Summary
Aquí se describe una técnica de microscopía simple y ampliamente accesibles para la adquisición de vídeo digital de alta calidad de Drosophila adulta y fenotipos mutantes larvas desde una perspectiva lateral.
Abstract
Drosophila melanogaster es un potente sistema de modelo experimental para el estudio de la función del sistema nervioso. Las mutaciones genéticas que causan la disfunción del sistema nervioso a menudo producen larvas viables y adultos que tienen fenotipos de locomoción defectuosos que son difíciles de describir adecuadamente con el texto o completamente representar con una sola imagen fotográfica. Modos actuales de la publicación científica, sin embargo, apoyan la presentación de los medios de comunicación de vídeo digital como material complementario para acompañar a un manuscrito. Aquí se describe una técnica simple y ampliamente accesible de microscopía para la adquisición de vídeo digital de alta calidad tanto de Drosophila fenotipos larvas y adultos desde una perspectiva lateral. Vídeo de la locomoción de larvas y adultos desde una vista lateral es ventajoso porque permite la observación y el análisis de las distinciones sutiles y variaciones en los comportamientos aberrantes de locomotoras. Hemos utilizado con éxito la técnica para visualizar y cuantificar aberrant arrastrándose comportamientos en larvas de tercer estadio, además de fenotipos mutantes adultas y comportamientos que incluyen la preparación.
Introduction
La fruta común mosca Drosophila melanogaster es un potente sistema de modelo experimental para el estudio de la función del sistema nervioso 1-3. Conservación evolutiva de la estructura y función del sistema nervioso con los seres humanos, así como la facilidad de la manipulación genética y una amplia gama de herramientas genéticas hace Drosophila el organismo estreno para modelar enfermedades neurodegenerativas humano 4. Las mutaciones genéticas que causan la disfunción del sistema nervioso a menudo resultan en larvas mutante viable y adultos de Drosophila con una alteración de la locomoción. Fenotipos observados en el sistema nervioso mutantes defectuosos incluyen la frecuencia de la locomoción, la coordinación aberrante, y los movimientos espásticos en adultos, así como déficits en la contracción peristáltica musculatura de la pared corporal, y parálisis parcial de las larvas reducen. Estos fenotipos se han explotado en el desarrollo de pantallas genéticos de alto rendimiento y ensayos de locomoción de larvas mutante 5, 6 y adultos 7-10 Drosophila dirigido a cuantificar el deterioro locomoción y la identificación de genes necesarios para la función del sistema nervioso. Si bien estos enfoques son extremadamente útiles para la cuantificación de los comportamientos locomotores larvas y adultos, fracasan para transmitir información cualitativa acerca de cada comportamiento aberrante específico. Por ejemplo, mientras que las larvas de tercer estadio mutante puede exhibir parámetros de locomoción alterados en un ensayo de comportamiento, puede ser poco claro si este es el resultado de alteraciones en las contracciones peristálticas rítmicas durante el ciclo de rastreo, la falta general de coordinación, o parálisis parcial del cuerpo posterior musculatura de la pared. Aquí se describe una técnica simple y ampliamente accesible de microscopía para la adquisición de vídeo digital de alta calidad de Drosophila adulta y fenotipos de la locomotora de larvas desde una perspectiva lateral. El vídeo digital adquirido desde una perspectiva lateral permite la observación directa y el análisis de las diferencias sutiles en locomotive comportamientos desde una orientación de vista lateral más informativo.
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Protocol
1. El Sistema de Microscopio estéreo
Nota: Aunque este protocolo es fácilmente adaptable a prácticamente cualquier sistema de microscopio estéreo acoplado a una cámara digital con la capacidad de adquisición de vídeo, los detalles se proporcionan en el sistema utilizado en nuestro laboratorio (Tabla de Materiales / Equipos).
- Adquirir vídeo digital usando un microscopio estéreo trinocular acoplado a una cámara digital comercial.
- Para acoplar la cámara digital comercial al puerto trinocular del microscopio estereoscópico, retire el ½ x C-monte del puerto phototube del microscopio estereoscópico y reemplazarlo con un C-mount 1X.
- Montar un acoplador de la cámara digital (43 mm de rosca) a la C-mount 1X.
- Monte dos anillos reductores, 58 mm a 48 mm, y 48 mm a 43 mm, hasta el acoplador de la cámara para cerrar la conexión del acoplador de la cámara digital a un kit adaptador de lente para la cámara digital.
