Summary
Her beskriver vi en enkel og allment tilgjengelig mikros teknikk for å skaffe høy kvalitet digital video av Drosophila voksen og larve mutante fenotyper fra en lateral perspektiv.
Abstract
Drosophila melanogaster er en kraftig eksperimentelt modellsystem for å studere funksjonen av nervesystemet. Genmutasjoner som forårsaker dysfunksjon i nervesystemet ofte produsere levedyktig larver og voksne som har locomotion defekte fenotyper som er vanskelig å tilstrekkelig beskrive med tekst eller helt representerer med ett fotografisk bilde. Gjeldende moduser av vitenskapelig publisering, derimot, støtter innlevering av digital video media som supplerende materiale til å følge et manuskript. Her beskriver vi en enkel og allment tilgjengelig mikros teknikk for å anskaffe høykvalitets digital video av både Drosophila larver og voksne fenotyper fra en lateral perspektiv. Video av larver og voksen locomotion fra en side-visning er en fordel fordi det gir observasjon og analyse av subtile forskjeller og variasjoner i avvikende lokomotiv atferd. Vi har med hell brukt teknikken til å visualisere og kvantifisere aberrant krypende atferd i tredje stadium larver, i tillegg til voksne mutante fenotyper og atferd inkludert grooming.
Introduction
Den felles bananflue Drosophila melanogaster er en kraftig eksperimentelt modellsystem for å studere funksjonen av nervesystemet 1-3. Evolutionary bevaring av struktur og funksjon av nervesystemet med mennesker, så vel som enkel genetisk manipulasjon og et stort utvalg av genetiske verktøy gjør Drosophila premieren organisme å modellere menneskelige nevrodegenerative sykdommer fire. Genmutasjoner som forårsaker dysfunksjon i nervesystemet ofte resultere i levedyktige mutant larver og voksen Drosophila med nedsatt bevegelse. Fenotyper observert i nervesystemet defekte mutanter inkluderer redusert sats på locomotion, avvikende koordinering, og spastiske bevegelser hos voksne, samt underskudd i peristaltiske sammentrekning av kroppen veggen muskulaturen, og delvis lammelse av larver. Disse fenotyper har blitt utnyttet i utviklingen av high-throughput genetiske skjermer og locomotion analyser av mutant larver 5, 6 og voksen 7-10 Drosophila rettet mot kvantifisering av bevegelsesfunksjon og identifisere gener som er nødvendig for funksjon av nervesystemet. Mens disse tilnærmingene er svært nyttig for å kvantifisere larver og voksen lokomotiv atferd, klarer de ikke å formidle kvalitativ informasjon om hvert enkelt avvikende atferd. For eksempel, mens mutant tredje instar larver kan utvise endrede locomotion parametre i en atferdsanalyse, kan det være uklart om dette er et resultat av endringer i rytmiske peristaltiske sammentrekninger under gjennomgangen syklus, generell mangel på koordinering, eller delvis lammelse av bakre kroppen vegg muskulatur. Her beskriver vi en enkel og allment tilgjengelig mikros teknikk for å anskaffe høykvalitets digital video av Drosophila voksen og larve lokomotiv fenotyper fra en lateral perspektiv. Digital video kjøpt fra en lateral perspektiv tillater direkte observasjon og analyse av subtile forskjeller i Locomotive atferd fra en mer informativ side-visning orientering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stereo Microscope System
Merk: Selv om denne protokollen er lett tilpasses til nesten alle stereo mikroskop system koblet til et digitalt kamera med mulighet for å anskaffe video, er gitt nærmere detaljer om systemet brukes i vår lab (Table of Materials / utstyr).
- Tilegne seg digital video ved hjelp av en trinocular stereo mikroskop koblet til en kommersiell digitalkamera.
- For å par det kommersielle digitalkameraet til trinocular porten på stereo mikroskop, fjerne ½x C-mount av fotorØr porten på stereo mikroskop og erstatte den med en 1X C-mount.
- Montere et digitalkamera coupler (43 mm tråd) til 1X C-mount.
- Monter to step-down ringer, 58 mm til 48 mm, og 48 mm til 43 mm, til kameraet coupler å bygge bro forbindelsen fra digitalkameraet kopling til et objektiv adaptersett for det digitale kameraet.
- Monter det digitale kameraet til linseadapter kit.
- Erverve video med mikroskopet forstørrelse og optisk zoom på et digitalt kamera satt for en kombinert forstørrelse på ca 12X (30 bilder per sekund, 640 x 480 piksler). Merk: forstørrelse av stereo mikroskop må kompenseres i samsvar med den nylig rekonfigureres 1X C-mount av trinocular port.
