Summary
Nous décrivons ici une technique simple et largement accessible microscopie à acquérir la vidéo numérique de haute qualité de la drosophile adulte et phénotypes mutants larvaires dans une perspective latérale.
Abstract
Drosophila melanogaster est un système de modèle expérimental puissant pour étudier la fonction du système nerveux. Les mutations génétiques qui provoquent un dysfonctionnement du système nerveux produisent souvent des larves viables et les adultes qui ont locomotion phénotypes défectueux qui sont difficiles à décrire de manière adéquate avec le texte ou représenter complètement avec une seule image photographique. Les formes actuelles de l'édition scientifique, cependant, soutiennent la présentation de supports vidéo numérique comme documentation supplémentaire pour accompagner un manuscrit. Nous décrivons ici une technique simple et largement accessible microscopie pour l'acquisition vidéo numérique de haute qualité des deux phénotypes larves et les adultes de Drosophila du point de vue latérale. Vidéo de la locomotion des larves et des adultes dans une vue de côté est avantageuse car elle permet l'observation et l'analyse des distinctions et de subtiles variations dans les comportements aberrants des locomotives. Nous avons utilisé avec succès la technique de visualiser et de quantifier aberrant rampant comportements en troisième stade larvaire, en plus de phénotypes mutants et les comportements des adultes, y compris le toilettage.
Introduction
Le fruit mouche Drosophila melanogaster commun est un système de modèle expérimental puissant pour étudier la fonction du système nerveux 1-3. Conservation évolutive de la structure et la fonction du système nerveux chez les humains, ainsi que la facilité de la manipulation génétique et une vaste gamme d'outils génétiques chez la drosophile fait l'organisme de première pour modéliser les maladies neurodégénératives humaines 4. Les mutations génétiques qui provoquent un dysfonctionnement du système nerveux entraînent souvent des larves mutant viable et adultes de Drosophila avec une altération de la locomotion. Phénotypes observés dans le système nerveux mutants défectueux, notamment le taux de locomotion, coordination anormale, et les mouvements spasmodiques chez les adultes, ainsi que les déficits de la contraction péristaltique de la paroi musculature du corps, et une paralysie partielle des larves réduits. Ces phénotypes ont été exploités dans le développement à haut débit de cribles génétiques et des dosages de la locomotion des larves mutant 5, 6 et 7 à 10 adultes de Drosophila visant à quantifier l'altération de la locomotion et l'identification de gènes nécessaire pour la fonction du système nerveux. Bien que ces approches sont extrêmement utiles pour quantifier les comportements locomotive larves et les adultes, ils ne parviennent pas à transmettre des informations qualitatives sur chaque comportement aberrant spécifique. Par exemple, alors que la troisième stade larvaire mutant peut présenter des paramètres de locomotion modifiées dans un test de comportement, il peut être difficile de savoir si cela est le résultat des altérations de contractions péristaltiques rythmiques pendant le cycle de ramper, manque général de coordination, ou une paralysie partielle du corps postérieur musculature de la paroi. Nous décrivons ici une technique simple et largement accessible microscopie pour l'acquisition vidéo numérique de haute qualité de la drosophile adulte et phénotypes de locomotives larvaires dans une perspective latérale. Vidéo numérique acquise à partir d'un point de vue latérale permet l'observation directe et l'analyse des distinctions subtiles dans locomotivcomportements e d'une plus informative vue latérale orientation.
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Protocol
1 Le système de Microscope stéréo
Remarque: Bien que ce protocole est facilement adaptable à n'importe quel système de microscope stéréo couplé à un appareil photo numérique avec la possibilité d'acquérir la vidéo, les détails sont fournis sur le système utilisé dans notre laboratoire (Table des Matières / Équipement).
- Acquisition vidéo numérique en utilisant un microscope stéréoscopique trinoculaire couplé à un appareil photo numérique commercial.
- Afin de coupler l'appareil photo numérique commerciale au port trinoculaire du microscope stéréo, retirez le ½x monture C du port de Phototube du microscope stéréo et le remplacer par un 1X C-mount.
- Monter un coupleur d'appareil photo numérique (43 mm de fil) à la 1X C-mount.
- Montez deux anneaux abaisseurs, 58 mm à 48 mm, et 48 mm à 43 mm, à l'attelage de la caméra pour combler la connexion du coupleur d'appareil photo numérique à un kit adaptateur d'objectif pour l'appareil photo numérique.
