع قرن الرحم تشريح في طبق بتري تحتوي على عمودد 0.1 M تريس العازلة (درجة الحموضة 7.6) وشطف حسب الحاجة. ثم، وقطع قرن الرحم مفتوح طول الحكمة لفضح الحويصلات الجنينية.
- للكشف عن الجنين، وقطع فتح الكيس الجنيني عند تقاطع المشيمة والجنين وقطع الأوعية الدموية السرية لتحرير الجنين. وضع الجنين تشريح في طبق بيتري الثاني مع بارد 0.1 M تريس العازلة. يعود أول طبق بيتري مع باقي الأجنة لundissected الجليد حتى جاهزة للجنين المقبل.
- لتحسين فرص الحصول جدار الصدر داخل الجنين، قطع رأس الجنين. إذا التنميط الجيني ضروري، وإزالة وحفظ قطعة النسيج إضافية في أنبوب إيبندورف وضعت على الجليد.
- وضع الجنين على ظهرها، وقطع جدار الصدر عموديا على طول الجانب من القفص الصدري، بالقرب من forelimb، وأفقيا فوق الحجاب الحاجز لتصور القلب. ثم فتح جدار الصدر لفضح القلب.
- باستخدام ملقط لنرفع عاليا على طول الأوعية الدموية الكبرى، ورفع القلب باستخدام ملقط وقطع الأوعية أدناه. ون، وقطع فوق ملقط لتحرير القلب. إذا بقيت الأوعية الرئوية غير المصقول، قد تتم إزالة الرئتين مع القلب ويجب إزالتها قبل المتابعة.
- قطع وإزالة الشريان الرئوي فوق مستوى صمام. في المراحل الجنينية الموصوفة هنا، الشريان الرئوي هو معتم قليلا، والذي يساعد في تمييز لها من منطقة صمام. قطع أسفل صمام الرئوي، وتجنب عضلة القلب البطيني trabeculated وجمع كما هو موضح في الخطوة 1.10 إذا هذه المنطقة هي أيضا من الفائدة. وهنا في الخطوة التالية، استخدام العمل الشعري لرسم عازلة تريس الزائدة بعيدا عن منطقة الفائدة قبل جمع في تحلل العازلة.
- إزالة بعناية الأبهر القاصي إلى الصمام الأبهري، وذلك فوق مستوى صمام. مثل الشريان الرئوي، لا يزال الشريان الأورطي مبهمة قليلا في هذه المراحل الجنينية، والمساعدة في زواله. مجرد قطع تحت الصمام الأبهري، ومرة أخرى تجنب عضلة القلب البطيني trabeculated، ونقلصمام باستخدام ملقط لأنبوب إيبندورف مع 2 ميكرولتر تحلل العازلة (موضح في الجدول المواد) التي تحتوي على الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز مثبطات على الجليد.
- كرر الخطوات 1،6-1،10 حتى يتم رفعه الصمامات من جميع الأجنة، وجمع كل صمام في أنبوب إيبندورف منفصل. إذا كان كل الأجنة لديها نفس التركيب الوراثي، يمكن جمع جميع الصمامات في أنبوب إيبندورف واحد.
- إذا التنميط الجيني التي يتعين القيام بها لتحديد الصمامات لتجميع، ضع على الفور العينات في تحلل العازلة في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. ويمكن بعد ذلك يتم تجميع العينات بعد التنميط الجيني (الخطوة 2.1.1).
استخراج البروتين 2.
- ذوبان الجليد الأنسجة التي تم جمعها على الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 13،100 x ج لمدة 1 دقيقة لجمع الأنسجة العازلة في تحلل في أسفل الأنبوب.
- إذا كانت مرمزة الأجنة، استخدم ماصة لجمع بلطف وتجمع المخزن المؤقت تحلل تحتوي على مناطق صمام من الأجنة مع الأنماط الجينية مماثلة. لضمان ب قويةو، وتجميع صمام 3-4 المناطق من أجنة E13.5 لكل يوصى العينة.
- إذا كانت جميع الأجنة من نفس النمط الجيني وجمعت جميع المناطق صمام معا في الخطوة 1.10، ليز العينة بأكملها، كما هو موضح في الخطوة 2.2.
