Summary
Här beskriver vi en enkel och brett tillgängligt mikroskopiteknik att skaffa digital video med hög kvalitet på Drosophila vuxna och larver muterade fenotyper från ett sidoperspektiv.
Abstract
Drosophila melanogaster är ett kraftfullt experimentmodellsystem för att studera funktionen av nervsystemet. Genmutationer som orsakar dysfunktion i nervsystemet producerar ofta lönsamt larver och vuxna som har locomotion defekta fenotyper som är svåra att tillräckligt beskriva med text eller helt utgör en enda fotografisk bild. Nuvarande former av vetenskaplig publicering, dock stödja inlämnandet av digital video medier som kompletterande material att följa ett manuskript. Här beskriver vi en enkel och brett tillgängligt mikroskopi teknik för att förvärva digital video med hög kvalitet på både Drosophila larver och vuxna fenotyper från ett sidoperspektiv. Video av larver och vuxna förflyttning från en sida-vy är fördelaktig eftersom den gör det möjligt för observation och analys av subtila distinktioner och variationer i avvikande lok beteenden. Vi har framgångsrikt använt tekniken för att visualisera och kvantifiera aberrant krypa beteenden i tredje stadiet larver, förutom vuxna muterade fenotyper och beteenden inklusive grooming.
Introduction
Den gemensamma fruktflugan Drosophila melanogaster är ett kraftfullt experimentmodellsystem för att studera funktionen av nervsystemet 1-3. Evolutions bevarande av struktur och funktion i nervsystemet med människor, samt en hög grad av genetisk manipulation och ett brett spektrum av genetiska verktyg gör Drosophila premiären organismen att modellera den mänskliga neurodegenerativa sjukdomar 4. Genmutationer som orsakar dysfunktion i nervsystemet resulterar ofta i livskraftig muterade larver och vuxna Drosophila med nedsatt rörelseförmåga. Fenotyper observerats i nervsystemet defekta mutanter inkluderar nedsatt rörelseförmåga, avvikande samordning och spastiska rörelser hos vuxna, samt underskott i peristaltisk sammandragning av kroppen väggen muskulatur, och partiell förlamning av larver. Dessa fenotyper har utnyttjats i utvecklingen av hög genomströmning genetiska skärmar och locomotion analyser av mutant larver 5, 6 och vuxna 7-10 Drosophila som syftar till att kvantifiera rörelsenedsättning och identifiera gener som är nödvändiga för funktionen av nervsystemet. Även om dessa metoder är mycket användbara för kvantifiering av larver och vuxna lokomotiv beteenden, misslyckas de att förmedla kvalitativ information om varje specifik avvikande beteende. Till exempel, medan mutant tredje stadiet larver kan uppvisa ändrade locomotion parametrar i en beteendeanalys, kan det vara oklart om det är ett resultat av förändringar i rytmiska peristaltiska sammandragningar under krypande cykeln, allmän brist på samordning, eller partiell förlamning av bakre kropps vägg muskulatur. Här beskriver vi en enkel och brett tillgängligt mikroskopi teknik för att förvärva digital video med hög kvalitet på Drosophila vuxna och larver lok fenotyper från ett sidoperspektiv. Digital video förvärvats från en sidoperspektiv möjliggör direkt observation och analys av subtila distinktioner i Locomotive beteenden från en mer informativ sida-view orientering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stereo Mikroskop System
OBS: Även om detta protokoll är lätt att anpassa till nästan vilken stereomikroskopsystem kopplat till en digitalkamera med möjlighet att förvärva video, ges närmare information om det system som används i vårt labb (Table of Materials / utrustning).
- Förvärva digital video med en trinokulärt stereomikroskop kopplad till en kommersiell digitalkamera.
- För att koppla den kommersiella digitalkameran till trinokulärt porten på stereomikroskop, ta bort ½ x C-fäste för fototub porten på stereomikroskop och ersätta den med en 1X C-fäste.
- Montera en digitalkamera kopplare (43 mm gänga) till 1X C-fäste.
- Montera två steg-down ringar, 58 mm till 48 mm och 48 mm till 43 mm, till kamerafäste för att överbrygga anslutningen från digitalkameran kopplingen till en linsadaptersats för digitalkamera.
- Montera digitalkamera till linsadaptersats.
- Förvärva video med mikroskop förstoring och optisk zoom i en digitalkamera som är en kombinerad förstoring på cirka 12X (30 bilder per sekund, 640 x 480 pixlar). Obs: Förstoringen av stereomikroskop måste kompenseras i enlighet med den nyligen konfigureras 1X C-mount i trinokulära hamnen.
