Summary
Aqui nós descrevemos uma técnica de microscopia simples e amplamente acessível para a aquisição de vídeo digital de alta qualidade de Drosophila adulto e fenótipos mutantes larvais de uma perspectiva lateral.
Abstract
Drosophila melanogaster é um poderoso sistema de modelo experimental para o estudo da função do sistema nervoso. As mutações genéticas que causam a disfunção do sistema nervoso muitas vezes produzem larvas viáveis e adultos que têm locomoção fenótipos defeituosos que são difíceis de descrever adequadamente com texto ou representar completamente com uma imagem fotográfica única. Atuais modos de publicação científica, no entanto, apoiar a apresentação de mídia de vídeo digital como material suplementar para acompanhar um manuscrito. Aqui nós descrevemos uma técnica de microscopia simples e amplamente acessível para a aquisição de vídeo digital de alta qualidade de ambos os fenótipos de Drosophila larvas e adultos a partir de uma perspectiva lateral. Vídeo de locomoção das larvas e adultos a partir de uma visão lateral é vantajosa porque permite a observação e análise das distinções sutis e variações nos comportamentos aberrantes de locomotivas. Temos utilizado com sucesso a técnica de visualizar e quantificar aberrant rastejando comportamentos em larvas de terceiro estádio, além de fenótipos e comportamentos mutantes adultos incluindo o grooming.
Introduction
A fruta comum mosca Drosophila melanogaster é um poderoso sistema de modelo experimental para o estudo da função do sistema nervoso 1-3. Conservação evolutiva da estrutura e função do sistema nervoso, com os seres humanos, assim como a facilidade da manipulação genética e uma vasta variedade de ferramentas genéticas torna o organismo Drosophila estreia para modelar doenças neurodegenerativas humano 4. As mutações genéticas que causam disfunção do sistema nervoso, muitas vezes resultam em larvas mutante viável e adulto de Drosophila com locomoção diminuída. Fenótipos observados no sistema nervoso mutantes defeituosos incluem taxa de locomoção, coordenação aberrante, e os movimentos espásticas em adultos, assim como os défices de contracção peristáltica da musculatura da parede do corpo, e paralisia parcial de larvas reduzida. Estes fenótipos foram explorados no desenvolvimento de telas genéticas de alto rendimento e ensaios de locomoção das larvas 5 mutante, 6 e adulto de Drosophila 7-10 destina-se a quantificar a disfunção locomoção e a identificação de genes necessários para a função do sistema nervoso. Embora essas abordagens são extremamente úteis para quantificar comportamentos locomotiva larvas e adultos, eles não conseguem transmitir informações qualitativas sobre cada comportamento aberrante específico. Por exemplo, enquanto as larvas de terceiro estádio mutante pode apresentar parâmetros de locomoção alterados em um ensaio comportamental, pode não ser claro se este é o resultado de alterações nas contrações peristálticas rítmicas durante o ciclo de rastreamento, em geral falta de coordenação ou paralisia parcial do corpo posterior musculatura da parede. Aqui nós descrevemos uma técnica de microscopia simples e amplamente acessível para a aquisição de vídeo digital de alta qualidade de Drosophila adulto e fenótipos locomotiva larvais de uma perspectiva lateral. O vídeo digital adquirido de uma perspectiva lateral, permite a observação direta e análise de distinções sutis em locomotive comportamentos de uma orientação mais informativa visão lateral.
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Protocol
1 O sistema de microscópio estéreo
Nota: Apesar de este protocolo é facilmente adaptável a praticamente qualquer sistema de microscópio estéreo acoplado a uma câmera digital com a capacidade de adquirir vídeo, são fornecidos detalhes sobre o sistema utilizado em nosso laboratório (Tabela de Materiais / Equipamentos).
- Adquirir vídeo digital utilizando um microscópio estéreo trinocular acoplado a uma câmera digital comercial.
- A fim de acoplar a câmera digital comercial à porta trinocular do microscópio estéreo, remova o ½x C-mount do porto fototubo do microscópio estéreo e substituí-lo por um 1X C-mount.
- Montar um acoplador câmera digital (43 mm Rosca) ao 1X C-mount.
- Monte dois anéis abaixadoras, 58 mm a 48 mm, e 48 mm a 43 mm, para o acoplador câmera para colmatar a conexão da câmera digital a um acoplador kit adaptador de lente para a câmera digital.