- Monte la cámara digital al kit adaptador de lente.
- Adquirir video con el microscopio óptico y el zoom óptico de la serie cámara digital para un aumento combinado de aproximadamente 12 aumentos (30 fotogramas por segundo, 640 x 480 píxeles). Nota: El aumento del microscopio estéreo debe ser compensado de acuerdo con la recién reconfigurada 1X C-monte del puerto trinocular.
2. Imaging Drosophila larvas de tercer estadio
- Cinta un marcador permanente a la placa de la platina negro de un microscopio estereoscópico acoplado a una cámara digital, de manera que el lado de la tapa marcador ocupa aproximadamente ⅓ a ¼ del campo de visión vertical observada en el monitor LCD de la cámara. Utilice tapas de marcadores como la etapa para realizar las imágenes de las larvas porque vienen en una variedad de colores que se pueden utilizar para el código de color y diferenciar los genotipos de las larvas a ser visualizada.
- Delimita el campo de visión observada en el monitor LCD de la cámara digital en la superficie de la parte superior con un marcador de punta finamarcador.
- Seleccionar un tercer instar de la larva de la imagen. Los criterios para seleccionar las larvas de tercer instar era la longitud del cuerpo, la salida de la fuente de alimento durante la fase larvaria del ciclo de vida, la presencia de espiráculos anterior y posterior, y la estructura de los ganchos inferiores del aparato de la boca 11. Asegúrese de que la larva es limpio lavándolo bien con agua.
- Ilumine la etapa superior marcador permanente desde arriba con la luz de un sistema de iluminación por fibra óptica. Ajuste el ángulo de la luz incidente para proporcionar la iluminación óptima.
- Enfoque del microscopio en el borde de la parte superior marcador permanente. Comience la adquisición de vídeo digital.
- Coloque la larva en el lado de la tapa de marcador de aproximadamente 75 ° fuera del eje vertical, justo fuera del campo de visión, con la parte anterior de la larva que mira hacia el campo de visión (Figura 1). Nota: La colocación de la larva en el lado de la tapa de marcador permite a la cámara para registrar el movimiento de le larva desde una perspectiva lateral. Ayuda a mantener la larva húmedo con agua para que no se caen del lado de la tapa del marcador. Se debe tener cuidado, sin embargo, no usar demasiada agua como cantidades excesivas se adherirán a la larva que se arrastra a través del campo.
- Clave suavemente y empujar a la larva con un pincel pequeño para coaccionar a arrastrarse por el campo de visión. Sea paciente como las larvas raramente cooperar ya menudo tienen que ser devueltos al punto de partida muchas veces antes de que se arrastran directamente a través del campo.
- Record aproximadamente 10-15 minutos de ininterrumpida video digital y de cultivos y retirar todo el material innecesario después de la adquisición con el software de edición de vídeo digital.
3. Imaging Drosophila Adulto
- Coloque un solo adulto de Drosophila en una desechable de 1,5 ml cubeta de poliestireno espectroscópico.
Nota: CO 2 para la anestesia de adultos Drosophila inmediatamente antes de un comporprotocolo de análisis conductuales puede comprometer los resultados 12. Se recomienda que los adultos Drosophila disponer de un plazo de 24 horas para recuperarse de CO 2 para la anestesia antes de realizar una prueba de comportamiento 13. - Conecte el extremo de la cubeta con una pequeña bola de algodón. Asegúrese de que la bola de algodón está lleno suficientemente apretado para ocupar el espacio de gran capitalización y limita la marcha para el compartimiento de reducción del volumen de la cubeta.
- Colocar la cubeta en la placa blanca etapa de un microscopio estéreo y alinear correctamente el compartimiento de volumen reducido de la cubeta con el campo de visión observada en el monitor LCD de la cámara digital.
- Iluminar la cubeta desde arriba con la luz de un sistema de iluminación de fibra óptica. Ajuste el ángulo de la luz incidente para proporcionar la iluminación óptima.
- Enfoque el microscopio y comenzar a adquirir de vídeo digital.
- Record aproximadamente 30-45 min de ininterrumpida imágenes de vídeo digital y de cultivos y eliminar todos los innecesariosimágenes post-adquisición con el software de edición de vídeo digital.