- تحقق من حجم العينة المجمعة الناتجة عنها، وإضافة العازلة تحلل إلى إجمالي حجم 40 ميكرولتر. ثم، وتعطيل والتجانس العينات باستخدام حبات الفولاذ المقاوم للصدأ 5 ملم في أنابيب إيبندورف. تشغيل ايزر لمدة 2-4 دقائق عند 50 هرتز، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تدور الأنابيب لفترة وجيزة، (~ 13،100 x ج لمدة 1 دقيقة)، ونقل العينات إلى أنابيب جديدة، مخلفين وراءهم حطام غير قابلة للذوبان.
- إعداد وعينات منفصلة للSDS-PAGE ونقل لاحقا تحليل لطخة الغربي، بعد بروتوكول مثل اسلامي وآخرون 9. النشاف لبروتين السيطرة تحميل ضروري لالبروتين الكمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذه التقنية إعداد، تمكنا من كشف فسفرته لل Smad 1،5،8 (pSmad) في مناطق الصمام الأورطي واحدة من E13.5 الأجنة. كما هو مبين في الشكل 1A، البروتين معزولة حتى من منطقة صمام واحدة كافية لكشف عصابة pSmad باهتة. كثافة إشارة تزيد نسبيا إلى عدد من المناطق صمام التي يتم تجميعها. الأهم من ذلك، لا تزال pSmad / β-أكتين نسبة ثابتة تقريبا في جميع أنحاء أحجام العينات المختلفة (الشكل 1C). نظرا لانخفاض مستويات البروتين المتاحة، نفس وصمة عار لا يمكن تجريد وreprobed لمجموع لل Smad. ومع ذلك، وصمة عار منفصلة تظهر الكلي لل Smad 1 و β-الأكتين وتظهر نمط التعبير نفسه (الشكل 1B).
هذه المناطق هي صمام يكاد يخلو تماما من تلويث عضلة القلب البطيني. باستخدام هذه التقنية في إعداد تركيبة مع عينات من البطين الأيمن، كنا قادرين على كشف ventricالجزيئية ANP علامة عضلة القلب في المناطق صمام الأورطي، في حين تم الكشف عن هذه العلامة بسهولة في البطين (الشكل 2). علاوة على ذلك، تم أيضا الكشف عن عضلة القلب البطيني علامة ميوسين سلسلة ضوء 2V بسهولة في عينة البطين لكن بالكاد يمكن كشفها في المناطق صمام الأبهري. هذه النتائج تدعم الدقة للتشريح.
الرقم 1. لل Smad الفسفرة في المناطق صمام الأبهري الجنينية. تم إعداد عينات مع أعداد متزايدة من الفأر الجنينية المناطق الصمام الأبهري المجمعة، تتراوح بين 1 إلى 4 مناطق صمام لكل عينة. تتضمن كل عينة جميع البروتينات المعزولة من منطقة صمام كامل (ق) في إجمالي حجم 25-28 ميكرولتر. وبعد ذلك تعرض الأنسجة استعداد لتحليل لطخة الغربي لفسفرته Smad1،5،8 (pSmad) (A)، الكل Smad1 (C)، وβ-الأكتين (A، C). تم الكشف عن البروتين باستخدام Lumigen ECL فائقة وتصوير مع برنامج UVM VisionWorks. كثافة عصابة من pSmad وβ-الأكتين يتناسب مع كمية المواد ابتداء، وكميا في (B) باستخدام برنامج يماغيج. البيانات المعروضة هي المتوسط والانحراف المعياري اثنين من البقع منفصلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. المناطق صمام الأبهري لا تعبر عن علامات عضلة القلب البطينية. تم إعداد عينات مع أعداد متزايدة من الفأر الجنينية المناطق الصمام الأبهري المجمعة، تتراوح بين 1 إلى 4 مناطق صمام لكل عينة، أو مععينة من البطين الأيمن. تم تجهيز العينات كما هو موضح في الشكل (1) ونشف لعضلة القلب البطيني علامات ANP (A) وضوء سلسلة الميوسين (MLC) -2v (B). ANP يقتصر تماما على عينة البطين، ويتم التعبير عن MLC-2V عند مستويات منخفضة للغاية مقارنة مع العينة البطين. يظهر β-الأكتين كعنصر تحكم تحميل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