2 Imaging Drosophila Tredje Instar Larver
- Tejpa en permanent markör till den svarta bordsplattan av en stereomikroskop kopplad till en digital kamera så att den sida av markören locket upptar ungefär ⅓ till ¼ av den vertikala synfält iakttas i kamerans LCD-monitor. Använd markör toppar som scenen för att utföra larver avbildning eftersom de kommer i ett sortiment av färger som kan användas för att färgkod och differentiera genotyper av larver som avbildas.
- Avgränsa synfältet observerats i den digitala kameran LCD-skärmen på ytan av markör topp med en fin spetsmarkör.
- Välj ett tredje stadiet larv till bilden. Kriterierna för val av tredje stadiet larver var kroppslängd, uppkomst från näringskälla under larvfasen av livscykeln, närvaron av främre och bakre spiracles, och strukturen av mandibular hakar i munnen apparaten 11. Se till att larven är ren genom att tvätta den ordentligt i vatten.
- Belysa permanent markör topp skede ovanifrån med ljus från en fiberoptisk belysningssystemet. Justera vinkeln för infallande ljus för att ge optimal belysning.
- Fokusera mikroskop på kanten av den permanenta markör toppen. Börja skaffa digital video.
- Placera larven på den sida av markören locket approximativt 75 ° bort från den vertikala axeln, strax utanför synfältet, med den främre av larven vänd mot synfältet (fig 1). Obs: Placering av larven på sidan av markören locket gör att kameran kan spela in rörelse the larv från en lateral perspektiv. Det hjälper till att hålla larven fuktigt med vatten så att de inte faller av under ärmen locket. Försiktighet måste iakttas dock att inte använda för mycket vatten eftersom stora mängder kommer att följa larven som det kryper över fältet.
- Försiktigt peta och prod larven med en liten pensel för att tvinga den att krypa tvärs över synfältet. Ha tålamod eftersom larverna sällan samarbeta och ofta måste återlämnas till utgångspunkten många gånger innan de krypa rakt över fältet.
- Spela in ca 10-15 min av oavbruten digitala videofilmer och beskära och ta bort all onödig film efter förvärvet med digital video redigeringsprogram.
3. Imaging vuxna Drosophila
- Placera en enda vuxen Drosophila i en engångs 1,5 ml spektroskopiska polystyren kyvett.
Anm: CO2 narkos av vuxna Drosophila omedelbart före en behavioral analysprotokoll kan äventyra resultatet 12. Det rekommenderas att vuxna Drosophila ges en 24-timmars period för att återhämta sig från CO2 narkos innan du utför i ett beteendetestet 13. - Anslut utgången av kyvetten med en liten bomullsboll. Se till att bomullstuss är packade tätt nog att ockupera storbolags utrymme och begränsar farten till den minskade volymen utrymmet i kyvetten.
- Placera kyvetten på den vita scenen plattan av en stereolupp och korrekt rikta den minskade volymen utrymmet i kyvetten med synfältet observerats i den digitala kamerans LCD-skärm.
- Belys kyvetten uppifrån med ljus från en fiberoptisk belysningssystemet. Justera vinkeln för infallande ljus för att ge optimal belysning.
- Fokusera mikroskop och börja skaffa digital video.
- Spela in ca 30-45 min av oavbruten digitala videofilmer och beskära och ta bort alla onödigatagningar efter förvärvet med digital video redigeringsprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har framgångsrikt använt denna teknik för att förvärva och kvantifiera larver beteende fenotyp i samband med förlust av funktion av stathmin genen (figur 2) 14. Den stathmin genen kodar för ett mikrotubuli reglerprotein som partitioner tubulindimerer från pooler av lösligt tubulin och binder mikrotubuli och främjar deras demontering 15,16. Stathmin funktion krävs för att upprätthålla integriteten i mikrotubuli i axoner i perifera nerver 14. Avbrott i stathmin aktivitet i Drosophila tredje stadiet larver resulterar i en fenotyp där kroppssegment bakre vända uppåt efter varje peristaltisk våg av muskelsammandragning under krypande cykeln. Denna bakre förlamning eller "svans-flip" fenotyp är ett kännetecken för defekt axonal transport. Vi kvantifierat penetrans och svårighetsgraden av den bakre förlamning fenotyp i tredje stadiet larver av sju olika <em> stathmin muterade genotyper genom att mäta vinkeln ovanför horisontell svansen höjdes under krypande cykeln (tabell 1). Larver bestämdes uppvisa en robust svans-flip om svansen höjdes mer än 40 ° över horisontellt när du kryper, en mild svans-flip om svansen höjdes mindre än 40 ° över horisontellt, och ingen svans-flip, om larverna uppvisade en normal krypande beteende.