- Monter l'appareil photo numérique le kit d'adaptateur de lentille.
- Acquérir vidéo avec le grossissement du microscope et un zoom optique de l'ensemble de l'appareil photo numérique pour un grossissement combinée d'environ 12X (30 images par seconde, 640 x 480 pixels). Remarque: Le grossissement du microscope stéréo doit être rémunéré conformément à la 1X C-mount nouvellement reconfiguré du port trinoculaire.
2. imagerie Drosophila troisième stade larvaire
- Ruban d'un marqueur permanent pour la plaque de platine noir d'un microscope stéréo couplé à un appareil photo numérique de sorte que le côté du capuchon de marqueur occupe environ ¼ à ⅓ du champ de vision vertical observé sur l'écran LCD de l'appareil. Utilisation des dessus de marqueurs comme l'étape d'effectuer une imagerie des larves car elles sont dans un assortiment de couleurs qui peut être utilisée pour le code de couleur et de différencier les génotypes des larves est imagé.
- Délimiter le champ de vision observé sur l'écran LCD de l'appareil numérique sur la surface de la partie supérieure de marqueur à pointe finemarqueur.
- Sélectionnez un troisième stade larvaire à l'image. Les critères de sélection des larves au troisième stade larvaire est la longueur du corps, l'émergence de la source d'alimentation au cours de la phase larvaire du cycle de vie, la présence de antérieures et postérieures stigmates, et la structure des crochets mandibulaires de l'appareil de la bouche 11. S'assurer que la larve est propre en le lavant soigneusement à l'eau.
- Illuminer l'étage de haut marqueur permanent d'en haut avec de la lumière à partir d'un système d'éclairage à fibres optiques. Ajustez l'angle de la lumière incidente pour fournir un éclairage optimal.
- Concentrer le microscope sur le bord de la partie supérieure de marqueur permanent. Commencez acquisition vidéo numérique.
- Placer la chenille sur le côté du capuchon de marqueur d'environ 75 ° par rapport à l'axe vertical, à l'extérieur du champ de vision, avec la partie antérieure de la larve, tournée vers le champ de vue (figure 1). Note: Placement de la larve sur le côté de la casquette de marqueur permet à la caméra d'enregistrer le mouvement de ee larve d'un point de vue latérale. Il aide à garder la larve humide avec de l'eau afin qu'ils ne tombent pas sur le côté de la casquette de marqueur. Il faut être prudent, cependant, de ne pas utiliser trop d'eau que des quantités excessives adhèrent à la larve comme il rampe sur le terrain.
- Pousser doucement et pousser la larve d'un petit pinceau pour contraindre à ramper à travers le champ de vision. Soyez patient car les larves coopérer rarement et doivent souvent être revenu au point de départ de nombreuses fois avant qu'ils rampent directement dans le champ.
- Fiche d'environ 10-15 minutes de séquences vidéo numériques sans interruption et culture et enlever toutes les séquences inutiles post-acquisition avec le logiciel de montage vidéo numérique.
3. Imaging adultes Drosophila
- Placez une seule drosophile adulte dans un jetable de 1,5 ml spectroscopique polystyrène cuvette.
Remarque: CO 2 anesthésie de la drosophile adulte immédiatement avant un comporioral protocole d'analyse peut compromettre les résultats 12. Il est recommandé que la drosophile adulte d'un délai de 24 heures pour se remettre de CO 2 anesthésie avant d'effectuer un test de comportement 13. - Branchez l'autre extrémité de la cuvette avec une petite boule de coton. S'assurer que la boule de coton est emballé assez serré pour occuper le grand espace de la PAC et confine à la volée dans le compartiment de réduction du volume de la cuve.
- Placer la cuvette sur la plaque de platine blanc d'un microscope stéréo et aligner correctement le compartiment à volume réduit de la cuvette avec le champ de vision observé sur l'écran LCD de l'appareil numérique.
- Éclairer la cuvette au-dessus de la lumière d'un système d'éclairage à fibres optiques. Ajustez l'angle de la lumière incidente pour fournir un éclairage optimal.
- La mise au microscope et commencer à acquérir la vidéo numérique.
- Fiche d'environ 30-45 min de séquences vidéo numériques sans interruption et cultures et retirez tous les inutilesimages post-acquisition avec le logiciel de montage vidéo numérique.