القدرة على قياس مستويات البروتين في أوائل الفأر الجنينية وكتكوت المناطق صمام القلب توفر أداة إضافية لفهم الأحداث الإشارات الخلوية الحرجة للتنمية صمام. لدينا بروتوكول الموصوفة هنا لا تختلف كثيرا من إجراءات عزل بروتين القياسية. ومع ذلك، عن طريق تعديل بعض الخطوات الرئيسية، التي حصلنا عليها بنجاح البروتينات فسفرته من أحجام عينة صغيرة للغاية. لتحقيق هذه النتيجة، والخطوات التالية هي ذات أهمية خاصة. لضمان الحصول على جودة البروتين، من الأهمية بمكان للحفاظ على عينات مبردة، سواء على الجليد أو باستخدام مخازن الجليد الباردة، في وجود الأنزيم البروتيني، وإذا لزم الأمر، مثبطات الفوسفاتيز. علاوة على ذلك، تجانس مع الجهاز الذي تم تصميمه لمعالجة أحجام عينة صغيرة أمر ضروري لتعطيل كاف أغشية الخلايا. حتى مع هذه الاحتياطات، والعائد الحصول عليها من البروتين قد تكون منخفضة للغاية للكشف عن طريق فحص برادفورد مع طيفيأو مجموعة البروتين الكمي والتي لا تزال متاحة للعينة التحليلات اللاحقة. لقد تمكنا من تحديد أن كل منطقة الصمام الأورطي تحتوي ما يقرب من 1 ميكروغرام من البروتين من خلال تجميع 7 مناطق الصمام الأورطي وباستخدام نموذج كامل لتقدير. على الرغم من هذا القيد، يتم الحصول على ما يكفي من البروتين للكشف عن البروتينات فسفرته وغير فسفرته، على الرغم من عدم وجود تقدير مسبق يجعل تحكم التحميل الأساسية. نحن تستخدم خصيصا β-الأكتين لأنه هو بروتين فرة عالية، الأمر الذي سمح لنا لكشفها حتى بعد تجريد الغشاء مرات عديدة. الوزن الجزيئي تختلف عن البروتينات لدينا في المصالح؛ ويتم التعبير عن ذلك بتواجد مطلق. ينصح صمة عار محاكمة الغربية مع أعداد مختلفة من العينات المجمعة لتحديد عدد الأنسجة يجب المجمعة إما الجنينية المناطق صمام القلب في المراحل الأخرى للتنمية أو الأنسجة الصغيرة الأخرى المثيرة للاهتمام. وبالإضافة إلى ذلك، نوصي تجميع ثلاثة على الأقل رقضية عينات لكل عينة بروتين لحساب التغير في حجم الأنسجة تشريح وكذلك في طول الفترة الزمنية جلس كل جنين على الجليد قبل تشريح. إذا لا يمكن أن يتم الكشف عن البروتين من الفائدة عبر طخة غربية حتى بعد تجميع عينات، ونحن نوصي تقليل حجم العينة وزيادة التجانس الوقت للتأكد من أن كل بروتين محتمل متاح للكشف. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني لالمثلج تريس العازلة خلال تشريح للبروتينات غير مستقرة أو متدهورة بسهولة. إذا يتم التعبير عن بروتين من الفائدة عند مستويات منخفضة، استكشاف الأخطاء وإصلاحها إضافية أثناء الجزء الغربي من لطخة التجربة، مثل تعديل حضانة الأجسام المضادة الأولية أو طريقة الكشف الركيزة، قد تساعد مع التصور.
إذا كانت الأدلة (على سبيل المثال، أو المناعية في الموقع التهجين) تشير إلى أن بروتين في المصالح أعرب سواء في صمامات القلب ومحيط لالاكتشاف عضلة القلب، والشريان الأورطي أو الشريان الرئوي عضلة القلب يمكن مثار بلطف بعيدا مع الإبر التنغستن، حتى من الصمامات من E12.5 الأجنة 5. لأن هذه الخطوة الإضافية سوف يطيل وقت تشريح ويضيف صعوبة فنية كبيرة، نقترح توظيفها حسب الحاجة فقط. في دراستنا الأصلية، بدأنا مع تحليل المناعى أظهرت أن لل Smad الفسفرة تم تغيير فقط في اللحمة المتوسطة صمام. وهكذا، كنا على ثقة أن أي خلافات لوحظ عبر طخة غربية كان من المقرر أن التغيرات في التعبير في اللحمة المتوسطة صمام 8. وعلاوة على ذلك، لأن وضع صمامات تدفق المسالك الجلوس عند تقاطع الشرايين كبيرة والبطينين، وأداء وصمة عار لمراقبة التلوث البطين باستخدام الأجسام المضادة عضلة القلب البطيني محددة مثل ANP أو MLC-2V يوصى.
