Summary
Hier beschreiben wir eine einfache und allgemein zugänglich Mikroskopietechnik, um hochwertige digitale Video von Drosophila Erwachsenen-und Larven Phänotypen aus einer seitlichen Perspektive zu erwerben.
Abstract
Drosophila melanogaster ist eine leistungsfähige experimentelle Modellsystem zur Untersuchung der Funktion des Nervensystems. Gen-Mutationen, die Funktionsstörungen des Nervensystems verursachen produzieren häufig lebensfähigen Larven und Erwachsene, die Fortbewegung defekt Phänotypen, die schwierig ist, ausreichend mit Text beschreiben oder vollständig mit einem einzigen fotografischen Bild darstellen, sind zu haben. Aktuelle Modi des wissenschaftlichen Publizierens, unterstützen jedoch die Vorlage von digitalen Video-Medien als ergänzendes Material, ein Manuskript zu begleiten. Hier beschreiben wir eine einfache und allgemein zugänglich Mikroskopietechnik für den Erwerb von qualitativ hochwertigen digitalen Video beider Drosophila Larven und erwachsene Phänotypen aus einer seitlichen Perspektive. Video der Larven und erwachsene Fortbewegung aus einer Seitenansicht ist von Vorteil, weil sie die Beobachtung und Analyse der feinen Unterschiede und Variationen in abweichenden Lokomotive Verhaltensweisen. Wir haben erfolgreich die Technik zur Visualisierung und Quantifizierung aberrant kriechen Verhaltensweisen in Drittlarvenstadium, zusätzlich zu Erwachsenen Phänotypen und Verhaltensweisen einschließlich Pflege.
Introduction
Die gemeinsame Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist eine leistungsfähige experimentelle Modellsystem zur Untersuchung der Funktion des Nervensystems 1-3. Evolutionären Erhaltung der Struktur und Funktion des Nervensystems beim Menschen, als auch einfache genetische Manipulation und eine Vielzahl von genetischen Werkzeugen macht Drosophila die Premiere Organismus der menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen 4 modellieren. Gen-Mutationen, die Funktionsstörungen des Nervensystems verursachen führen oft in lebensfähigen Mutanten Larven und adulte Drosophila mit eingeschränkter Fortbewegung. In Nervensystem Mutanten beobachteten Phänotypen sind reduzierte Geschwindigkeit der Fortbewegung, anomale Koordination und spastischen Bewegungen bei Erwachsenen, als auch Defizite in peristaltische Kontraktion der Muskulatur der Körperwand und teilweise Lähmung der Larven. Diese Phänotypen in der Entwicklung von Hochdurchsatz-genetischen Screens und Fortbewegung Assays Mutante Larven 5 ausgenutzt, 6 und Erwachsenen 7-10 Drosophila bei der Quantifizierung der Fortbewegung Wertminderung und die Identifizierung für die Funktion des Nervensystems notwendigen Gene abzielen. Während diese Ansätze sind äußerst nützlich für die Quantifizierung Larven und Erwachsenen Lokomotive Verhaltensweisen, versagen sie auf qualitative Informationen über die einzelnen spezifischen abweichendes Verhalten zu vermitteln. Zum Beispiel, während Mutante dritten Larvenstadium kann die Fortbewegung veränderten Parameter in einem Verhaltenstest zeigen, kann es unklar sein, wenn dies das Ergebnis von Veränderungen in rhythmischen Kontraktionen während der Schlauch Crawling Zyklus, allgemeine Mangel an Koordination oder teilweise Lähmung der hinteren Körper Wandmuskulatur. Hier beschreiben wir eine einfache und allgemein zugänglich Mikroskopietechnik für den Erwerb von qualitativ hochwertigen digitalen Video von Drosophila Erwachsenen-und Larven Lokomotive Phänotypen aus einer seitlichen Perspektive. Digitale Videosignale von einer seitlichen Perspektive erworben erlaubt die direkte Beobachtung und Analyse der feinen Unterschiede in Locomotive Verhaltensweisen von einem aussageSeitenAnsicht Orientierung.