- Monte a câmera digital para o kit adaptador de lente.
- Adquirir vídeo com a ampliação do microscópio e zoom óptico da câmera digital definida para uma ampliação combinada de cerca de 12X (30 quadros por segundo, 640 x 480 pixels). Nota: A ampliação do microscópio estéreo deve ser compensado de acordo com o recém-reconfigurado 1X C-mount da porta trinocular.
2 Imagem Drosophila terceiro instar Larvas
- Tape um marcador permanente para a placa preta palco de um microscópio estéreo acoplado a uma câmera digital, de modo que o lado da tampa marcador ocupa cerca de ⅓ a ¼ do campo de visão vertical observado no monitor LCD da câmera. Use tops de marcadores como o palco para realizar imagem larval porque eles vêm em uma variedade de cores que pode ser usado para código de cor e diferenciar os genótipos de larvas sendo fotografada.
- Delimitar o campo de visão observada no monitor LCD da câmara digital na superfície do topo do marcador com uma ponta finamarcador.
- Selecione uma terceira larva instar a imagem. Os critérios para a selecção de larvas de terceiro instar é o comprimento do corpo, a emergência da fonte de alimentação durante a fase larval do ciclo de vida, a presença dos anteriores e posteriores espiráculos, e a estrutura dos ganchos inferiores do aparelho de boca 11. Garantir a larva está limpo, lavando-o bem em água.
- Iluminar o palco marcador permanente topo a partir de cima com a luz a partir de um sistema de iluminação de fibra óptica. Ajuste o ângulo da luz incidente para proporcionar a iluminação ideal.
- Concentre o microscópio sobre a borda de topo marcador permanente. Comece a aquisição de vídeo digital.
- Coloque a larva do lado da tampa de marcador de aproximadamente 75 ° a partir do eixo vertical, fora do campo de visão, sendo o anterior da larva virado para o campo de visão (figura 1). Observação: Colocação da larva no lado da tampa de marcador permite que a câmara da ficha movimento the larva de uma perspectiva lateral. Ela ajuda a manter a larva úmido com água, para que não caia do lado da tampa do marcador. Deve ser tomado cuidado, porém, para não usar muita água, como quantidades excessivas vai aderir à larva como rasteja em todo o campo.
- Gentilmente cutucar a larva com um pequeno pincel para forçá-lo a engatinhar em todo o campo de visão. Seja paciente como as larvas raramente cooperam e muitas vezes tem que ser devolvido ao ponto de partida muitas vezes antes que rastejar em frente do campo.
- Grave aproximadamente 10-15 min de vídeo ininterrupto e cultura digital e remover todas as filmagens desnecessária pós-aquisição com software de edição de vídeo digital.
3 Imagens Adulto Drosophila
- Coloque um único adulto Drosophila num descartável 1,5 ml tina espectroscópica de poliestireno.
Nota: CO 2 para anestesia de adulto Drosophila imediatamente antes de uma behavprotocolo de análise ioral pode comprometer os resultados 12. É recomendado que adultos Drosophila dispor de um prazo de 24 horas para se recuperar de CO 2 para anestesia antes de executar em um teste comportamental 13. - Ligue o final da cuvete com uma pequena bola de algodão. Garantir a bola de algodão é embalado apertado o suficiente para ocupar o espaço grande boné e limita a voar para o compartimento volume reduzido da tina.
- Coloque a tina na placa de fase branca de um microscópio estéreo e alinhar adequadamente o compartimento de volume reduzido da tina com o campo de visão observada no monitor LCD da câmara digital.
- Iluminar o cadinho a partir de cima com a luz a partir de um sistema de iluminação de fibra óptica. Ajuste o ângulo da luz incidente para proporcionar a iluminação ideal.
- Concentre-se o microscópio e começar a adquirir vídeo digital.
- Grave aproximadamente 30-45 min de vídeo ininterrupto e cultura digital e remover todos os desnecessárioscenas pós-aquisição com software de edição de vídeo digital.