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Representative Results
Hemos utilizado con éxito esta técnica para adquirir y cuantificar el comportamiento de las larvas fenotipo asociado con la pérdida de la función del gen estatmina (Figura 2) 14. El gen codifica una proteína estatmina reguladora de microtúbulos que divide los dímeros de tubulina de piscinas de tubulina soluble, y se une a los microtúbulos y promueve su desmontaje 15,16. Se requiere la función Estatmina para mantener la integridad de los microtúbulos en los axones de los nervios periféricos 14. La interrupción de la actividad estatmina en Drosophila resultados larvas en un fenotipo en el que los segmentos corporales posteriores voltear hacia arriba después de cada onda peristáltica de la contracción muscular durante el ciclo de rastreo. Esta parálisis posterior o fenotipo "cola-flip 'es un sello distintivo de transporte axonal defectuoso. Hemos cuantificado la penetrancia y la severidad del fenotipo parálisis posterior en tercer estadio las larvas de siete diferentes <em> Estatmina genotipos mutantes midiendo el ángulo sobre la horizontal de la cola se planteó durante el ciclo de rastreo (Tabla 1). Las larvas se determinó para exhibir una robusta cola-flip si la cola se elevó mayor que 40 ° sobre la horizontal durante el rastreo, una cola-flip suave si la cola se elevó menos de 40 ° sobre la horizontal, y sin cola-flip si las larvas exhibió un comportamiento normal de rastreo.
Figura 1 Posición de tercer instar de la larva en un escenario cap marcador permanente para la adquisición de vídeo digital desde una perspectiva lateral utilizando un microscopio estereoscópico. Vista lateral de un sistema básico de microscopio estereoscópico con cámara digital montada en el puerto trinocular. La ampliación recuadro muestra la orientación de un marcador permanente pegado a la platina del microscopio y la posición de el tercer instar de la larva en la tapa marcador para la adquisición de vídeo digital de comportamiento aberrante desde una perspectiva lateral. En la imagen se definen las tres dimensiones del espacio; el eje x discurre a lo largo del marcador permanente y es paralelo a la platina del microscopio, el eje y es perpendicular al eje x y paralelo a la platina del microscopio, y el eje z es vertical desde la tapa del marcador a la lente de objetivo y perpendicular a la platina del microscopio. Un tercer instar de la larva se coloca en el lado de la tapa de marcador de aproximadamente 75 ° de distancia del eje z vertical hacia el eje y, justo fuera del campo de visión de la cámara digital, con la parte anterior de la larva que mira hacia el campo de vista. Colocación de la larva en el lado de la tapa de marcador permite a la cámara digital de la microscopio estéreo para grabar el movimiento de la larva a través del campo desde una perspectiva lateral.
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Figura 2. Imágenes de resultados representativos. Imágenes representativas de vídeo digital de Drosophila larva (A, B) y adulto (C, D) fenotipos y comportamientos adquirió desde una perspectiva lateral. Cada imagen es un fotograma de vídeo marco extrae de archivos de vídeo digitales adquiridos. (A) Wildtype tercer instar de la larva exhiben una postura corporal plana cuando se arrastra a lo largo de un sustrato. (B) En tercer instar larva homocigotos para una mutación en el gen de exposiciones estatmina un rastreo aberrante comportamiento de la cola-flip, indicativo de una parálisis de la musculatura posterior. (C) Las alas de tipo salvaje adulto de Drosophila se mantiene plano contra el cuerpo como camina la marcha. (D) Adulto Drosophila, homocigotos para una mutación desconocida, mantenga sus alas en ángulos de aproximadamente 45 ° por encima de lo normal. Tanto aberrante fenotipo larvas y adultoss descritos son mejor observadas y comunicadas con vídeo digital adquirido de un lado-vista en perspectiva lateral. En el panel A y B de la barra de escala = 1 mm. Esta cifra ha sido modificado desde Duncan et al., 2013.