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Protocol
1. Die Stereomikroskopsystem
Anmerkung: Obwohl dieses Protokoll einfach an praktisch jedem Stereomikroskopsystem mit der Fähigkeit zum Erfassen Video in einer Digitalkamera gekoppelt ist, werden die Details von der in unserem Labor verwendet (Tabelle Materialien / Equipment) System.
- Erwerben Sie digitale Videos mit einer trinokularen Stereomikroskop zu einem kommerziellen Digitalkamera gekoppelt ist.
- Zur Kopplung des kommerziellen Digitalkamera an den trinokularen Anschluss des Stereo-Mikroskop, entfernen Sie die ½x C-Mount-Anschluss der Photozelle des Stereomikroskops und ersetzen Sie es mit einem 1X C-Mount.
- Montieren Sie eine Digitalkamera Koppler (43 mm Gewinde) an die 1X C-Mount.
- Halterung zwei Abwärts-Ringe, 58 mm bis 48 mm und 48 mm bis 43 mm, zu der Kamera-Koppler, um die Verbindung von der Digitalkamera Koppler an einem Linsenadaptersatz für die digitale Kamera brücken.
- Montieren Sie die Digitalkamera an den Objektiv-Adapter-Kit.
- Erwerben Video mit dem Mikroskop Vergrößerung und optischen Zoom der Digitalkamera-Set für eine kombinierte Vergrößerung von ca. 12x (30 Bilder pro Sekunde, 640 x 480 Pixel). Hinweis: Die Vergrößerung des Stereomikroskops muss in Übereinstimmung mit der neu rekonfiguriert 1X C-Mount-Anschluss des trinokularen kompensiert werden.
2. Imaging Drosophila Dritte Larvenstadium
- Band ein Permanent-Marker auf die schwarze Tischplatte von einem Stereomikroskop mit einer digitalen Kamera gekoppelt, so dass die Seite der Marker Kappe nimmt etwa ⅓ auf ¼ der vertikalen Bereich der in der Kamera LCD-Monitor beobachtet Blick. Verwenden Sie Marker Spitzen wie die Bühne, um Larven Bildgebung durchzuführen, weil sie in einer Auswahl von Farben, die Farbcode verwendet werden kann und differenzieren die Genotypen von Larven, die abgebildet sind.
- Grenzen den Bereich der in der Digitalkamera LCD-Monitor auf der Oberfläche des Markers oben beobachtet Ansicht mit einer feinen SpitzeMarker.
- Wählen Sie einen dritten Larvenstadium zu Bild. Die Kriterien für die Auswahl der dritten Larvenstadium war Körperlänge Austritt aus der Nahrungsmittelquelle während des Larven Phase des Lebenszyklus, die Anwesenheit von vorderen und hinteren Luftlöcher, und die Struktur der Unterkiefer Haken des Mundvorrichtung 11. Stellen Sie sicher, die Larve ist sauber durch Waschen Sie es gründlich in Wasser.
- Beleuchten den Permanentmarker obersten Stufe von oben mit Licht aus einem Glasfaser-Beleuchtungssystem. Stellen Sie den Winkel des einfallenden Lichts, um eine optimale Ausleuchtung sorgen.
- Fokussieren Sie das Mikroskop auf dem Rand des Permanentmarker Spitze. Beginnen Erfassen digitaler Video.
- Legen Sie die Larve auf der Seite der Marker Kappe ca. 75 ° von der vertikalen Achse, etwas außerhalb des Blickfeldes, mit dem vorderen der Larve zugewandten Sichtfeld (Abbildung 1). Hinweis: Die Platzierung der Larve auf der Seite des Markers Kappe ermöglicht die Kamera auf Bewegung thE-Larve aus einer seitlichen Perspektive. Es hilft, die Larve mit Wasser feucht zu halten, damit sie nicht herunterfallen die Seite der Marker Kappe. Vorsicht ist jedoch, nicht zu viel Wasser, wie übermäßige Mengen werden der Larve halten, wie es über das Feld kriecht.