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Representative Results
Nous avons utilisé avec succès cette technique pour acquérir et quantifier le phénotype comportemental larvaire associée à la perte de fonction du gène de la stathmine (figure 2) 14. Le gène code pour une protéine stathmine réglementaire microtubules qui partitionne la tubuline des pools de tubuline soluble, et se lie microtubules et favorise leur démontage 15,16. Stathmin fonction est nécessaire pour maintenir l'intégrité des microtubules dans les axones des nerfs périphériques 14. Perturbation de l'activité de stathmine dans Drosophila résultats du troisième stade larvaire dans un phénotype dans lequel les segments du corps postérieures basculent vers le haut après chaque onde péristaltique de la contraction musculaire pendant le cycle de ramper. Cette paralysie des membres postérieurs ou phénotype «queue-flip» est une marque de transport axonal défectueux. Nous avons quantifié la pénétrance et de la gravité du phénotype de la paralysie des membres postérieurs à la troisième stade larvaire de sept différents <em> Stathmin génotypes mutants en mesurant l'angle dessus de l'horizontale de la queue a été soulevée au cours du cycle de ramper (tableau 1). Les larves ont été déterminés à présenter une queue-flip robuste si la queue a été soulevée de plus de 40 ° au-dessus horizontale lors de l'analyse, une queue-flip doux si la queue a été soulevée à moins de 40 ° au-dessus horizontale, et pas de queue-flip si les larves exposées un comportement de ramper normale.
Figure 1: La position de troisième stade larvaire sur une phase stable de capuchon de marqueur pour l'acquisition du signal vidéo numérique à partir d'une perspective latérale à l'aide d'un microscope stéréo. Vue latérale d'un système de microscope stéréo de base avec un appareil photo numérique fixé à l'orifice trinoculaire. L'encart montre le grossissement de l'orientation d'un marqueur permanent collé sur la platine du microscope et la position de le troisième stade larvaire sur le capuchon de marqueur pour l'acquisition de vidéo numérique de comportement aberrant du point de vue latérale. A l'image des trois dimensions de l'espace sont définies; l'axe des abscisses s'étend sur la longueur du marqueur permanent et est parallèle à la platine du microscope, l'axe y est perpendiculaire à l'axe X et parallèle à la platine du microscope, et l'axe z est vertical du capuchon de marqueur à l' lentille d'objectif et perpendiculaire à la platine du microscope. Un troisième stade larvaire est placé sur le côté du capuchon de marqueur d'environ 75 ° par rapport à l'axe z vertical vers l'axe des y, à l'extérieur du champ de vision de la caméra numérique, avec la partie antérieure de la chenille faisant face à la zone de vue. Placement de la chenille sur le côté du capuchon de marqueur permet à la caméra numérique du microscope stéréo pour enregistrer le mouvement de la chenille sur le champ à partir d'une perspective latérale.
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Figure 2: Images de résultats représentatifs. D'images représentatives de la vidéo numérique de la drosophile larve (A, B) et adulte (C, D) phénotypes et les comportements acquis dans une perspective latérale. Chaque image est une vidéo une image fixe extraite à partir de fichiers vidéo numériques acquises. (A) de type sauvage troisième stade larvaire présentent une posture du corps plat lors de l'exploration le long d'un substrat. (B) Troisième stade larvaire homozygotes pour une mutation dans l'exposition du gène stathmine un rampant aberrante comportement queue-flip, indicatif d'une paralysie de la musculature postérieure. (C) Les ailes de type sauvage drosophile adulte sont maintenu à plat contre le corps comme la mouche marche. (D) la drosophile adulte, homozygotes pour une mutation inconnue, tiennent leurs ailes à angles d'environ 45 ° supérieures à la normale. Les deux aberrante phénotype larvaire et adultes sont décrits plus observée et en communication avec la vidéo numérique acquise à partir d'une vue latérale perspective latérale. Dans le panneau A et B de la barre d'échelle = 1 mm. Ce chiffre a été modifié depuis Duncan et al., 2013.