2. Imaging Drosophila Tredje Instar Larver
- Tape en permanent markør til den svarte scenen plate av en stereo mikroskop koblet til et digitalt kamera slik at den siden av markør cap opptar omtrent ⅓ til ¼ av den vertikale synsfeltet observert i kameraet LCD-skjermen. Bruk markør topper som scenen for å utføre larve bildebehandling fordi de kommer i et utvalg av farger som kan brukes til å fargekode og differensiere genotyper av larver som avbildes.
- Avgrense synsfeltet observert i det digitale kameraet LCD-skjerm på overflaten av markeringen toppen med en fin spissmarkør.
- Velg en tredje instar larve til bilde. Kriteriene for utvelgelse av tredje instar larver var kroppslengde, veksten fra mat kilden under larvefasen av livssyklusen, tilstedeværelse av fremre og bakre spiracles, og strukturen av de underkjevens kroker i munnen anordningen 11. Sørg larven er ren ved å vaske den grundig i vann.
- Belyse permanent markør toppen scenen ovenfra med lys fra en fiberoptisk belysning. Juster vinkelen på innfallende lyset for å gi optimal belysning.
- Fokus mikroskopet på kanten av den permanent markør toppen. Begynn å anskaffe digital video.
- Plasser larve på siden av markeringen hetten omtrent 75 ° bort fra den vertikale akse, like utenfor synsfeltet, med det fremre av larven som vender mot synsfeltet (figur 1). Merk: Plassering av larven på siden av markøren cap lar kameraet registrere bevegelse av the larve fra en lateral perspektiv. Det hjelper til å holde larven fuktig med vann slik at de ikke faller ut på siden av den markør hetten. Varsomhet må utøves, men å ikke bruke for mye vann som store mengder vil følge larven som det kryper over hele feltet.
- Forsiktig rote og prod larven med en liten pensel til å tvinge den til å krype over synsfeltet. Vær tålmodig ettersom larvene sjelden samarbeide og ofte må bli returnert til utgangspunktet mange ganger før de krype rett over feltet.
- Record ca 10-15 min med uavbrutt digital video-opptakene og beskjære og fjerne all unødvendig opptakene etter oppkjøpet med digital programvare for videoredigering.
3. Imaging Adult Drosophila
- Plasser en enkelt voksen Drosophila i en disponibel 1.5 ml spektroskopiske polystyren kyvette.
Merk: CO 2 for anestesi av voksen Drosophila umiddelbart før en BEHAVioral analyse protokollen kan kompromittere resultater 12. Det anbefales at voksne Drosophila bli gitt en 24-timers periode for å komme seg fra CO 2 anestesi før du utfører i en adferdstest 13. - Plugg den ende av kyvetten med en liten bomullsdott. Sørg for at bomullsdott er pakket stramt nok til å okkupere store cap plass og begrenser fly til redusert volum rommet kyvetten.
- Plasser kyvetten på den hvite fasen plate av et stereomikroskop, og riktig innretning av den reduserte volumseksjonen av kyvetten med synsfeltet observert i det digitale kameraet LCD-skjerm.
- Belys kyvetten ovenfra med lys fra en fiberoptisk belysningssystem. Juster vinkelen på innfallende lyset for å gi optimal belysning.
- Fokus mikroskopet og begynne å anskaffe digital video.
- Record ca 30-45 min av uavbrutt digital video-opptakene og beskjære og fjerne all unødvendigopptakene etter oppkjøpet med digital programvare for videoredigering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har med hell benyttet denne teknikk for å erverve og kvantifisere larveatferds fenotype forbundet med tap av funksjon av stathmin-genet (figur 2) 14. Den stathmin genet koder for et mikrotubulus regulatorisk protein som skillevegger tubulindimerer fra bassenger av løselig tubulin, og binder mikrotubuli og fremmer deres demontering 15,16. Stathmin funksjon er nødvendig for å opprettholde integriteten av mikrotubuli i axoner av perifere nerver 14. Forstyrrelse av stathmin aktivitet i Drosophila tredje instar larver resulterer i en fenotype der de bakre kroppssegmentene vende oppover etter hvert peristaltisk bølge av muskel sammentrekning ved gjennomgangen syklus. Dette posterior lammelser eller 'tail-flip "fenotype er et kjennetegn på defekt aksonal transport. Vi kvantifisert pene og alvorlighetsgraden av bakre lammelse fenotype i tredje stadium larver av syv forskjellige <em> stathmin mutante genotype ved å måle vinkel over horisontalen halen ble hevet i løpet av gjennomgangen syklusen (tabell 1). Larvene ble bestemt til å vise en robust hale-flip hvis halen ble hevet større enn 40 ° over horisontal ved gjennomgang, en mild hale-flip hvis halen ble hevet mindre enn 40 ° over horisontal, og ingen hale-flip om larvene oppviste en vanlig kryp atferd.