لأن صمامات تخضع إعادة تنظيم دراماتيكي خلال تطورها، ونحن نقدم ص مرحلة معينة التاليecommendations للسائد / الصمامات والأنسجة المحيطة بها. للسائد في وقت مبكر (E9.5-11.5)، وكلاهما المسالك تدفق وسائد الأذينية البطينية وتصور بسهولة وتشريح بسبب الشفافية من عضلة القلب 10؛ ومع ذلك، فإن هذه الأجنة صغيرة، وينصح الإبر تشريح بدلا من الملقط وmicroscissors. في منتصف مرحلة التمايز (E12.5-14.5) 10، الصمامات الهلالية (أي الأبهر والشريان الرئوي صمامات) سيكون أكثر يمكن الوصول إليها بسهولة من الصمامات الأذينية البطينية (أي التاجي والصمامات الثلاثية الشرف). ومع ذلك، فإن الصمامات الهلالية يجب تشريح بعناية لأن الشريان الأورطي والشريان الرئوي وseptating وتناوب خلال هذا الإطار الزمني 11،12. وينبغي إيلاء اهتمام دقيق لدوران قاعدة من الشريان الأورطي والشريان الرئوي، وينبغي تحديد نقطة الوسط بين هذه الشرايين باستمرار. في مراحل لاحقة من النضج صمام والتكثيف (E15.5 و لاحقا) 10، والتاجي والصمامات الثلاثية الشرف يمكن مثار بعيدا من داخل البطينين. ومع ذلك، يجب أن تكون الصمامات الهلالية أيسر في الوصول اليها.
تحليل لطخة غربية هي تقنية طويلة الأمد لقياس مستويات التعبير البروتين في صمامات القلب للبالغين 13، حيث حجم خزعة كبير. في المقابل، ركزت التحليلات الجنينية المبكرة مجانية على أي المناعية غير الكمية للكشف عن البروتين التعبير أو عكس النسخ PCR، حيث كمية صغيرة من انطلاق مرنا معزولة يمكن تضخيمه قبل التحليل. توفر هذه التقنيات المستخدمة حاليا بعض المعلومات ذات الصلة بشأن التغييرات في إشارة والجينات التعبير ولكنها تفتقر إلى القدرة على تقييم كمي لمستويات البروتين. مع هذا البروتوكول، يمكننا الآن إضافة بيانات البروتين التعبير الكمي لربط مع كمية البيانات مرنا التعبير وتحليلات المناعى.
هذا المديح بروتوكول أنشأت تقنيات لعزل مرنا من صمامات القلب الجنينية والبروتين التصوير التعبير. على هذا النحو، والجمع بين هذه التقنيات ستسمح للتحليلات أكثر اكتمالا من الأعلى وإلى الأسفل تنظيم مسارات إشارات، من مرنا لمرحلة ما بعد متعدية تعديل البروتين. وعلاوة على ذلك، وهذا الأسلوب يسمح للالكمي للتعبير البروتين، والتي من شأنها تعزيز التقنيات المناعية المستخدمة حاليا. معا، ونحن نعتقد أن هذه التقنية سوف تكون ذات فائدة لأي باحث مهتم في صمامات القلب أو إعداد الأخرى إإكسبلنتس الأنسجة صغيرة خاصة للالكمي تحليل لطخة الغربي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
- Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
- Chakraborty, S., et al. Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves. Dev Biol. 347, 167-179 (2010).
- Lee, M. P., Yutzey, K. E. Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves. PLoS One. 6 (e29758), (2011).
- Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes. PLoS One. 6 (e26769), (2011).
- Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells. Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).
- Meng, X., et al. Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis. Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling. Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development. Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M.
- Scherptong, R. W., et al. Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept. Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).
- Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. Detection of osteopontin in calcified human aortic valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).