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Representative Results
Nós utilizamos com sucesso desta técnica para adquirir e quantificar o fenótipo comportamental larval associada com a perda de função do gene stathmin (Figura 2) 14. O gene codifica uma proteína stathmin regulamentar microtúbulos que particiona dímeros de tubulina de piscinas de tubulina solúvel, e liga os microtúbulos e promove a sua desmontagem 15,16. Stathmin função é necessária para manter a integridade dos microtúbulos nos axónios dos nervos periféricos 14. A interrupção da actividade de Drosophila stathmin resultados larvas de terceira instar de um fenótipo de em que os segmentos de corpos posteriores virar para cima depois de cada onda peristáltica da contracção muscular durante o ciclo de rastreamento. Essa paralisia posterior ou fenótipo "cauda-flip 'é uma marca do transporte axonal defeito. Foram quantificados o penetrância e gravidade do fenótipo paralisia posterior em larvas de terceiro estádio de sete diferentes <em> stathmin genótipos mutantes através da medição do ângulo horizontal acima da cauda foi levantada durante o ciclo de rastreamento (Tabela 1). Larvas foram determinados para apresentar uma robusta cauda flip-se a cauda foi levantado mais de 40 ° acima da horizontal quando o rastreamento, uma leve cauda flip-se a cauda foi levantada a menos de 40 ° acima da horizontal, e não cauda flip-se as larvas apresentaram um comportamento normal rastreamento.
Figura 1 Posição do terceiro instar larva em um estágio de capuz marcador permanente para aquisição de vídeo digital a partir de uma perspectiva lateral usando um microscópio estéreo. Visão lateral de um sistema básico de microscópio estéreo com câmera digital montada na porta trinocular. A ampliação inserção mostra a orientação de um marcador permanente colado na platina do microscópio e a posição de o terceiro instar larva na tampa marcador para aquisição de vídeo digital de comportamento aberrante de uma perspectiva lateral. Na imagem os de três dimensões do espaço são definidos; o eixo-x atravessa o comprimento do marcador permanente e está paralela à platina do microscópio, o eixo y perpendicular ao eixo x e paralelo a platina do microscópio, e o eixo z é vertical a partir da tampa do marcador para o lente objectiva e perpendicular a platina do microscópio. Uma larva de terceiro instar é colocado no lado da tampa de marcador de aproximadamente 75 ° de distância a partir do eixo Z vertical, em direcção do eixo y, do lado de fora do campo de visão da câmara digital, com o anterior da larva virado para o campo de vista. Colocação da larva no lado da tampa de marcador permite que a câmara digital do microscópio estéreo para gravar o movimento da larva por todo o campo de uma perspectiva lateral.
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Figura 2: Imagens de resultados representativos. Imagens representativas de vídeo digital de Drosophila larva (A, B) e adulto (C, D) fenótipos e comportamentos adquiridos a partir de uma perspectiva lateral. Cada imagem é um vídeo ainda quadro extraído de arquivos de vídeo digitais adquiridas. (A) tipo selvagem larva de terceiro instar apresentam uma postura corporal plana quando arrastando um substrato. (B) terceiro instar larva homozigotos para uma mutação no gene exposição stathmin um rastreamento aberrante comportamento cauda-flip, indicativo de uma paralisia da musculatura posterior. (C) As asas de tipo selvagem adulto Drosophila são realizadas encostado ao corpo, como a mosca anda. (D) Adulto Drosophila, homozigotos para uma mutação desconhecida, mantenha suas asas a ângulos de aproximadamente 45 ° acima do normal. Ambos aberrante fenótipo larval e adultos descritas são melhor observados e comunicados com vídeo digital adquirido a partir de uma perspectiva lateral, lateral-view. No painel A e B a barra de escala = 1 mm. Este valor foi modificado de Duncan et al., 2013.