Figur 1 Position för tredje stadiet larv på en permanent markör cap scen för förvärv av digital video från en sidoperspektiv med hjälp av ett stereomikroskop. Side-vy av en grundläggande stereomikroskop med digital kamera monterad på trinokulära hamnen. Den infällda förstoringen visar orienteringen av en permanent markör tejpade mikroskop scenen och läget för det tredje stadiet larv på markören locket för förvärv av digital video av avvikande beteende ur ett sidoperspektiv. På bilden de tre dimensionerna av utrymmet definieras; x-axeln löper längden av permanent markör och är parallell med mikroskop scenen, är y-axeln vinkelrät mot x-axeln och parallellt med mikroskopets objektbord, och z-axeln är vertikal från markör locket till objektivlinsen och som är vinkelrät mot mikroskopets objektbord. En tredje instar larv placeras på den sida av markören locket approximativt 75 ° bort från den vertikala z-axeln mot y-axeln, strax utanför synfältet för den digitala kameran, med den främre av larven är vänd mot det område som av vyn. Placering av larven på den sida av markören locket tillåter den digitala kameran i stereomikroskop för att registrera rörelse hos larven över fältet från en lateral perspektiv.
ftp_upload / 51981 / 51981fig2highres.jpg "/>
Figur 2. Bilder av representativa resultat. Bilderna från digital video Drosophila larv (A, B) och vuxna (C, D) fenotyper och beteenden förvärvats från en sidoperspektiv. Varje bild är en video stillbild heras från förvärvade digitala videofiler. (A) Vildtyps tredje stadiet larv uppvisar en plan kroppshållning när krypa längs ett substrat. (B) Tredje stadiet larv homozygota för en mutation i genen stathmin uppvisar en avvikande krypande svans-flip beteende, tyder på en förlamning av bakre muskulatur. (C) Vingar vildtyp vuxna Drosophila hålls plant mot kroppen som flugan promenader. (D) vuxna Drosophila, homozygot för en okänd mutation, hålla sina vingar på vinklar ca 45 ° över det normala. Både avvikande larver och vuxna fenotyps som beskrivs är mest observerade och kommunicerade med digital video förvärvats från en lateral sida-view perspektiv. I panel A och B skalan bar = 1 mm. Denna siffra har ändrats från Duncan et al., 2013.
| Svårighetsgraden av Posterior Förlamning Fenotyp | ||||
| Genotyp | n | Ingen Tail-Flip | Mild Tail-Flip (<40 °) | Robust Tail-Flip (> 40 °) |
| vildtyp | 150 | 100,0% (N = 150) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| stai B200 / + | 130 | 100,0% (N = 130) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| Stai rdtp / + | 140 | 100,0% (N = 140) | 0,0% (N =) | 0,0% (N = 0) |
| Df (2L) Exel6015 / + | 120 | 100,0% (N = 120) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| stai B200 | 120 | 23,3% (N = 28) | 23,3% (N = 28) | 53,4% (N = 64) |
| stai B200 / Df (2L) Exel6015 | 101 | 10,9% (N = 11) | 21,8% (N = 22) | 67,3% (N = 68) |
| Stai rdtp | 125 | 16,0% (N = 20) | 32,0% (N = 40) | 52,0% (N = 65) |
| Stai rdtp / Df (2L) Exel6015 | 140 | 7,7% (N = 11) | 23,7% (N = 33) | 68,6% (N = 96) |
Tabell 1 penetrans och svårighetsgraden avposterior paralys fenotypen observeras i stathmin (stai) mutant Drosophila tredje instar larver. The penetrans och svårighetsgraden av den bakre paralys fenotypen av stathmin mutant Drosophila tredje instar larver poängsattes och kvantifierades genom att förvärva digital video av beteende från en lateral perspektiv och mäta vinkeln att svansen höjdes över det horisontella planet krypande under krypande cykeln. Larver poängsattes såsom att ha en robust svans-flip om svansen ökades större än 40 ° över horisontalplanet och en mild svans-flip om svansen höjdes mindre än 40 ° över horisontalplanet. Larver uppvisar ett normalt krypande beteende bedömdes sakna svans-flip. Den krypande beteende av minst hundra larver analyserades för varje testad genotyp. Denna tabell har ändrats från Duncan et al., 2013.