- Sanft zu stoßen und prod die Larve mit einem kleinen Pinsel, um sie zu zwingen, in das Blickfeld zu kriechen. Geduld, da die Larven nur selten zusammenarbeiten und müssen oft an den Ausgangspunkt zurückgebracht werden viele Male, bevor sie gerade über das Feld zu kriechen.
- Rekord ca. 10-15 min ununterbrochenen digitalen Videomaterial und Pflanzen und entfernen Sie alle unnötigen Material nach der Übernahme mit digitalen Video-Editing-Software.
3. Imaging Erwachsene Drosophila
- Legen Sie eine einzelne erwachsenen Drosophila in einer Wegwerf 1,5 ml Polystyrol spektroskopischen Küvette.
Hinweis: CO 2 Betäubung von erwachsenen Drosophila unmittelbar vor einer BehavtensAnalyseProtokoll kann Ergebnisse 12 beeinträchtigen. Es wird empfohlen, dass erwachsene Drosophila eine 24-Stunden-Zeitraum gegeben, um von CO 2 Betäubung erholen, bevor Sie in einem Verhaltenstest 13 werden. - Stecken Sie das Ende der Küvette mit einem kleinen Wattebausch. Sicherstellen, dass der Wattebausch ist fest genug, um die große Kappenraum besetzen verpackt und beschränkt die Fliege auf das reduzierte Volumen Fach der Küvette.
- Setzen Sie die Küvette auf der weißen Tischplatte von einem Stereomikroskop und richten das reduzierte Volumen Fach der Küvette mit dem Gebiet der in der Digitalkamera LCD-Monitor beobachtet Blick.
- Beleuchten die Küvette von oben mit Licht aus einem Lichtwellenleiter-Beleuchtungssystem. Stellen Sie den Winkel des einfallenden Lichts, um eine optimale Ausleuchtung sorgen.
- Fokus des Mikroskops und beginnen Erfassung digitaler Video.
- Rekord ca. 30-45 min ununterbrochenen digitalen Videomaterial und Pflanzen und entfernen Sie alle unnötigenVideo nach dem Erwerb mit digitalen Video-Editing-Software.
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Representative Results
Wir haben erfolgreich diese Technik zur Erfassung und Quantifizierung der Larven Verhaltensphänotyp mit Verlust der Funktion des Gens Stathmin (Figur 2) 14 verbunden. Das Gen kodiert für ein Stathmin Mikrotubuli regulatorisches Protein, das Tubulindimeren Partitionen von Pools von löslichen Tubulin und Mikrotubuli bindet und fördert ihre Demontage 15,16. Stathmin Funktion ist erforderlich, um die Integrität des Mikrotubuli in den Axonen von peripheren Nerven 14 aufrechtzuerhalten. Störung der Stathmin Aktivität in Drosophila dritten Larvenstadium Ergebnisse in einem Phänotyp, in dem die hinteren Körpersegmente nach oben drehen nach jeder peristaltischen Welle der Muskelkontraktion während des Crawling-Zyklus. Das hintere Lähmung oder 'tail-Flip' Phänotyp ist ein Markenzeichen von defekten axonalen Transport. Quantifizierten wir die Penetranz und Schwere der hinteren Lähmung Phänotyp dritten Larvenstadium von sieben verschiedenen <em> Stathmin mutierten Genotypen durch die Messung der Winkel über die Horizontale der Schwanz wurde während des Crawling-Zyklus (Tabelle 1) angehoben. Larven wurden bestimmt, um eine robuste Schwanz-Flip zeigen, wenn der Schwanz mehr als 40 ° über der Horizontalen beim Crawlen, ein mildes tail-Flip, wenn der Schwanz weniger als 40 ° über die Horizontale angehoben, und kein Schwanz-Flip ausgelöst, wenn die Larven ausgestellt eine normale Krabbel Verhalten.