Figur 1. Plassering av tredje instar larve på en permanent markør cap scenen for kjøp av digital video fra en lateral perspektiv ved hjelp av en stereo mikroskop. Side-visning av en grunnleggende stereo mikroskop system med digitalt kamera montert på trinocular port. Den innfelte forstørrelse viser orienteringen av en permanent markør tapet til objektbordet og posisjonen den tredje instar larve på markør cap for kjøp av digital video av avvikende oppførsel fra en lateral perspektiv. I bildet de tre dimensjoner av plass er definert; x-aksen går langs den faste markør og er parallell med objektbord, er y-akse normalt på x-aksen, og parallelt til objektbord, og z-aksen står vertikalt fra merke hetten til objektivlinsen og vinkelrett på objektbord. En tredje instar larve er plassert på den siden av markeringen hetten omtrent 75 ° bort fra den vertikale z-aksen langs y-aksen, like utenfor synsfeltet til det digitale kameraet, med det fremre av larven som vender mot banen syn. Plassering av larve på siden av markeringen hetten tillater det digitale kamera av stereomikroskop for å registrere bevegelsen av larve på tvers av feltet fra en lateral perspektiv.
Ftp_upload / 51981 / 51981fig2highres.jpg "/>
Figur 2. Bilder av representative resultater. Representative bilder fra digitale video av Drosophila larve (A, B) og voksne (C, D) fenotyper og atferd kjøpt fra en lateral perspektiv. Hvert bilde er en video stillbilde hentet fra oppkjøpte digitale videofiler. (A) villtype tredje instar larve utstillings en flat kroppsholdning når krypende langs et substrat. (B) Tredje stadium larve homozygot for en mutasjon i stathmin genet utstillings en avvikende kryp tail-flip atferd, tegn på en lammelse av bakre muskulatur. (C) Vingene av villtype voksen Drosophila holdes flatt mot kroppen som fly går. (D) Voksen Drosophila, homozygot for en ukjent mutasjon, holder vingene på vinkler ca 45 ° over det normale. Både avvikende larve og voksen fenotypes beskrives er best observert og kommunisert med digital video kjøpt fra en lateral side-view perspektiv. I panel A og B skalaen bar = 1 mm. Dette tallet er blitt endret fra Duncan et al. 2013.
| Alvorlighetsgrad av bakre Lammelse Fenotype | ||||
| Genotype | n | No Tail-Flip | Mild Tail-Flip (<40 °) | Robust Tail-Flip (> 40 °) |
| villtype | 150 | 100,0% (N = 150) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| Stai B200 / + | 130 | 100,0% (N = 130) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| Stai rdtp / + | 140 | 100,0% (N = 140) | 0,0% (N =) | 0,0% (N = 0) |
| Df (2L) Exel6015 / + | 120 | 100,0% (N = 120) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| Stai B200 | 120 | 23,3% (N = 28) | 23,3% (N = 28) | 53,4% (N = 64) |
| Stai B200 / Df (2L) Exel6015 | 101 | 10,9% (N = 11) | 21,8% (N = 22) | 67,3% (N = 68) |
| Stai rdtp | 125 | 16,0% (N = 20) | 32,0% (N = 40) | 52,0% (N = 65) |
| Stai rdtp / Df (2L) Exel6015 | 140 | 7,7% (N = 11) | 23,7% (N = 33) | 68,6% (N = 96) |
Tabell 1. pene og alvorlighetsgraden av denposterior lammelse fenotype observert i stathmin (Stai) mutant Drosophila tredje stadium larver. Den pene og alvorlighetsgraden av bakre lammelse fenotype av stathmin mutant Drosophila tredje instar larver ble scoret og kvantifisert ved å kjøpe digital video av oppførselen fra en lateral perspektiv og måle vinkelen at halen ble hevet over horisontalplanet kryp under gjennomgangen syklus. Larvene ble scoret som å ha en robust hale-flip hvis halen ble hevet større enn 40 ° over horisontalplanet, og en mild hale-flip hvis halen ble hevet mindre enn 40 ° over horisontalplanet. Larver viser en normal kryp atferd ble scoret som å ha ingen hale-flip. Den krypende oppførsel av minst ett hundre larver ble analysert for hver genotype testet. Denne tabellen har blitt forandret fra Duncan et al. 2.013.