| Gravité de la paralysie postérieure phénotype | ||||
| Génotype | n | Sans queue-Flip | Doux Tail-Flip (<40 °) | Robuste Queue-Flip (> 40 °) |
| type sauvage | 150 | 100,0% (N = 150) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| stai B200 / + | 130 | 100,0% (N = 130) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| stai rdtp / + | 140 | 100,0% (N = 140) | 0,0% (N =) | 0,0% (N = 0) |
| Df (2L) Exel6015 / + | 120 | 100,0% (N = 120) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| stai B200 | 120 | 23,3% (N = 28) | 23,3% (N = 28) | 53,4% (N = 64) |
| stai B200 / Df (2L) Exel6015 | 101 | 10,9% (N = 11) | 21,8% (N = 22) | 67,3% (N = 68) |
| stai rdtp | 125 | 16,0% (N = 20) | 32,0% (N = 40) | 52,0% (N = 65) |
| stai rdtp / Df (2L) Exel6015 | 140 | 7,7% (N = 11) | 23,7% (N = 33) | 68,6% (N = 96) |
Tableau 1 pénétrance et de la gravité de l'postérieur paralysie phénotype observé dans la stathmine (stai) mutant de Drosophila de larves de troisième stade. L'pénétrance et la gravité du phénotype de la paralysie des membres postérieurs de Stathmin mutant Drosophila larves de troisième stade a été reçu et quantifié par l'acquisition de vidéo numérique de la conduite à partir d'une perspective latérale et en mesurant l'angle que la queue a été soulevée au-dessus du plan de ramper horizontale pendant le cycle de ramper. Les larves ont été marqués comme ayant une queue-flip robuste si la queue a été élevée supérieure à 40 ° au-dessus du plan horizontal et une queue légère bascule si la queue a été élevée à moins de 40 ° au-dessus du plan horizontal. Les larves présentant un comportement de ramper normale ont été marqués comme n'ayant queue-flip. Le comportement de l'exploration d'au moins une centaine de larves a été analysée pour chaque génotype testé. Ce tableau a été modifié depuis Duncan et al., 2013.
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Discussion
La force de Drosophila melanogaster comme un système modèle pour l'étude de la fonction du système nerveux provient en grande partie de la convergence des outils génétiques puissants disponibles et la large gamme de tests comportementaux robustes développé. Nous présentons ici une technique simple et largement accessible microscopie pour l'acquisition vidéo numérique de haute qualité de la drosophile adulte et phénotypes de locomotives larvaires dans une perspective latérale. Nous avons utilisé cette approche avec succès pour caractériser et quantifier la sévérité de la paralysie postérieure «queue-flip 'phénotypes observés dans neurologiques troisième stade mutants larvaires en mesurant directement l'angle maximal que la queue a été soulevée de l'axe horizontal pendant le cycle de ramper 14. L'avantage de l'approche présentée ici est que la vidéo est acquise à partir d'un point de vue latérale, permettant l'observation directe et l'analyse des comportements aberrants de locomotive, souvent observé dans neurologiques larvaire et uneDult mutants, d'une «vue latérale 'orientation plus informatif. Par conséquent, la visualisation des contractions musculaires péristaltiques dans des larves de drosophile, et les phénotypes de la démarche aberrantes dans la drosophile adulte sont plus facilement observée et analysée. Une limitation de cette technique est qu'elle n'est pas une méthode à haut débit. En outre, les larves et les adultes de Drosophila comportements spécifiques ne peuvent être analysés pour de courtes durées de temps en raison de la zone de suivi restrictive offerte par le champ de vision du microscope stéréo. Cela peut être particulièrement problématique lors de l'acquisition vidéo de comportements adultes de Drosophila, comme le volume de la chambre de la cuvette est sensiblement plus grand que le champ de vision du microscope stéréo. Nous avons abordé ce problème en utilisant des inserts en coton et en carton pour minimiser le volume de la chambre de cuve et de limiter le mouvement de la mouche adulte de l'espace contenu à l'intérieur du champ de vision. Bien que la majorité de notre imvieillissement a mis l'accent sur des mutants larvaires neurologiques, nous avons aussi utilisé la technique pour observer adultes phénotypes mutants et les comportements, y compris le toilettage, ce qui suggère que la technique peut être facilement étendu pour inclure l'analyse d'autres comportements tels que la drosophile cour, la copulation, et l'agression. Il est possible que cette technique pourrait être utile pour l'imagerie d'autres membres de la famille des drosophilidés, ainsi que d'autres insectes de taille similaire. En outre, une modification mineure de la technique d'imagerie permettrait d'espèces d'insectes plus grands.
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Disclosures
Les auteurs ont déclaré que aucun conflit d'intérêts existe.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Alexandra Opie pour l'assistance technique et le soutien, James Barton pour fournir la vidéo narration, et Ramona Flatz et Joellen Sweeney pour apparaître dans la vidéo qui l'accompagne. Ce travail a été financé par le Fonds fiduciaire de bienfaisance MJ Murdock (Grant No. 2012205 JED).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
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