| Gravidade do Posterior Paralisia Fenótipo | ||||
| Genótipo | n | No Tail-Flip | Leve Rabo-Flip (<40 °) | Robust Cauda-Flip (> 40 °) |
| wildtype | 150 | 100,0% (N = 150) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| stai B200 / + | 130 | 100,0% (N = 130) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| stai rdtp / + | 140 | 100,0% (N = 140) | 0,0% (N =) | 0,0% (N = 0) |
| Df (2L) Exel6015 / + | 120 | 100,0% (N = 120) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| stai B200 | 120 | 23,3% (N = 28) | 23,3% (N = 28) | 53,4% (N = 64) |
| stai B200 / Df (2L) Exel6015 | 101 | 10,9% (N = 11) | 21,8% (N = 22) | 67,3% (N = 68) |
| stai rdtp | 125 | 16,0% (N = 20) | 32,0% (N = 40) | 52,0% (N = 65) |
| stai rdtp / Df (2L) Exel6015 | 140 | 7,7% (N = 11) | 23,7% (N = 33) | 68,6% (N = 96) |
Tabela 1 Penetrância e gravidade daposterior paralisia fenótipo observado na stathmin (stai) Drosophila larvas de terceira instar de mutante. penetrância A e gravidade do fenótipo paralisia posterior stathmin Drosophila larvas de terceira instar de mutante foi marcado e quantificado através da aquisição de vídeo digital do comportamento de uma perspectiva lateral e a medição do ângulo que a cauda foi elevado acima do plano horizontal rastreamento durante o ciclo de rastreamento. As larvas foram classificados como tendo uma forte cauda flip-se a cauda foi elevada superior a 40 ° acima do plano horizontal e uma leve cauda flip-se a cauda foi levantada a menos de 40 ° acima do plano horizontal. Larvas exibindo um comportamento normal rastreamento foram marcados como não tendo rabo-flip. O comportamento de rastejamento de pelo menos uma centena de larvas foi analisado para cada genótipo testado. Este quadro foi modificado a partir de Duncan et al., 2013.
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Discussion
Força Drosophila melanogaster 's como um sistema modelo para estudar a função do sistema nervoso deriva em grande parte da convergência das poderosas ferramentas genéticas disponíveis e da ampla gama de ensaios comportamentais robustos desenvolvidos. Aqui apresentamos uma técnica de microscopia simples e amplamente acessível para a aquisição de vídeo digital de alta qualidade de Drosophila adulto e fenótipos locomotiva larvais de uma perspectiva lateral. Temos utilizado com sucesso esta abordagem para caracterizar e quantificar a gravidade da paralisia posterior "cauda-flip 'fenótipos observados no terceiro instar larval mutantes neurológicos por medição direta do ângulo máximo que a cauda foi criado a partir do eixo horizontal durante o ciclo de rastreamento 14. A vantagem da abordagem aqui apresentada é que o vídeo é adquirido a partir de uma perspectiva lateral, permitindo a observação direta e análise de comportamentos aberrantes de locomotivas, muitas vezes observada em neurológicas das larvas e umadult mutantes, a partir de uma orientação mais informativa 'side-view'. Consequentemente, a visualização de contrações musculares peristálticas em larval Drosophila, e fenótipos aberrantes em marcha adulto Drosophila são mais facilmente observadas e analisadas. Uma limitação desta técnica é que não é uma abordagem de alto rendimento. Além disso, larvas e adultos de Drosophila comportamentos específicos só pode ser analisado por curtos períodos de tempo, devido à área restritiva rastreamento proporcionada pelo campo de visão do microscópio estéreo. Isto pode ser particularmente problemático quando a aquisição de vídeo de comportamentos de Drosophila adulta, como o volume da câmara de cuba é significativamente maior do que o campo de visão do microscópio estéreo. Nós têm abordado este problema através da utilização de algodão e papelão inserções para minimizar o volume da câmara de cuba e restringir o movimento da mosca adulta a um espaço contido dentro do campo de visão. Enquanto a maioria dos nossos imenvelhecimento tem se concentrado em mutantes larvais neurológicos, também usaram a técnica para observar adultos fenótipos e comportamentos mutantes, incluindo preparação, o que sugere que a técnica pode ser facilmente expandido para incluir a análise de outros comportamentos de Drosophila como namoro, cópula e agressão. É possível que esta técnica pode ser útil para imagiologia de outros membros da família Drosophilidae, bem como outros insectos de tamanho semelhante. Além disso, uma pequena modificação da técnica de imagiologia que permitem que espécies de insectos de maiores dimensões.
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Disclosures
Os autores declaram que não existem interesses conflitantes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Alexandra Opie para assistência técnica e apoio, James Barton para fornecer vídeo narração e Ramona Flatz e Joellen Sweeney para aparecer no vídeo em anexo. Este trabalho foi financiado pela Fundação de Caridade MJ Murdock (Grant n º 2012205 para JED).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
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