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila melanogaster 's styrke som et modellsystem for å studere nervesystemet fungerer stammer i stor grad fra konvergens av de kraftige genetiske verktøy tilgjengelig og det brede spekter av robuste atferdsanalyser utviklet. Her presenterer vi en enkel og allment tilgjengelig mikros teknikk for å anskaffe høykvalitets digital video av Drosophila voksen og larve lokomotiv fenotyper fra en lateral perspektiv. Vi har med hell brukt denne tilnærmingen til å karakterisere og kvantifisere graden av posterior lammelse 'tail-flip "fenotyper observert i nevrologiske tredje INSTAR larve mutanter ved å måle maksimal vinkel at halen ble reist opp fra den horisontale aksen under gjennomgangen syklus 14. Fordelen med den tilnærmingen presenteres her er at videoen er kjøpt fra en lateral perspektiv, slik at direkte observasjon og analyse av avvikende lokomotiv atferd, ofte observert i nevrologisk larve og enDult mutanter, fra en mer informativ 'side-view' orientering. Følgelig er visualisering av peristaltiske muskelsammentrekninger i larve Drosophila, og avvikende ganglag fenotyper i voksen Drosophila lettere observert og analysert. En begrensning ved denne teknikken er at det ikke er en high-throughput tilnærming. I tillegg kan spesifikke Drosophila larver og voksne oppførsel bare bli analysert for korte lengder av tid på grunn av restriktivt sporingsområdet gis av synsfeltet for den stereomikroskop. Dette kan være særlig problematisk når anskaffe video av voksne Drosophila oppførsel, som volumet av kyvetten kammeret er vesentlig større enn det synsfeltet til den stereomikroskop. Vi har løst dette problem ved hjelp av bomull og papp innsatser for å minimere kyvetten kammervolumet og begrense bevegelsen av den voksne fly til et mellomrom som finnes i synsfeltet. Mens de fleste av våre imaldring har fokusert på nevrologiske larve mutanter, har vi også brukt teknikken til å observere voksne mutante fenotyper og atferd, herunder stell, noe som tyder på at teknikken kan lett utvides til å omfatte analyse av andre Drosophila atferd som frieri, copulation, og aggresjon. Det er mulig at denne teknikken kan være nyttig for avbilding av andre Drosophilidae familiemedlemmer, så vel som andre insekter av tilsvarende størrelse. I tillegg vil mindre modifikasjon av den teknikk som tillater avbildning av større insektarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Alexandra Opie for teknisk bistand og støtte, James Barton for å gi video fortellerstemme, og Ramona Flatz og Joellen Sweeney for å vises i den medfølgende video. Dette arbeidet ble støttet av MJ Murdock Charitable Trust (Grant nr 2012205 til JED).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
- Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. Drosophila neurobiology: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Frank, C. A., et al. New approaches for studying synaptic development, function, and plasticity using Drosophila as a model system. J Neurosci. 33, 17560-17568 (2013).
- Mudher, A., Newman, T. Drosophila : a toolbox for the study of neurodegenerative disease. , Taylor & Francis Group. (2008).
- Bilen, J., Bonini, N. M. Drosophila as a model for human neurodegenerative disease. Annu Rev Genet. 39, 153-171 (2005).
- Jakubowski, B. R., Longoria, R. A., Shubeita, G. T. A high throughput and sensitive method correlates neuronal disorder genotypes to Drosophila larvae crawling phenotypes. Fly (Austin). 6, 303-308 (2012).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants). Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 16053-16058 (2003).
- Jahn, T. R., et al. Detection of early locomotor abnormalities in a Drosophila model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 197, 186-189 (2011).
- Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PLoS ONE. 7, e37250 (2012).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (24), (2009).
- Colomb, J., Reiter, L., Blaszkiewicz, J., Wessnitzer, J., Brembs, B. Open source tracking and analysis of adult Drosophila locomotion in Buridan's paradigm with and without visual targets. PLoS ONE. 7, e42247 (2012).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. (1965).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics.. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Duncan, J. E., Lytle, N. K., Zuniga, A., Goldstein, L. S. The Microtubule Regulatory Protein Stathmin Is Required to Maintain the Integrity of Axonal Microtubules in Drosophila. 8, e683244 (2013).
- Belmont, L. D., Mitchison, T. J. Identification of a protein that interacts with tubulin dimers and increases the catastrophe rate of microtubules. Cell. 84, 623-631 (1996).
- Cassimeris, L.