Abbildung 1. Position der dritten Larvenstadium auf einem Permanent-Marker Kappe Bühne für den Erwerb von digitalen Video aus einer seitlichen Perspektive mit einem Stereomikroskop. Seitenansicht eines Grund Stereo-Mikroskop mit digitaler Kamera montiert am trinokularen Port. Der Einschub Vergrößerung zeigt die Ausrichtung der einem Permanentmarker auf den Mikroskoptisch aufgenommen und die Position des das dritte Larvenstadium auf den Marker Kappe für den Erwerb von digitalen Video abweichendes Verhalten aus einer seitlichen Perspektive. Im Bild die drei Dimensionen des Raums definiert; die x-Achse verläuft entlang der permanenten Markierung und parallel zu dem Mikroskoptisch ist die y-Achse senkrecht zur x-Achse und parallel zu der Objekttisch und die z-Achse vertikal von der Markierung auf der Kappe Objektivlinse und senkrecht zu der Objekttisch. Ein drittes Larvenstadium auf der Seite der Markierung Kappe ungefähr 75 ° von der vertikalen z-Achse in Richtung der y-Achse außerhalb des Sichtfeldes der Digitalkamera angeordnet ist, mit der vorderen der Larve zugewandten Bereich Sicht. Platzierung der Larve auf der Seite der Markerkappe ermöglicht die digitale Kamera des Stereomikroskops auf eine Bewegung der Raupe über das Feld von einer seitlichen Perspektive zu erfassen.
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Abbildung 2. Bilder von repräsentativen Ergebnissen. Repräsentative Bilder von Digital-Video von Drosophila Larve (A, B) und Erwachsenen (C, D) Phänotypen und Verhaltensweisen aus einer seitlichen Perspektive erworben. Jedes Bild ist ein Video noch von erworbenen digitalen Video-Dateien extrahiert Rahmen. (A) Wildtyp dritten Larvenstadium weisen eine flache Körperhaltung beim Crawlen entlang einem Substrat. (B) Drittes Larvenstadium homozygot für eine Mutation im Gen Stathmin weisen eine anomale Krabbeln Schwanz-Flip Verhalten, was auf einer Lähmung der hinteren Muskulatur. (C) Die Flügel des Wildtyp erwachsenen Drosophila gegen den Körper flach gehalten, wie die Fliege geht. (D) Erwachsene Drosophila, die homozygot für eine unbekannte Mutation, halten ihre Flügel an Winkel etwa 45 ° über normal. Sowohl abweichende Larven und Erwachsenen Phänotyps beschrieben sind am besten beobachtet und mit digitalen Videodaten von einer lateralen Seitenansicht perspektivische erworben kommuniziert. In Feld A und B der Skala bar = 1 mm. Diese Zahl hat sich von Duncan et al geändert. 2013.
| Schwere der Lähmung der hinteren Phänotyp | ||||
| Genotyp | n | Kein Schwanz-Flip | Mild Schwanz-Flip (<40 °) | Robust Schwanz-Flip (> 40 °) |
| Wildtyp | 150 | 100,0% (N = 150) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| stai B200 / + | 130 | 100,0% (N = 130) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| stai rdtp / + | 140 | 100,0% (N = 140) | 0,0% (N =) | 0,0% (N = 0) |
| Df (2L) Exel6015 / + | 120 | 100,0% (N = 120) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| stai B200 | 120 | 23,3% (N = 28) | 23,3% (N = 28) | 53,4% (N = 64) |
| stai B200 / Df (2L) Exel6015 | 101 | 10,9% (N = 11) | 21,8% (N = 22) | 67,3% (N = 68) |
| stai rdtp | 125 | 16,0% (N = 20) | 32,0% (N = 40) | 52,0% (N = 65) |
| stai rdtp / Df (2L) Exel6015 | 140 | 7,7% (N = 11) | 23,7% (N = 33) | 68,6% (N = 96) |
Tabelle 1. Penetranz und Schwere derposterior in Stathmin beobachtet (Stai) Mutante von Drosophila dritten Larvenstadium Lähmung Phänotyp. Die Penetranz und Schwere der hinteren Lähmung Phänotyp der Drosophila Stathmin Mutante dritten Larvenstadium wurde erzielt und durch Erfassen digitaler Video des Verhaltens von einer seitlichen Perspektive und den Winkel quantifiziert dass der Schwanz über der horizontalen Ebene Crawling während des Crawling-Zyklus erhöht. Larven wurden mit einem robusten Schwanz-Flip wenn der Schwanz war größer als 40 ° über der horizontalen Ebene und einer milden Schwanz-Flip ausgelöst, wenn der Schwanz weniger als 40 ° über der Horizontalebene angehoben hat. Larven, die einen normalen Crawling Verhalten wurden als mit keinen Schwanz-Flip erzielt. Die Crawling Verhalten mindestens hundert Larven wurden für jede getestete Genotyp analysiert. Diese Tabelle wurde von Duncan et al geändert. 2013.