| La gravedad de la parálisis posterior Fenotipo | ||||
| Genotipo | n | No Tail-Flip | Leve Cola-Flip (<40 °) | Robusto Cola-Flip (> 40 °) |
| wildtype | 150 | 100.0% (N = 150) | 0.0% (N = 0) | 0.0% (N = 0) |
| stai B200 / + | 130 | 100.0% (N = 130) | 0.0% (N = 0) | 0.0% (N = 0) |
| stai rdtp / + | 140 | 100.0% (N = 140) | 0.0% (N =) | 0.0% (N = 0) |
| Df (2L) Exel6015 / + | 120 | 100.0% (N = 120) | 0.0% (N = 0) | 0.0% (N = 0) |
| stai B200 | 120 | 23,3% (N = 28) | 23,3% (N = 28) | 53,4% (N = 64) |
| stai B200 / Df (2L) Exel6015 | 101 | 10,9% (N = 11) | 21,8% (N = 22) | 67,3% (N = 68) |
| stai rdtp | 125 | 16,0% (N = 20) | 32,0% (N = 40) | 52,0% (N = 65) |
| stai rdtp / Df (2L) Exel6015 | 140 | 7,7% (N = 11) | 23,7% (N = 33) | 68,6% (N = 96) |
Tabla 1. penetrancia y severidad de laposterior fenotipo parálisis observada en stathmina (STAI) Drosophila larvas de tercer instar mutante. La penetrancia y la gravedad del fenotipo parálisis posterior de Drosophila Estatmina larvas de tercer instar mutante se anotó y se cuantificó mediante la adquisición de vídeo digital de la conducta desde una perspectiva lateral y medir el ángulo que la cola se elevó por encima del plano horizontal de rastreo durante el ciclo de rastreo. Las larvas se anotó como teniendo una robusta cola-flip si la cola se elevó mayor que 40 ° por encima del plano horizontal y una cola-flip suave si la cola se elevó menos de 40 ° por encima del plano horizontal. Las larvas que exhibe un comportamiento normal de rastreo fue evaluado como no tener cola-flip. Se analizó el comportamiento de rastreo de al menos un centenar de larvas para cada genotipo probado. Esta tabla ha sido modificado desde Duncan et al., 2013.
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Discussion
Fuerza Drosophila melanogaster 's como un sistema modelo para el estudio de la función del sistema nervioso proviene en gran medida de la convergencia de las poderosas herramientas genéticas disponibles y la amplia gama de ensayos de comportamiento robusto desarrollado. Aquí presentamos una técnica sencilla y ampliamente accesible de microscopía para la adquisición de vídeo digital de alta calidad de Drosophila adulta y fenotipos de la locomotora de larvas desde una perspectiva lateral. Hemos utilizado con éxito este método para caracterizar y cuantificar la gravedad de la parálisis posterior "cola-flip 'fenotipos observados en neurológicos tercer instar mutantes larvarios midiendo directamente el ángulo máximo que la cola se elevó desde el eje horizontal durante el ciclo de rastreo 14. El beneficio del enfoque que aquí se presenta es que el vídeo se adquiere desde una perspectiva lateral, lo que permite la observación directa y el análisis de los comportamientos locomotores aberrantes, a menudo observado en neurológica larvas y undult mutantes, desde una orientación más informativa 'side-view'. En consecuencia, la visualización de las contracciones musculares peristálticas en larvas de Drosophila, y fenotipos aberrantes de la marcha en adultos de Drosophila se observan y analizan más fácilmente. Una limitación de esta técnica es que no es un enfoque de alto rendimiento. Además, larvas y adultos de Drosophila comportamientos específicos sólo pueden ser analizados para duraciones breves de tiempo debido a la zona de seguimiento restrictiva proporcionada por el campo de visión del microscopio estéreo. Esto puede ser particularmente problemático cuando la adquisición de video de comportamientos de Drosophila adultas, como el volumen de la cámara de cubeta es significativamente mayor que el campo de visión del microscopio estéreo. Hemos abordado este problema mediante el uso de insertos de algodón y cartón para minimizar el volumen de la cámara de cubetas y restringir el movimiento de la mosca adulta a un espacio contenido dentro del campo de visión. Mientras que la mayoría de nuestra imenvejecimiento se ha centrado en los mutantes de larvas neurológicos, también hemos utilizado la técnica para observar adultos fenotipos mutantes y comportamientos, incluyendo la preparación, lo que sugiere que la técnica se puede ampliar fácilmente para incluir el análisis de otros comportamientos de Drosophila como cortejo, cópula, y la agresión. Es posible que esta técnica podría ser útil para obtener imágenes de otros miembros de la familia de Drosophilidae, así como otros insectos de tamaño similar. Además, menor modificación de la técnica permitiría obtención de imágenes de especies de insectos más grandes.
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Disclosures
Los autores han declarado que no existen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer Alexandra Opie de asistencia y apoyo técnico, James Barton para proporcionar narración de vídeo, y Ramona Flatz y Joellen Sweeney por aparecer en el video adjunto. Este trabajo fue apoyado por el MJ Murdock Charitable Trust (Grant No. 2012205 a JED).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
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