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila melanogaster styrka som modellsystem för att studera nervsystemets funktion beror till stor del sammansmältningen av de kraftfulla genetiska verktyg som finns och det breda utbud av robusta beteendeanalyser utvecklas. Här presenterar vi ett enkelt och brett tillgängligt mikroskopi teknik för att förvärva digital video med hög kvalitet på Drosophila vuxna och larver lok fenotyper från ett sidoperspektiv. Vi har framgångsrikt använt denna metod för att karakterisera och kvantifiera svårighetsgraden av bakre förlamning "tail-flip" fenotyper som observerats i neurologiska tredje stadiet larver mutanter genom att direkt mäta den maximala vinkeln att svansen höjdes från den horisontella axeln under krypande cykeln 14. Fördelen med den metod som presenteras här är att video förvärvas från en sidoperspektiv, vilket gör att direkt observation och analys av avvikande lok beteenden, ofta observeras i neurologisk larv ochdult mutanter, från en mer informativ "side-view" orientering. Följaktligen visualisering av peristaltiska muskelsammandragningar i larver Drosophila, och avvikande gång fenotyper i vuxen Drosophila är lättare observeras och analyseras. En begränsning med denna teknik är att det inte är en hög genomströmning tillvägagångssätt. Dessutom kan specifika Drosophila larver och vuxna beteenden endast analyseras för korta löptider tiden på grund av den restriktiva spårningsområdet ges av synfältet för stereomikroskop. Detta kan vara särskilt problematiskt vid förvärv video av vuxna Drosophila beteenden, eftersom volymen av kuvettkammaren är betydligt större än synfältet i stereomikroskop. Vi har tagit upp detta problem genom att använda bomull och kartonginlägg för att minimera kuvettkammaren volymen och begränsa transporterna av den vuxna flyga till ett utrymme som finns i synfältet. Medan majoriteten av vårt imåldrande har fokuserat på neurologiska larv mutanter har vi även använt tekniken för att observera vuxna muterade fenotyper och beteenden, inklusive grooming, vilket tyder på att tekniken lätt kan utökas till att omfatta analys av andra Drosophila beteenden som uppvaktning, parning, och aggression. Det är möjligt att denna teknik skulle kunna vara användbara för att avbilda andra Drosophilidae familjemedlemmar samt andra insekter av liknande storlek. Dessutom skulle mindre modifiering av den teknik som tillåter avbildning av större insektsarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Alexandra Opie för tekniskt stöd och support, James Barton för att tillhandahålla videoberättarröst, och Ramona Flatz och Joellen Sweeney för förekommer i den medföljande videon. Detta arbete stöddes av MJ Murdock Charitable Trust (Grant nr 2.012.205 till JED).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
- Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. Drosophila neurobiology: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Frank, C. A., et al. New approaches for studying synaptic development, function, and plasticity using Drosophila as a model system. J Neurosci. 33, 17560-17568 (2013).
- Mudher, A., Newman, T. Drosophila : a toolbox for the study of neurodegenerative disease. , Taylor & Francis Group. (2008).
- Bilen, J., Bonini, N. M. Drosophila as a model for human neurodegenerative disease. Annu Rev Genet. 39, 153-171 (2005).
- Jakubowski, B. R., Longoria, R. A., Shubeita, G. T. A high throughput and sensitive method correlates neuronal disorder genotypes to Drosophila larvae crawling phenotypes. Fly (Austin). 6, 303-308 (2012).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants). Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 16053-16058 (2003).
- Jahn, T. R., et al. Detection of early locomotor abnormalities in a Drosophila model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 197, 186-189 (2011).
- Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PLoS ONE. 7, e37250 (2012).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (24), (2009).
- Colomb, J., Reiter, L., Blaszkiewicz, J., Wessnitzer, J., Brembs, B. Open source tracking and analysis of adult Drosophila locomotion in Buridan's paradigm with and without visual targets. PLoS ONE. 7, e42247 (2012).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. (1965).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics.. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Duncan, J. E., Lytle, N. K., Zuniga, A., Goldstein, L. S. The Microtubule Regulatory Protein Stathmin Is Required to Maintain the Integrity of Axonal Microtubules in Drosophila. 8, e683244 (2013).
- Belmont, L. D., Mitchison, T. J. Identification of a protein that interacts with tubulin dimers and increases the catastrophe rate of microtubules. Cell. 84, 623-631 (1996).
- Cassimeris, L.