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Discussion
Drosophila melanogaster 's Stärke als ein Modellsystem für die Untersuchung Funktion des Nervensystems stammt weitgehend aus der Konvergenz der mächtigen genetische Werkzeuge zur Verfügung, und die breite Palette von robusten Verhaltenstests entwickelt. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und allgemein zugänglich Mikroskopietechnik für den Erwerb von qualitativ hochwertigen digitalen Video von Drosophila Erwachsenen-und Larven Lokomotive Phänotypen aus einer seitlichen Perspektive. Wir haben diesen Ansatz erfolgreich zur Charakterisierung und Quantifizierung der Schwere der hinteren Lähmung 'tail-Flip "in neurologischen dritten Larvenstadium Larven Mutanten durch direkte Messung der maximale Winkel, dass der Schwanz wurde von der horizontalen Achse während der Krabbel Zyklus 14 angehoben beobachteten Phänotypen. Der Vorteil der hier vorgestellte Ansatz ist, dass Video wird von einer seitlichen Perspektive erworben, so dass die direkte Beobachtung und Analyse von abweichenden Verhaltensweisen Lokomotive, oft in neurologischen Larven und beobachtetDult Mutanten, von einem aussage 'Seitenansicht' Orientierung. Folglich Visualisierung von peristaltische Muskelkontraktionen im Larven Drosophila, und anomale Gang Phänotypen bei erwachsenen Drosophila werden leichter beobachtet und analysiert. Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass es nicht ein Hochdurchsatz-Ansatz. Zusätzlich spezifischen Drosophila Larven und erwachsene Verhalten kann nur für kurze Zeitdauern aufgrund der restriktiven Verfolgungsbereich des Sichtfeldes des Stereomikroskops ergab analysiert werden. Dies kann besonders problematisch sein, wenn Video Erfassen von erwachsenen Drosophila Verhalten, wie das Volumen der Küvette Kammer wesentlich größer ist als das Sichtfeld des Stereomikroskops. Wir haben dieses Problem durch die Verwendung Baumwolle und Kartoneinlagen, die Küvette Kammervolumen zu minimieren und beschränken die Bewegung der Erwachsenen fliegen, um einen Raum innerhalb des Sichtfeldes enthalten gerichtet. Während die Mehrheit der imAltern hat sich auf neurologische Larven Mutanten konzentriert, haben wir auch die Technik, um Erwachsenen Phänotypen und Verhaltensweisen, einschließlich Pflege zu beobachten, was darauf hindeutet, dass die Technik kann leicht erweitert werden, um Analyse anderer Drosophila Verhaltensweisen wie Balz, Kopulation und Aggression sind. Es ist möglich, dass diese Technik zur Abbildung von anderen Drosophilidae Familienmitglieder sowie andere Insekten vergleichbarer Größe sein. Zusätzlich würde geringfügige Modifikation der Technik Bildgebung von größeren Insektenarten zu ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Die Autoren möchten sich Alexandra Opie für technische Hilfe und Unterstützung, James Barton für die Bereitstellung von Video-Erzählung anerkennen und Ramona Flatz und Joellen Sweeney für im zugehörigen Video erscheinen. Diese Arbeit wurde von der MJ Murdock Charitable Trust (Grant No 2012205 zu JED) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
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